Efeitos de intervenções no ambiente neonatal sobre a relação mãe-filhote e o comportamento dos ratos na idade adulta

O período neonatal corresponde ao período onde as primeiras ligações sociais do animal são formadas e o organismo está muito sensível aos efeitos de estímulos ambientais. Nas últimas décadas, tem havido um grande interesse em compreender quais fatores do ambiente neonatal e de que forma estes fatores podem exercer influência na fisiologia e no comportamento de animais que tiveram qualquer tipo de intervenção neste período. Quando adultos, os animais que sofreram intervenção neonatal apresentam uma menor secreção de corticosterona e um retorno mais rápido a concentração basal, quando submetidos a estímulos estressores. Além de alterar o eixo hipotálmo–hipófise-adrenal, estudos demonstram que ratas manipuladas apresentam ciclos estrais anovulatórios e há uma redução do comportamento sexual tanto em machos quanto em fêmeas, alterando assim o eixo hipotálamo-hipófise-gônada. A intervenção neonatal também altera a relação mãe-filhote. Sendo assim, o presente trabalho teve por objetivo analisar se diferentes tipos de intervenção ambiental (manipulação, separação e estimulação com pincel) promovem alguma alteração na relação mãe-filhote e no comportamento dos animais adultos. Ao parirem (Dia 0), as ratas com suas ninhadas foram divididas em quatro grupos: não manipulado (controle), que não foram tocados durante os 10 primeiros dias após o nascimento; manipulados, que foram manipulados gentilmente pelo experimentador durante 10 minutos por dia, nos 10 primeiros dias de vida; separados, que foram separados da mãe durante 10 minutos por dia, nos 10 primeiros dias de vida; e estimulação tátil com pincel, que foram separados da mãe durante 10 minutos por dia, nos 10 primeiros dias de vida, e durante este tempo foram estimulados com o auxílio de um pincel No experimento 1 foi realizado o registro do comportamento maternal, após o procedimento experimental, no 1º, 5º e 10º dia pós-parto. Neste experimento, foram analisados o comportamento da mãe de lamber os filhotes e de amamentação com dorso arqueado. No experimento 2 os ratos machos com aproximadamente 90 dias de idade e que sofreram intervenção neonatal, passaram pela análise comportamental. Foi analisada a exploração a ambientes novos e medo no campo aberto. No experimento 3, foi analisada a resposta da liberação de prolactina após estresse por contenção, também nos ratos machos com cerca de 90 dias de idade que sofreram intervenção neonatal. Os resultados mostram que ratas, cujos filhotes foram manipulados no período neonatal apresentam um aumento na duração do comportamento de lamber em relação aos grupos não manipulado, separado e estimulação tátil com pincel. No campo aberto ocorreu uma redução na latência de entradas no centro do campo aberto, bem como um aumento no tempo de permanência no centro, em ratos que foram separados e manipulados em relação aos demais. Nossos resultados mostram também que todos os grupos apresentaram um aumento na resposta da prolactina plasmática quando submetidos ao estresse após 15 minutos de contenção.

Avaliação radiográfica e histológica do efeito de osso alógeno liofilizado enxertado em área dentada em crescimento : estudo experimental em ratos

Proposição: avaliar radiograficamente e histologicamente o comportamento do incisivo inferior de rato frente à realização de uma solução de continuidade em sua porção radicular mediana quanto ao seu trajeto de erupção e vitalidade pulpar; a capacidade do espaço alveolar como leito ósseo para estudo de enxertias; o comportamento do enxerto ósseo liofilizado quanto à integração e cicatrização em relação ao processo físico de compressão provocado por uma força dinâmica resultante da erupção dentária. Materiais e Métodos: estudo experimental in vivo, com amostragem selecionada de forma aleatória, randomizada, com um grupo experimento e outro controle. Constou de 21 ratos, da espécie Rattus novergicus albinus, cepa Wistar, machos, subdivididos em três grupos, correspondendo aos tempos de sete, 14 e 45 dias. Em cada grupo cinco animais foram experimento e dois animais foram controle. Em cada animal foi removido, cirurgicamente, o segmento medial do incisivo inferior direito. Entretanto, nos animais experimento foram realizados enxertos de osso alógeno liofilizado nos 2,0mm distais do total da cavidade alveolar cirurgicamente obtida. Resultados: aos sete dias observou-se a continuada erupção do segmento proximal e início da atresia do conduto radicular, em ambos os grupos avaliados e início da integração do enxerto ósseo no grupo experimento. Aos 14 dias seguem as mesmas observações descritas aos sete dias com progressão da incorporação do enxerto ósseo e atresia radicular. Aos 45 dias o segmento dentário distal ultrapassou a área do enxerto sendo desviado por este para vestibular enquanto no grupo controle o elemento dentário segue o seu trajeto eruptivo obedecendo à anatomia do corpo mandibular. A atresia pulpar é observada quase na totalidade do conduto radicular. . Conclusão: Após a remoção do segmento medial da raiz do incisivo inferior do rato concluímos que: o incisivo inferior do rato, mesmo submetido à odontossecção em seu segmento dentário proximal segue um processo de crescimento e erupção; o tecido pulpar, contido no segmento proximal mantém sua vitalidade, reagindo na forma de cicatrização dentinária compatível com o dente humano; o enxerto ósseo alógeno liofilizado evolui favoravelmente no processo de incorporação a partir de um leito receptor criado no alvéolo dentário e a dinâmica da erupção dentária pode criar força em padrão fisiológico para testar a resistência e estabilidade do enxerto ósseo cicatrizado.

Efeitos da desidroepiandrosterona (DHEA) sobre o comportamento tipo depressivo de ratos machos e fêmeas

A depressão é uma desordem de importância relevante, sendo que as mulheres apresentam o dobro da incidência desta patologia em relação aos homens. No entanto, os trabalhos realizados em modelos animais não conseguem reproduzir estas condições consistentemente. DHEA é um neuroesteróide que está relacionado à depressão. Suas concentrações estão alteradas em pacientes deprimidos e já tem sido usada na clínica, produzindo, no entanto, resultados contraditórios. O objetivo deste trabalho foi investigar os efeitos da administração de desidroepiandrosterona (DHEA) sobre o comportamento tipo depressivo e níveis hormonais de ratos, machos e fêmeas em diferentes fases do ciclo estral, submetidos ao teste do nado forçado, um modelo animal de depressão. Para isto, foram utilizados ratos Wistar, adultos, machos e fêmeas em diestro II e em proestro, 8 por grupo. Receberam injeções intraperitoneais de DHEA: 0; 2; 10 e 50 mg/kg, nos tempos de 24, 5 e 1 h antes do teste do nado forçado. No primeiro dia os animais foram treinados por 15 minutos em aquários contendo água a 25o 1 e 27 cm de profundidade. Após 24 h, foram recolocados no aquário e seus comportamentos gravados por 5 minutos para análise posterior. Os comportamentos foram analisados detalhadamente: head-shake, mergulho, imobilidade (flutuar + congelar) e mobilidade (nadar + escalar). Trinta minutos após o nado, os animais foram mortos e o sangue troncular coletado, para posterior dosagem de DHEA e corticosterona séricas. Um experimento para complementar a curva dose-resposta foi realizado, com a dose de 1 mg/kg, com machos, porém, experimento crônico, onde, no dia seguinte ao treino, os animais receberam a sem resultados significativos nos comportamentos. Foi realizado, então, primeira injeção de DHEA, na dose de 2 mg/kg, com intervalos de 24 horas, durante dois ciclos estrais completos das fêmeas. No dia seguinte à última injeção, os animais foram submetidos ao teste do nado, com duração de 5 minutos e seus comportamentos gravados e analisados. O sangue troncular foi coletado trinta minutos após o nado, para as dosagens de DHEA e corticosterona séricas. Para fins de comparação, DHEA e corticosterona sériica de ratos machos, fêmeas em proestro e em diestro II não submetidos ao nado, foram dosados por radioimunoensaio. No experimento agudo, DHEA, na dose de 2 mg/kg aumentou o tempo de congelar para o grupo proestro. As concentrações séricas de DHEA e de corticosterona aumentaram significativamente. As fêmeas responderam com aumento destes hormônios significativamente maior dos que os machos. No experimento crônico, machos e fêmeas apresentaram diferenças em comportamentos no teste do nado forçado, dependendo de estímulos estressores continuados, evidenciado pelo maior tempo de escalar das fêmeas controle em diestro II. Tratamento com DHEA aumentou o tempo de escalar e a imobilidade das fêmeas no diestro II. As concentrações de DHEA e de corticosterona não aumentaram em relação ao basal, e as diferenças de sexo desapareceram, indicando uma correlacão das respostas de corticosterona e DHEA com eventos estressores interagindo com os hormônios sexuais e o tempo de estresse experimentado. A maior resposta hormonal das fêmeas no experimento agudo parece ter impedido a resposta comportamental no nado. Após manipulação crônica, houve adaptação desta resposta e o efeito depressivo de DHEA apareceu. Estes resultados são importantes especialmente quando consideradas estratégias para o tratamento da depressão e doenças relacionadas ao estresse.

Caracterização da morte celular em neurônios da região CA1 do hipocampo de ratos submetidos à isquemia global transitória e reperfusão

A caracterização da morte neuronal após injúria neuronal aguda é um assunto muito discutido e que está sob constante investigação. O presente estudo tem por objetivo caracterizar a morte celular na camada de células piramidais da região CA1 do hipocampo após 10 minutos de isquemia e períodos precoces de reperfusão, utilizando a microscopia eletrônica da transmissão. O modelo animal empregado para produzir a isquemia prosencefálica foi o de oclusão dos 4 vasos com modificações (Netto et al, 1993). Após 3, 6, 12 e 24 h de reperfusão, os animais eram anestesiados e perfundidos transcardiacamente. Os encéfalos eram removidos e seccionados. Os cortes contendo o hipocampo eram desidratados, incluídos em resina, seccionados, observados no microscópio eletrônico de transmissão e eletromicrografados. As células piramidais da região CA1 do hipocampo de todos os grupos submetidos à isquemia apresentavam alterações morfológicas. Em tempos precoces de reperfusão as alterações eram menos expressivas quando comparadas a maiores tempos de reperfusão, e envolviam sinais de necrose apoptótica e necrose oncótica. Com 12 h de reperfusão, as células apresentavam uma aparente recuperação. Decorridas 24 h do insulto isquêmico, o dano neuronal era mais severo e incluía sinais de necrose oncótica, assim como, corpos apoptóticos, os quais caracterizam a morte celular por necrose apoptótica É possível que as células no período pós-isquemia passem por um processo conhecido como um continnum entre a apoptose e a necrose, ou, um processo denominado parapoptose. A aparente recuperação ocorrida com 12 h de reperfusão pode dever-se à influência das células gliais, em especial das células astrocitárias. Dessa forma, o presente estudo fornece evidências que a morte celular após evento isquêmico global transitório, em ratos Wistar adultos envolve características de necrose apoptótica e necrose oncótica.

Efeitos da hipertensão renovascular sobre a função reprodutiva de ratos machos Wistar

O presente estudo investiga a função reprodutiva de ratos machos com hipertensão induzida pelo modelo dois-rins, um-clipe (2R/1C), e de ratos 2R/1C normotensos devido ao tratamento com o bloqueador de canais de Ca2+ nifedipina. O aumento da AngII periférica/central é característico do modelo 2R/1C. Parâmetros de comportamento sexual (latência e freqüência de monta com intromissão, latência de ejaculação e duração do intervalo pós-ejaculatório) e de espermatogênese (quociente espermático e trânsito epidimário), e hormônios plasmáticos (LH, FSH, PRL e testosterona) foram utilizados para a avaliação da função reprodutiva dos animais. Noventa e nove ratos Wistar foram utilizados neste estudo, divididos em seis grupos: 2R/1C- ratos com hipertensão induzida pelo modelo 2R/1C; FICT- ratos com cirurgia fictícia; 2R/1C+V- ratos 2R/1C que usaram veículo; 2R/1C+N- ratos 2R/1C que foram tratados com nifedipina; FICT+V- ratos FICT que usaram veículo; FICT+N- ratos FICT que foram tratados com nifedipina. Os animais permaneceram “clipados” na artéria renal durante vinte e oito dias. O tratamento oral com nifedipina (10mg/kg/rato) foi iniciado no primeiro dia após o “clipamento” da artéria renal. O comportamento sexual foi registrado por vídeo e a pressão arterial média (PAM) foi aferida por cateter inserido na artéria femoral. Após o registro de PAM, os animais foram mortos para coleta de sangue e retirada das gônadas. Os resultados mostraram que o grupo 2R/1C exibe elevada PAM, aumento da latência de monta com intromissão e de ejaculação, aumento da duração do intervalo pós-ejaculatório, redução do número de animais que ejaculam e que apresentam período pós-ejaculatório, aumento da PRL com redução da testosterona plasmática, e redução do quociente espermático com aumento do trânsito epidimário, quando comparado ao grupo FICT. Entretanto, animais 2R/1C+N apresentaram valores de comportamento sexual e dos hormônios plasmáticos semelhantes aos animais FICT+V ou FICT+N, diferindo significativamente apenas dos ratos 2R/1C+V. Animais 2R/1C+V e 2R/1C+N mantiveram o prejuízo da espermatogênese. Os dados sugerem uma associação entre hipertensão induzida pelo modelo 2R/1C e redução da função reprodutiva; no entanto, o comportamento sexual e a PRL plasmática, ambos normais, foram coincidentes com uma PAM normal. Os efeitos da nifedipina sobre o impedimento em diminuir o comportamento sexual e em aumentar a PRL plasmática, e sobre a manutenção do prejuízo na espermatogênese acontece somente em animais “clipados” na artéria renal. A AngII elevada, característica do modelo 2R/1C, parece ter ação decisiva sobre o prejuízo na espermatogênese, o mesmo não acontecendo quanto à redução do comportamento sexual e ao aumento da PRL plasmática.

Efeitos in vivo e in vitro do ácido glutárico sobre parâmetros bioquímicos do metabolismo energético em cérebro médio, músculo esquelético e músculo cardíaco de ratos jovens

O ácido glutárico (AG) é o principal metabólito acumulado nos tecidos e fluidos corporais de pacientes afetados por acidemia glutárica tipo I (AG I), um erro inato do metabolismo da via catabólica dos aminoácidos lisina, hidroxilisina e triptofano causado pela deficiência severa da atividade da enzima glutaril-CoA desidrogenase. Clinicamente, os pacientes apresentam macrocefalia ao nascimento e uma hipomielinização ou desmielinização progressiva do córtex cerebral. Crises de descompensação metabólica com encefalopatia aguda ocorrem nestes pacientes principalmente entre 3 e 36 meses de vida, levando a uma marcada degeneração estriatal, que é a principal manifestação neurológica da doença. Depois de sofrer essas crises, os pacientes apresentam distonia e discinesia que progridem rapidamente e os incapacita para as atividades normais. Apesar dos sintomas neurológicos severos e achados neuropatológicos com atrofia cerebral, os mecanismos que levam ao dano cerebral na AG I são pouco conhecidos. O objetivo inicial do presente trabalho foi desenvolver um modelo animal por indução química de AG I através da injeção subcutânea do AG em ratos Wistar de forma que os níveis cerebrais deste composto atinjam concentrações similares aos encontrados em pacientes (~0,5 mM) para estudos neuroquímicos e comportamentais. Observamos que o AG atingiu concentrações no cérebro aproximadamente 10 vezes menores do que no plasma e 5 vezes menores do que nos músculos cardíaco e esquelético. O próximo passo foi investigar o efeito desse modelo sobre parâmetros do metabolismo energético no cérebro médio, bem como nos tecidos periféricos (músculo cardíaco e músculo esquelético) de ratos de 21 dias de vida Verificamos que a produção de CO2 a partir de glicose não foi alterada no cérebro médio dos ratos, bem como a atividade da creatina quinase no cérebro médio, músculo cardíaco e músculo esquelético. A atividade do complexo I-III da cadeia respiratória estava inibida em cérebro médio de ratos (25%), enquanto no músculo esquelético estavam inibidas as atividades dos complexos I-III (25%) e II-III (15%) e no músculo cardíaco não foi encontrada nenhuma inibição dos complexos da cadeia respiratória. Em seguida, testamos o efeito in vitro do AG sobre os mesmos parâmetros do metabolismo energético e observamos uma inibição das atividades do complexo I-III (20%) e da sucinato desidrogenase (30%) no cérebro médio na concentração de 5 mM do ácido. A produção de CO2, a partir de glicose e acetato, e a atividade da creatina quinase não foram alteradas pelo AG no cérebro médio dos animais. Assim, concluímos que o AG interfere no metabolismo energético celular, o que poderia explicar, ao menos em parte, a fisiopatogenia da AG I.

Efeitos dos ácidos propiônico e metilmalônico sobre o imunoconteúdo da subunidade de alto peso molecular dos neurofilamentos em fatias de córtex cerebral de ratos

As acidemias orgânicas são desordens metabólicas caracterizadas, bioquimicamente, pelo acúmulo de um ou mais ácidos orgânicos e, clinicamente, por disfunções neurológicas graves. Os ácidos propiônico (PA) e metilmalônico (MMA) são metabólitos presentes, em altas concentrações, nos tecidos e fluídos biológicos de pacientes afetados pelas acidemias propiônica e metilmalônica, respectivamente. Os neurofilamentos (NFs) são proteínas do citoesqueleto neuronal formados pela polimerização de três subunidades, denominadas: NF de alto peso molecular (NFH), NF de médio peso molecular (NF-M) e NF de baixo peso molecular (NF-L), com pesos moleculares aparentes de 200, 150 e 68 kDa, respectivamente. Essas proteínas são amplamente fosforiladas, sendo que seu nível de fosforilação está relacionado com a polimerização dos NFs e com a regulação das interações entre os constituintes do citoesqueleto. Neste trabalho fizemos um estudo ontogenético dos efeitos in vitro do PA e do MMA 2,5 mM sobre a imunorreatividade da subunidade NF-H em fatias de córtex cerebral de ratos de 9, 12, 17, 21 e 60 dias de idade. Para tanto utilizamos uma abordagem metodológica baseada na imunodetecção da NF-H com dois anticorpos diferentes: o anticorpo monoclonal anti NF-200 clone NE14 que se liga somente a epítopos fosforilados da NF-H e, portanto, reconhece a NF-H fosforilada; e o anticorpo monoclonal anti NF-200 clone N52 que reconhece a NF-H total, independentemente do nível de fosforilação. Nossos resultados mostraram que os metabólitos induzem alterações na imunorreatividade da NF-H presente na fração citoesquelética de maneira dependente do estágio de desenvolvimento do animal Considerando o conjunto de dados obtidos com os anticorpos NE14 e N52 na fração citoesquelética, podemos dizer que o tratamento das fatias de córtex cerebral de ratos de 9 dias aumentou o nível de fosforilação sem alterar o imunoconteúdo total; em ratos de 12 e 17 dias de vida levou a um acúmulo da subunidade NF-H na fração citoesquelética e que esta proteína está na forma fosforilada; e finalmente, em ratos de 21 e 60 dias de vida os metabólitos não alteraram os parâmetros estudados. Mostramos, também, que o acúmulo da NF-H provocado pelos metabólitos em ratos de 12 e 17 dias de vida não decorreu de um aumento na síntese da proteína, mas, provalvelmente devido a um desequilíbrio na relação NF-H solúvel/NF-H polimerizada, que favoreceu a forma polimerizada. Finalmente, mostramos um possível envolvimento de mecanismos de neurotransmissão GABAérgica e glutamatérgica para os efeitos observados em ratos de 12 e 17 dias de idade, respectivamente. Considerando que a fosforilação é um mecanismo importante para a regulação da dinâmica de polimerização dos NFs e das interações com outros componentes do citoesqueleto, sugerimos que uma desorganização na sua homeostase possa causar uma neurodegeneração, que é característica dos pacientes portadores das acidemias propiônica e metilmalônica.

Estudo sobre a densidade de espinhos dentríticos de neurônios da amígdala medial póstero-dorsal de ratos em diferentes condições experimentais

O núcleo medial da amígdala (AMe), cujo um de seus componentes tem localização póstero-dorsal (AMePD), é uma estrutura encefálica que apresenta plasticidade morfofuncional em seus neurônios e modula vários comportamentos sociais e reprodutivos em ratos. Os objetivos do presente estudo foram determinar a densidade de espinhos dendríticos de neurônios da AMePD de ratos nas seguintes condições experimentais: 1) machos adultos e não manipulados experimentalmente, para estudar separadamente os neurônios multipolares de tipo bipenachados e estrelados; 2) machos adultos submetidos ao estresse de contenção por 1 h, por 6 h ou por 28 dias; 3) machos adultos criados em “ambiente enriquecido” por 3 semanas; e, 4) em machos com idade avançada (24 meses), estudá-los na velhice. Todos os animais (N = 6 em cada grupo) foram manipulados em condições éticas e submetidos ao método de Golgi do tipo “single-section”. Nos animais dos grupos controle e submetidos ao estresse de contenção, adicionalmente as adrenais foram retiradas e pesadas. Para o estudo dos neurônios da AMePD, os encéfalos foram seccionados em vibrátomo e os cortes coronais foram colocados, após fixação, em solução de dicromato de potássio e em nitrato de prata. Neurônios bem impregnados e indubitavelmente presentes na AMePD foram selecionados para estudo.Os espinhos presentes nos primeiros 40 μm dendríticos foram desenhados com auxílio de uma câmara clara, acoplada a microscópio óptico, em aumento de 1000X. Cada animal teve 8 ramos dendríticos selecionados, um por neurônio diferente, perfazendo 48 ramos ao total em cada grupo experimental. Para o primeiro objetivo, as médias da densidade de espinhos dendríticos dos neurônios multipolares bipenachados e estrelados foram comparados pelo teste “t” de Student. Para os demais, as médias das densidades de espinhos dendríticos dos ratos nos grupos estudados nas diferentes condições experimentais foram comparados entre todos os grupos experimentais pela ANOVA de uma via, tendo-se o grupo controle (obtido do primeiro experimento) como o mesmo para todos os outros grupos manipulados experimentalmente. A seguir, os dados foram analisados pelo teste post-hoc de Tukey tendo-se selecionado as comparações mais pertinentes aos grupos experimentais estudados. Em todos os casos o nível de significância foi estabelecido em p < 0,05. A densidade de espinhos dendríticos (média + e.p.m do número de espinhos por μm dendrítico) foi de 3,07 + 0,1 e 3,12 + 0,05 para os neurônios bipenachados e estrelados, respectivamente. Os dois tipos de neurônios multipolares não apresentaram diferença estatisticamente significativa na densidade de espinhos dendríticos entre si (p = 0,6). Desta forma, aleatoriamente selecionou-se parte dos resultados de ambos os tipos celulares que foram somados para gerar o grupo controle. Nos grupos experimentais estudados a seguir, os dois tipos morfológicos contribuíram indistintamente para os valores obtidos. Os resultados da ANOVA de uma via indicaram que em tais grupos houve diferença estatisticamente significativa quando os dados foram comparados entre si [F(5,35) = 10,736; p < 0,01]. O teste post hoc de Tukey demonstrou que o grupo submetido ao estresse de contenção por 1 h possui uma menor densidade de espinhos dendríticos em comparação ao grupo controle (1,94 + 0,08 e 2,95 + 0,16; respectivamente; p < 0,01). Tal redução foi de mais de 34% em relação ao grupo controle. Já os grupos submetidos ao estresse por 6 h e ao estresse por 28 dias (média + e.p.m = 2,52 + 0,11 e 3,07 + 0,03; respectivamente), não apresentaram diferença estatisticamente significativa em relação ao grupo controle (p > 0,05). O peso relativo das adrenais apresentou diferença estatisticamente significativa entre os grupos controle e submetidos ao estresse de contenção [F (3,29) = 48,576; p < 0,01]. O grupo estressado cronicamente apresentou o peso relativo das adrenais maior do que qualquer outro dos grupos estudados (p < 0,01). O teste post hoc de Tukey demonstrou que o grupo submetido ao enriquecimento ambiental apresentou uma diminuição significativa na densidade de espinhos dendríticos em relação ao grupo controle (2,39 + 0,12 e 2,95 + 0,16; respectivamente; p < 0,05) e que tal redução foi de 19% (p < 0,05). Por fim, o teste post hoc de Tukey também indicou que os ratos velhos não apresentaram diferença estatisticamente significativa no valor da densidade de espinhos dendríticos em relação ao grupo controle (2,55 + 0,16 e 2,95 + 0,16; respectivamente; p > 0,05). Os resultados demonstram a plasticidade neural que ocorre na AMePD, específica para a condição experimental estudada. As modificações no número dos espinhos dendríticos na AMePD podem ser uma conseqüência do funcionamento da microcircuitaria local e da hodologia desta estrutura no contexto da organização geral do SNC do rato, como decorrência de ações hormonais nessa estrutura nervosa.