Desenvolvimento de uma estratégia de fusão gênica visando à localização de proteínas em plantas

Uma significativa quantidade de proteínas vegetais apresenta-se compartimentalizada nas diversas estruturas celulares. A sua localização pode conduzir à elucidação do funcionamento dos processos biossintéticos e catabólicos e auxiliar na identificação de genes importantes. A fim de localizar produtos gênicos relacionados à resistência, foi utilizada a fusão de cDNAs de arroz (Oryza sativa L.) ao gene da proteína verde fluorescente (GFP). Os cDNAs foram obtidos a partir de uma biblioteca supressiva subtrativa de genes de arroz durante uma interação incompatível com o fungo Magnaporthe grisea. Estes cDNAs foram fusionados a uma versão intensificada de gfp e usados para transformar 500 plantas de Arabidopsis thaliana. Outras 50 plantas foram transformadas com o mesmo vetor, porém sem a fusão (vetor vazio). Foram obtidas aproximadamente 25.500 sementes oriundas das plantas transformadas com as fusões EGFP::cDNAs e 35.000 sementes das transformadas com o vetor vazio, produzindo, respectivamente, 750 e 800 plantas tolerantes ao herbicida glufosinato de amônio. Após a seleção, segmentos foliares das plantas foram analisados por microscopia de fluorescência, visando o estabelecimento do padrão de localização de EGFP. Foram observadas 18 plantas transformadas com a fusão EGFP::cDNAs e 16 plantas transformadas com o vetor vazio apresentando expressão detectável de GFP. Uma planta transformada com uma fusão EGFP::cDNA apresentou localização diferenciada da fluorescência, notadamente nas células guarda dos estômatos e nos tricomas. Após seqüenciamento do cDNA fusionado, foi verificado que esta planta apresentava uma inserção similar a uma seqüência codificante de uma quinase, uma classe de enzimas envolvidas na transdução de sinais em resposta à infecção por patógenos.

Desenvolvimento de técnica para avaliação da atividade das isoenzimas 5-alfa-redutase I e II em tecido prostático de pacientes do Hospital de Clínicas de Porto Alegre

Resumo não disponível

Efeitos biológicos dos campos eletromagnéticos de ultra alta freqüência

Vários estudos têm sugerido que seres vivos podem ser suscetíveis aos campos eletromagnéticos (CEMs). Os supostos efeitos dos Campos Eletromagnéticos de Ultra Alta Freqüência (CEMUAFs) em sistemas biológicos são pouco conhecidos. Os relatos de um possível efeito biológico dependente da alteração de estados de oxidação entre pares de radicais sugerem um mecanismo de transdução orgânica para os campos. Outros trabalhos obtiveram alterações na sinalização celular e defesas antioxidantes após a exposição CEMUAFs e, tais alterações, poderiam ser um agente causador de doenças como, por exemplo, a leucemia infantil, esta já correlacionada com a exposição aos CEMs. Desta forma o objetivo deste estudo foi investigar se o CEMUAF (834 MHz) poderia interferir com o balanço oxidativo de planárias e ratos, assim como, estudar a participação de enzimas responsáveis pela hidrólise de nucleotídeos, enzimas estas reconhecidas por serem influenciadas pela ação de radicais livres. As planárias foram expostas por 1, 3 e 6 dias (8 h/dia). Após a exposição foi feito um homogenato de todo o corpo de cada animal. Foi encontrado um aumento na atividade da superóxido desmutase (SOD) e um decréscimo na atividade da catalase (CAT) e na defesa antioxidante não-enzimática (TRAP) após 6 dias de exposição. Adicionalmente, houve um aumento na freqüência de micronúcleos (MN) após 3 e 6 dias de exposição. Não houve alteração nos parâmetros de dano oxidativo a lipídios (TBARS) e proteínas (Carbonil) em nenhum dos tempos de exposição. Estes resultados sugerem um aumento nos níveis de radicais livres e de danos aos ácidos nucléicos. Estudos posteriores deverão determinar se estes efeitos apresentam ou não associações do tipo causa e efeito. Foram utilizados três modelos com ratos. No primeiro modelo, animais com idades de 30, 80 e 210 dias foram expostos por 6 dias (7:30 h/dia). Não foram encontradas mudanças nos parâmetros de TRAP, TBARS e Carbonil em nenhuma das idades expostas ao CEMUAF. Estes resultados sugerem que os tempos de exposição utilizados não foram suficientes para causar alguma mudança perceptível nos parâmetros de estresse oxidativo. No segundo modelo, utilizou-se o sangue e fígado dos neonatos expostos ao CEMUAF ainda no útero de suas mães durante todo o seu desenvolvimento embrionário (8:30 h/dia). Não foram encontradas mudanças em nenhum parâmetro oxidativo. Foi encontrado um aumento na freqüência de MN nas hemácias, sugerindo um efeito genotóxico da irradiação do celular afetando o tecido hematopoiético dos fetos. No terceiro modelo, utilizou-se o sangue de ratos adultos (180 dias) expostos por 12 dias (8:30 h/dia). Os níveis da hidrólise de ATP e ADP estavam aumentados no grupo irradiado. Nenhum efeito foi observado nas atividades da SOD e da CAT, sugerindo nenhuma participação de radicais livres nestes resultados. Ainda são necessários muitíssimos estudos para determinar quais os mecanismos transdutores dos CEMUAFs em sistemas biológicos e de que forma esta interação ocorre, porém estes resultados sugerem: (a) um papel para os radicais livres sobre, pelo menos, alguns dos efeitos atribuídos aos CEMUAFs e (b) que os organismos em fase de formação podem ser mais sensíveis aos campos. Por fim, sugerimos que sistemas biológicos podem sofrer a ação da irradiação com uma quantidade de energia muito menor do que a esperada para promover algum efeito no metabolismo.

Toxicidade induzida pelos peptídeos AB42 e AB25-35 em modelo de cultura organotípica de hipocampo de ratos

O crescimento da expectativa de vida média da população mundial tem sido acompanhado do aumento na prevalência de doenças neurodegenerativas, como a doença de Parkinson, isquemia cerebral e, especialmente, a doença de Alzheimer. A doença de Alzheimer (DA) caracteriza-se por um crescente declínio na função mental e memória do paciente. Estes sintomas são explicados por uma profunda perda neuronal e pela presença de alterações estruturais no tecido cerebral: as placas senis, extracelulares e os emaranhados neurofibrilares, intracelulares. O passo que desencadeia a neurodegeneração na DA é ainda objeto de estudo, mas a hipótese mais aceita atualmente é a de que a secreção anormal do peptídeo β amilóide (Aβ), principal componente das placas senis, dê início ao processo. O presente trabalho teve como objetivos investigar a toxicidade induzida pelo peptídeo Aβ1-42 e seu fragmento, o peptídeo Aβ25-35 em culturas organotípicas de hipocampo de ratos. Na primeira parte do trabalho, investigamos a toxicidade induzida pela exposição de culturas organotípicas de hipocampo de ratos a 10 ou 20 μM do peptídeo Aβ1-42, por 24 ou 72 h. Além disso, investigamos o envolvimento das proteínas iNOS e GSK-3β no mecanismo de morte celular induzida pelo peptídeo Aβ1-42. Na segunda parte do trabalho, investigamos a toxicidade induzida pelo fragmento Aβ25-35 na concentração de 25 μM, nos tempos de 1, 3, 6, 12, 24 ou 48 h de exposição às culturas organotípicas, e seu efeito sobre as proteínas Akt, GSK-3β e PTEN. A morte celular foi quantificada pela incorporação do iodeto de propídeo, corante marcador excluído de células sadias, e as proteínas foram quantificadas por imunodetecção com o uso de anticorpos específicos. Nossos resultados mostraram que o peptídeo Aβ1-42 apresentou toxicidade nas concentrações de 10 e 20 μM, induzindo a uma considerável morte celular após 72 h de exposição. A análise do imunoconteúdo da proteína iNOS mostrou um aumento significativo em relação ao controle, após 72 h de exposição ao peptídeo e na concentração de 20 μM. Os resultados obtidos na segunda parte do trabalho mostraram uma morte celular significativa apenas após 48 h de exposição ao peptídeo Aβ25- 35 na concentração de 25 μM. O tratamento com peptídeo Aβ25-35 levou ao aumento no estado de fosforilação da proteína Akt após 6 h de exposição e também da proteína GSK-3β, um potencial substrato da Akt. Após 12 h de exposição ao peptídeo, observamos uma diminuição de ambas as proteínas (Akt e GSK-3β). Porém, após 24 h de exposição ao peptídeo, a proteína Akt continua menos fosforilada enquanto que a proteína GSK-3β apresenta um novo pico de fosforilação. O imunoconteúdo da proteína fosfatase PTEN apresentou um aumento significativo em 24 h e 48 h. Os resultados do presente estudo mostraram que o tratamento das culturas organotípicas de hipocampo de ratos com o peptídeo Aβ1-42 como com o fragmento Aβ25-35 apresentou toxicidade após um período de aproximadamente 48 h de tratamento, e mostrou ser um bom modelo para o estudo de sua toxicidade. Com relação ao mecanismo investigado, os dados sugerem que a proteína iNOS pode estar envolvida na toxicidade induzida pelo peptídeo Aβ1-42. Além disso, sugerem que o fragmento Aβ25-35 possa exercer sua toxicidade através da inibição da via de sobrevivência celular PI3-K, por diminuir a fosforilação/ativação da proteína Akt, parecendo envolver a proteína fosfatase PTEN, principal regulador negativo da via PI3-K/Akt.