Biologia do gene pheA de Mycobacterium tuberculosis : clonagem, seqüenciamento e superexpressão do seu produto - a proteína prefenato desidratase

A Tuberculose (TB) é a principal causa de óbitos entre as doenças infecciosas causadas por um único agente. De acordo com a Organização Mundial da Saúde (OMS) o agente etiológico da TB no homem, o complexo Mycobacterium (M. tuberculosis, M. africanum, M. bovis) é responsável por cerca de 8 milhões de novas infecções e 3 milhões de mortes a cada ano no mundo. No começo da década de 80, a reemergência da TB em países em desenvolvimento deve-se à crescente incidência do Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV), à falta de recursos para o tratamento desta doença e à proliferação de cepas resistentes a múltiplas drogas (MDR-TB). Esta situação criou a necessidade da busca por novos agentes antimicobacterianos capazes de reduzir o tempo de tratamento, melhorar a adesão dos pacientes ao mesmo e ser efetiva contra cepas MDR-TB. A via do chiquimato leva à biossíntese do corismato, o precursor de aminoácidos aromáticos, tirosina, triptofano e fenilalanina. A primeira reação na biossíntese de fenilalanina envolve a conversão de corismato a prefenato, catalisada pela corismato mutase. A segunda reação na biossíntese de fenilalanina é a descarboxilação e desidratação de prefenato a fenilpiruvato, catalisada pela prefenato desidratase. Embora ausente em mamíferos, esta via está presente em bactérias, algas, fungos, plantas e parasitos do Phyllum Apicomplexa. Esta rota é essencial em M. tuberculosis e, portanto, suas enzimas representam alvos potenciais para o desenvolvimento de novas drogas antimicobacterianas. O objetivo deste trabalho foi estudar o gene pheA da linhagem de M. tuberculosis H37Rv e seu produto, a enzima prefenato desidratase Para isso, DNA genômico de M. tuberculosis H37RV foi extraído e o gene pheA foi amplificado pela técnica de PCR, clonado no vetor de expressão pET-23a(+), seqüenciado e superexpresso em células de Escherichia coli BL21(DE3). Os resultados obtidos confirmaram a região predita para o gene pheA, que foi amplificado com sucesso, mostrando 963 pb, sendo que a presença de 10% dimetil sulfoxido (DMSO) mostrou ser essencial para permitir a desnaturação do DNA rico em bases G-C. Análise da seqüência nucleotídica pelo método de Sanger confirmou a identidade do gene clonado e demonstrou que nenhuma mutação foi introduzida pelos passos de PCR e clonagem. A enzima prefenato desidratase foi superexpressa em células de E. coli BL21(DE3) eletroporadas com pET-23a(+)::pheA. Análise por SDS-PAGE mostrou expressão significativa de uma proteína com aproximadamente 33kDa, estando de acordo com a massa molecular esperada para a prefenato desidratase. A proteína recombinante foi superexpressa sem a adição de IPTG, e a presença da proteína pôde ser detectada em todos os intervalos de tempo testados (6, 9 e 24 horas depois da OD600nm alcançar o valor de 0,5). Foi realizado ensaio enzimático com a prefenato desidratase de acordo com Gething et al. (1976) utilizando prefenato de bário como substrato e coeficiente de extinção molar de 17.500 a 320 nm para calcular a concentração de fenilpiruvato. Houve um aumento de 1766 vezes na atividade específica da prefenato desidratase no extrato bruto da proteína recombinante em relação ao controle, no qual o vetor pET23a(+) sem o gene pheA foi introduzido em células de E. coli BL21(DE3).

Desenvolvimento de um novo método de pré-concentração em linha em eletroforese capilar através de gradientes térmicos

Nos últimos dez anos, milhares de trabalhos foram publicados somente no desenvolvimento da técnica de eletroforese capilar (CE) e suas aplicações em ciências biológicas, química e em outras áreas. Apesar disto, muitos tópicos de pesquisa básica da CE ainda continuam sendo desenvolvidos. Algumas vantagens da CE sobre as demais técnicas de separação são marcantes, tais como: possibilidade de automação, rapidez na obtenção dos resultados e alto poder de resolução. A pequena quantidade de amostra que é necessária para uma análise é uma característica muito interessante no estudo de sistemas biológicos, sendo que normalmente são injetados no capilar, volumes de 5 a 50 nl de amostra. Por outro lado, esta reduzida quantidade de amostra utilizada, a pequena janela de detecção e as baixas concentrações dos analitos nas amostras biológicas, são fatores que desafiam os pesquisadores nesta área. Para contornar este problema diversos métodos de pré-concentração de amostra foram desenvolvidos. Neste trabalho, foi desenvolvido um método inédito de pré-concentração de amostras através de gradientes térmicos em CE. O princípio do método é concentrar o analito quando ele passa de uma zona de alta temperatura para uma zona de baixa temperatura. Um modelo teórico foi desenvolvido para auxiliar o planejamento experimental no que diz respeito à determinação das condições em que a corrida deve ser realizada (pH, tipo de tampão, temperatura) para aplicar a compressão térmica em um analito. Foi utilizado L-Lisina derivatizada com naftaleno 2,3-dicarboxialdeído (Lys/NDA) como analito modelo. Uma diferença de temperatura de 58 °C entre as duas zonas térmicas foi suficiente para comprimir em 2,5 vezes a banda da Lys/NDA em um tampão de baixo coeficiente térmico com o pH ajustado para 8,7. O método de compressão de banda por gradientes térmicos proposto neste trabalho é uma nova opção para aumentar a sensibilidade e a resolução em CE. Ao contrário dos métodos clássicos de pré-concentração, esse novo método pode ser aplicado em amostras tanto com alta ou baixa condutividade iônica, comprimir bandas de analitos aniônicos ou catiônicos e ser aplicado em corridas em solução livre ou não. Além disso, considerando que o controle de temperatura seja realizado de maneira automatizada, pode apresentar altas taxas de reprodutibilidade, além de ser de simples e de fácil aplicação, podendo ser empregado em análises de rotina. Diferentes LEDs (Light Emitting Diode) foram testado em detector por fluorescência induzida por LED. Além disso, um novo sistema de aquisição de dados e tratamento de sinal utilizando a placa de som de um PC (Personal Computer) e um amplificador Lock-in emulado por software foi montado e comparado com um sistema de aquisição de dados convencional. O equipamento de CE utilizado neste trabalho com esses componentes, apresentou uma elevada sensibilidade, na faixa de 0,5 à 1 fmol para os peptídeos e aminoácidos testados e foi superior ao sistema convencional em vários aspectos como: sensibilidade de detecção, faixa linear de detecção em concentração do analito, facilidade de operação e custo do sistema.

Estudo molecular e confirmação do aspecto patogênico de mutações novas em pacientes brasileiros com a Síndrome de Morquio A

Introdução: A Síndrome de Morquio A (MPS IVA) é um Erro Inato do Metabolismo do grupo das Doenças Lisossômicas. Esta patologia é caracterizada pelo acúmulo e excreção de queratan e condroitin sulfato devido à deficiência da enzima lisossomal Galactose–6 sulfatase (GALNS; E.C.3.1.6.4). É uma doença rara cuja incidência varia entre 1:45.000 e 1:640.000. Os aspectos clínicos predominantes estão relacionados com o sistema osteo-articular com efeitos secundários sobre o sistema nervoso central, embora não haja déficit cognitivo. Os achados clínicos, evidentes a partir dos 2 anos, direcionam as análises bioquímicas para confirmação do diagnóstico através de avaliação dos glicosaminoglicanos urinários e de ensaios enzimáticos específicos. A doença é herdada de forma autossômica recessiva. O cDNA revela uma região codificante com 1566 nucleotídeos, que determina uma proteína com 522 aminoácidos. O gene contém 14 exons e foi mapeado em 16q24.3. Já foram descritas 148 mutações e 16 polimorfismos. O gene apresenta grande heterogeneidade molecular, sendo que 46,1% das mutações ocorreram menos de três vezes. Objetivo Identificar as mutações presentes no gene da GALNS em pacientes brasileiros com diagnóstico bioquímico para a MPS IVA; verificar se as mutações novas encontradas são causadoras do fenótipo patológico; e padronizar as técnicas de PCR e SSCP para análise do gene da GALNS. Materiais e Métodos: Seis casos-índice tiveram todo o gene da GALNS amplificados por PCR, seguido de seqüenciamento. Para as mutações novas, primers foram confeccionados para os respectivos exons e a patogenicidade testada por análise de freqüência em 100 controles normais. Condições de PCR e SSCP foram determinadas para cada um dos 4 exons com mutações novas. Sete pacientes novos com diagnóstico bioquímico foram analisados para os exons com as condições pré-estabelecidas. Os controles e pacientes com padrão alterado no gel de SSCP foram seqüenciados. Resultados: Em relação aos seis casos-índice 11 dos 12 alelos tiveram a alteração identificada, revelando seis mutações diferentes. Destas, quatro eram novas (p.G116S, p.N164T, p.L307P e p.S341R) e duas já descritas (p.R386C e p.G139S).Dos 100 controles analisados para cada exon nenhum apresentou o mesmo padrão de migração da amostra mutada, mas foram encontradas novas alterações (p.A107A, p.Y108Y e p.P357P). Entre os pacientes novos, sete dos 14 alelos foram identificados (p.N164T, p.G301C e uma mudança do quadro de leitura). Discussão: As quatro mutações novas identificadas foram consideradas patogênicas uma vez que não estavam presentes nos controles, indicando uma freqüência menor que 1% nesse grupo. As mutações p.G116S, p.N164T e p.G301C (freqüências de 14,3%, 14,3% e 19,0% dos alelos, respectivamente) foram consideradas recorrentes, além das já descritas e também recorrentes p.G139S e p.R386C. Nos quatro exons padronizados encontramos 40% das mutações descritas. Entre as diferentes mutações encontradas em nossos casos-índice uma nova (p.G116S) e duas já descritas (p.G139S e p.R386C) se localizam em regiões CpG. Conclusões: Foram identificadas alterações moleculares em 11 dos 12 alelos de seis pacientes brasileiros com MPS IVA, sendo que as quatro mutações novas encontradas puderam ser classificados como patogênicas; as técnicas de PCR e SSCP para os 4 exons do gene da GALNS foram padronizadas.