Avaliação do estresse oxidativo em indivíduos submetidos a diferentes intensidades de exercicio em esteira rolante

O exercício físico está relacionado com a formação de radicais livres e com a adaptação do sistema antioxidante. O objetivo deste trabalho foi avaliar os parâmetros oxidativos e antioxidantes após três sessões independentes de exercício agudo em esteira rolante, em três intensidades diferentes, determinadas a partir dos limiares ventilatórios e consumo máximo de oxigênio, obtidos em um teste de potência aeróbia máxima. Dezessete indivíduos do sexo masculino com idade entre 20 e 30 anos divididos em dois grupos; oito triatletas, compondo o grupo treinado, e nove estudantes de educação física, compondo o grupo não treinado. As amostras sangüíneas foram coletadas antes e imediatamente após o exercício para determinação da quimiluminescência, da capacidade antioxidante total plasmática (TRAP) e da atividade eritrocitária das enzimas superóxido dismutase (SOD), catalase (CAT) e glutationa peroxidase (GPx). Foram observados um efeito do exercício sobre a capacidade antioxidante total, que se apresentou aumentada após o exercício (p<0,05) e um efeito do estado de condicionamento físico sobre a atividade da enzima glutationa peroxidase, que se apresentou maior nos indivíduos treinados (p<0,05). Houve redução da quimiluminescência após o exercício em alta intensidade no grupo treinado (p<0,05). A enzima superóxido dismutase se apresentou elevada após o exercício nas intensidades baixa e média no grupo não treinado (p<0,05). Não foram encontradas mudanças na atividade da enzima catalase.

Avaliação do estresse oxidativo sistêmico e órgão-específico na intoxicação crônica por cloreto de mercúrio

Os dejetos de mercúrio utilizados industrialmente atingem a natureza e, por este motivo, isto se tornou um problema de Saúde Pública. O mercúrio pode agir como iniciador de lipoperoxidação (LPO) e promover formação de radicais livres. Estudos prévios demonstraram que o HgCl2, de forma aguda, diminui a atividade mecânica do coração e afeta a freqüência cardíaca. Foi objetivo deste estudo reproduzir um modelo de intoxicação crônica por cloreto de mercúrio através da administração subcutânea deste metal por 30 dias e verificar se muda a concentração sangüínea deste metal nos ratos tratados. Buscou-se também observar se o cloreto de mercúrio produz modificações temporais sistêmicas no estresse oxidativo e alterações na lipoperoxidação, na capacidade antioxidante total e na atividade das enzimas antioxidantes em homogeneizado cardíaco, hepático e renal entre os grupos, após 30 dias de intoxicação. Para isto, foram utilizados 20 ratos machos Wistar com peso aproximado de 250g, divididos em dois grupos: grupo Controle (C), que foram injetados subcutaneamente sem introdução de substâncias e grupo HgCl2 (H), os quais receberam injeção subcutânea deste composto na concentração de 5mg/Kg de peso, diluídos em soro fisiológico. Ambos foram injetados durante 30 dias consecutivos, sempre à mesma hora. Foi coletado sangue do plexo retrorbital dos animais na 1°, 2° e 4° semana de tratamento para medida do estresse oxidativo. Após o término do tratamento, o sangue total de cada rato foi retirado e, então, estes animais foram sacrificados e seus corações, fígados e rins foram retirados e homogeneizados. Os eritrócitos lavados e os sobrenadantes teciduais foram utilizados para medidas de lipoperoxidação, através de quimiluminescência e para medida das atividades enzimáticas da Catalase (CAT), Superóxido Dismutase (SOD), Glutationa-S-Transferase (GST) e Glutationa Peroxidase (GPx). A capacidade antioxidante total (TRAP) foi medida em plasma e sobrenadante tecidual. Como resultados, observamos que os ratos tratados diminuíram de peso significativamente (diferença de peso de quase 50% entre os grupos). A concentração sangüínea de mercúrio no grupo tratado estava aumentada significativamente. Comparando-se os grupos experimentais, observou-se, em relação ao estresse oxidativo temporal sangüíneo, que na 2° semana de tratamento as enzimas antioxidantes GST e GPx aumentaram suas atividades (14% e 28%, respectivamente), em relação ao grupo controle. A SOD mostrou-se diminuída na 1° e 2° e aumentou na 4° semana, significativamente (25%, 50% e 43%, respectivamente). A atividade da CAT não variou no sangue. O TRAP esteve diminuído pela metade na 1° semana de estudo. Quando se comparou o comportamento de cada grupo com ele mesmo como referência ao longo do tempo de estudo, notou-se que o grupo controle apresentou um aumento progressivo na atividade da GST, com o passar das semanas. Em relação à GST, o grupo controle apresenta uma queda de atividade na 2° semana, tendo esta atividade aumentada na 1° e 4° semana. A enzima SOD e o TRAP mantiveram-se aproximadamente constantes no decorrer dos trinta dias de experimento, no grupo controle. A atividade da CAT mostrou-se diminuída na 1° semana, em relação às demais, no grupo controle. Já o grupo tratado, quando comparado a si mesmo durante o tempo de intoxicação, apresentou-se com a atividade da enzima GST diminuída na 1° semana, aumentando na 2° e, a partir daí, constante. A atividade da GPx e da SOD mostrou o mesmo perfil neste grupo, estando aumentada na 1° semana, diminuída na 2° e aumentada novamente na 4°semana de tratamento. A CAT aumentou progressivamente no grupo tratado no decorrer do tempo de intoxicação, o mesmo ocorrendo com o TRAP. Em relação aos tecidos, no coração a atividade da CAT encontrou-se diminuída e houve aumento significativo de LPO ao final do estudo. O TRAP apresentou-se aumentado em 225%. No rim, a CAT diminuiu significativamente no grupo que recebeu HgCl2 e a GST encontrou-se muito aumentada, quando comparada ao grupo controle. O TRAP aumentou 100%. No fígado, a lipoperoxidação aumentou 44% e as enzimas antioxidantes estudadas tiveram suas atividades diminuídas significativamente, com exceção da GST. O TRAP mostrou-se diminuído 55%. Os resultados encontrados sugerem que a administração de HgCl2 por injeção subcutânea, de forma crônica, aumentou o estresse oxidativo sistêmico principalmente na fase aguda, causando uma piora do estado de saúde geral dos animais. Da mesma forma, o estresse oxidativo cardíaco e hepático mostrou-se aumentado, no período de intoxicação crônica determ

Metabolismo da homocisteína e defeitos do tubo neural : um estudo bioquímico e molecular no sul do Brasil

Os defeitos de fechamento de tubo neural constituem uma das malformações mais freqüentes na espécie humana, apresentando alta morbi-mortalidade. Sua etiologia é considerada multifatorial, estando envolvidos fatores genéticos e ambientais. Estes fatores estão relacionados principalmente com o metabolismo da homocisteína. Realizamos um estudo de caso-controle com o objetivo de estudar os fatores bioquímicos e genéticos relacionados ao DTN na nossa população. Em pares de afetados com DTN e suas mães e pares de pacientes normais e suas mães foram avaliados dosagem de folato, vitamina B12, homocisteína e polimorfismos da enzima metileno tetraidrofolato redutase (MTHFR), C677T e A1298C. A dosagem de folato nos casos foi 11,37 ng/mL(±6,72) e nos controles 5,64 ng/mL(±4,16) (p<0,001). O folato sérico das mães foi 7,27 ng/mL (±4,48) e 3,90 ng/mL (±1,77) nas mães controles (p<0,001). A média de dosagem de vitamina B12 foi de 641,88 pg/mL ((±262,21) nos casos e 743,27 pg/mL (±433,52) nos controles (p= 0,205). A média de dosagem de vitamina B12 nas mães dos casos foi 354,75 pg/mL (±142,06) e 465,25 pg/mL (±194,91) nas mães controles (p=0,004). O nível de homocisteína plasmático médio foi 6,89 μmol/L(±4,48) para os casos e 5,41 μmol/L (±2,55) para os controles (p=0,099). Nas mães dos casos a dosagem média de homocisteína foi 7,23 μmol/L (±2,64) e 7,00 μmol/L (±2,24) nas mães controles (p=0,666). Não houve diferença entre a freqüência dos genótipos C677T e A1298C da MTHFR nos casos e controles e suas mães. Para o polimorfismo C677T as freqüências dos alelo C e T foram respectivamente 0,6585 e 0,3414 nos pacientes com DTN; 0,6590 e 0,3410 nos controles; 0,6460 e 0,3540 nas mães dos casos e 0,6136 e 0,3860 nas mães controles. Para o polimorfismo A1298C as freqüências dos alelos A e C foram respectivamente 0,7436 e 0,2564 nos pacientes com DTN; 0,7610 e 0,2390 nos controles; 0,8055 e 0,1945 nas mães dos casos e 0,8065 e 0,1935 nas mães controles. Identificamos que indivíduos homozigotos 677TT apresentam um maior nível de homocisteína e este é inversamente relacionado com os níveis de vitamina B12. Estes achados sugerem que uma alteração metabólica relacionada ao metabolismo da homocisteína e principalmente devido à diminuição da vitamina B12 seja um fator de risco para DTN na nossa população.

Estudo do papel do estresse oxidativo em córtex cerebral de ratos submetidos ao modelo experimental de hiperprolinemia tipo II

A hiperprolinemia tipo II é uma doença autossômica recessiva causada pela deficiência severa na atividade da enzima ∆1 – pirrolino-5-carboxilato desidrogenase, o que resulta em acúmulo tecidual de prolina. Muitos pacientes apresentam manifestações neurológicas como epilepsia e retardo mental. Embora as manifestações neurológicas sejam encontradas em um considerável número de pacientes hiperprolinêmicos, os mecanismos pelos quais estas ocorrem são pouco compreendidos. O estresse oxidativo é um importante processo que vem sendo relatado na patogênese de algumas condições que afetam o sistema nervoso central (SNC), como é o caso das doenças neurodegenerativas, epilepsia e demência. Este fato torna-se facilmente compreensível, visto que o SNC é altamente sensível ao estresse oxidativo, em face do alto consumo de oxigênio; do alto conteúdo lipídico, principalmente de ácidos graxos poliinsaturados, dos altos níveis de ferro e da baixa defesa antioxidante. Considerando que: a) pouco se sabe a respeito dos altos níveis de prolina no SNC, b) a prolina ativa receptores NMDA e é epileptogênica e c) o estresse oxidativo está associado com doenças que afetam o SNC, no presente estudo investigamos os efeitos in vivo e in vitro da prolina sobre alguns parâmetros de estresse oxidativo, como a quimiluminescência, o potencial antioxidante total (TRAP), e sobre as atividades das enzimas antioxidantes catalase (CAT), glutationa peroxidase (GSH-Px) e superóxido dismutase (SOD) em córtex cerebral de ratos Wistar. Os resultados mostraram que a administração aguda de prolina aumentou significativamente a quimiluminescência e reduziu o TRAP em córtex cerebral de ratos de 10 e 29 dias. Em contraste, a administração crônica de prolina não alterou estes parâmetros. Todavia, a presença de prolina no homogeneizado de córtex cerebral de ratos de 10 e 29 dias aumentou significativamente a quimiluminescência e reduziu o TRAP em concentrações de prolina semelhantes àquelas encontradas nos tecidos de pacientes hiperprolinêmicos (0,5 – 1,0 mM). Nossos resultados também mostraram que a administração aguda de prolina não alterou as atividades das enzimas GSH-Px e SOD em córtex cerebral de ratos de 10 e 29 dias, mas diminuiu significativamente a atividade da CAT em ratos de 29 dias. Por outro lado, a administração crônica de prolina não alterou a atividade da enzima SOD, mas significativamente aumentou a atividade da CAT e reduziu a atividade da GSH-Px. Em adição, a presença de prolina no homogeneizado de córtex cerebral reduziu significativamente a atividade da SOD em ratos de 10 dias, permanecendo as atividades da CAT e GSH-Px inalteradas. Todavia, as atividades das enzimas antioxidantes não foram alteradas na presença de prolina no homogeneizado de córtex cerebral de ratos de 29 dias. Os resultados obtidos em nosso trabalho sugerem que o estresse oxidativo induzido pela prolina pode estar envolvido na disfunção cerebral observada na hiperprolinemia tipo II.

Alterações bioquímicas e comportamentais em ratos submetidos ao modelo químico experimental de hiperhomocisteinemia

A homocistinúria é uma doença metabólica hereditária causada pela deficiência severa na atividade da enzima cistationina β-sintase e é bioquimicamente caracterizada pelo acúmulo tecidual de homocisteína e metionina. Retardo mental, deficiência cognitiva, isquemia, convulsões e aterosclerose são achados clínicos comuns em pacientes homocistinúricos. No entanto, os mecanismos fisiopatológicos da doença são pouco conhecidos. Modelos animais experimentais de erros inatos do metabolismo são úteis para compreender a fisiopatologia dessas doenças em humanos. No nosso laboratório, já foram criados alguns modelos animais de algumas doenças metabólicas hereditárias, como, por exemplo, fenilcetonúria e hiperprolinemia tipo II. A Na+,K+-ATPase é uma enzima fundamental responsável pela manutenção do gradiente iônico necessário para a excitabilidade neuronal e consome de 40 a 60% do ATP formado no cérebro. Essa enzima é inibida por radicais livres e sua atividade está diminuída na isquemia cerebral, epilepsia e em doenças neurodegenerativas como a doença de Alzheimer. A diminuição de energia cerebral e o estresse oxidativo têm sido associados com algumas doenças que afetam o sistema nervoso central, como as doenças de Alzheimer, Parkinson e Huntington e isquemia cerebral. Por outro lado, a homocisteína tem sido considerada um fator de risco para o aparecimento dessas doenças. No sentido de ampliar o conhecimento das alterações bioquímicas envolvidas na gênese da disfunção neurológica característica da homocistinúria, esse trabalho teve como principal objetivo desenvolver um modelo químico experimental de hiperhomocisteinemia em ratos. Utilizando esse modelo, verificamos a atividade da Na+,K+-ATPase e alguns parâmetros de metabolismo energético (produção de CO2, captação de glicose, produção de lactato e atividades das enzimas succinato desidrogenase e citocromo c oxidase) em hipocampo de ratos. A aprendizagem e a memória na tarefa do labirinto aquático de Morris foram avaliadas em ratos submetidos ao modelo químico experimental de hiperhomocisteinemia. Nesse trabalho, também estudamos o efeito in vitro dos metabólitos acumulados na homocistinúria, homocisteína e metionina, sobre a atividade da Na+,K+-ATPase e sobre alguns parâmetros de metabolismo energético (produção de CO2, captação de glicose, produção de lactato e atividade da enzima citocromo c oxidase). Além disso, o efeito in vitro da homocisteína sobre alguns parâmetros de estresse oxidativo (potencial antioxidante total (TRAP), substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) e atividades das enzimas antioxidantes catalase, superóxido dismutase e glutationa peroxidase) em hipocampo de ratos foi investigado. O tratamento crônico foi realizado do 6o ao 28o dia de vida, através de administrações subcutâneas de homocisteína, duas vezes ao dia, com intervalos de 8 horas. As doses de homocisteína administradas foram escolhidas com o objetivo de induzir concentrações plasmáticas de 0,4 a 0,5 mM, semelhantes àquelas encontradas em pacientes homocistinúricos. Através desse tratamento, também foram induzidas concentrações elevadas de homocisteína no cérebro de ratos. Os controles receberam solução salina em volumes semelhantes. Os resultados mostram que a administração crônica de homocisteína inibiu a atividade da Na+,K+-ATPase de membrana plasmática sináptica, a produção de CO2 e a captação de glicose, assim como as atividades das enzimas succinato desidrogenase e citocromo c oxidase em hipocampo de ratos. Os animas tratados com homocisteína também apresentaram diminuição de memória na tarefa do labirinto aquático de Morris. Além disso, a homocisteína e a metionina inibiram a atividade da Na+,K+-ATPase de hipocampo de ratos in vitro. Estudos cinéticos sobre a inibição da Na+,K+-ATPase, causada pela homocisteína, também foram realizados. Os resultados mostraram que a homocisteína inibe a enzima de forma não-competitiva com o ATP como substrato. Também foi verificado que a incubação de homogeneizados de hipocampo com homocisteína diminuiu a atividade da Na+,K+-ATPase e que a incubação simultânea com alguns antioxidantes, tais como glutationa, ditiotreitol, cisteína e a enzima antioxidante superóxido dismutase preveniram esse efeito. Os metabólitos acumulados na homocistinúria também alteraram alguns parâmetros de metabolismo energético cerebral (produção de CO2 e lactato, captação de glicose e atividades das enzimas succinato desidrogenase e citocromo c oxidase) in vitro. Além disso, verificou-se que a homocisteína in vitro diminuiu o TRAP e aumentou a quantidade de TBARS, um marcador de lipoperoxidação, mas não alterou as atividades das enzimas antioxidantes catalase, superóxido dismutase e glutationa peroxidase. Os achados sugerem que a inibição da atividade da Na+,K+-ATPase, a diminuição do metabolismo energético e o aumento do estresse oxidativo podem estar relacionados com as disfunções neurológicas características dos pacientes homocistinúricos.

Comparação de parâmetros de dano oxidativo em atletas profissionais de voleibol de quadra, jogadores de vôlei de praia e indivíduos não treinados, quando submetidos a exercício em cicloergômetro

Radical livre é qualquer substância, átomo ou molécula capaz de existir independente, e que possua elétrons desemparelhados em seu último orbital energético. Uma vez formados, começam uma série de reações, podendo levar a danos em biomoléculas (lipídeos, proteínas e também o DNA). Os radicais livres podem ser gerados, entre outras formas, pelo exercício físico aeróbio, que eleva o consumo de oxigênio (VO2) entre 10-15 vezes mais que em situação de repouso, essa elevação induz uma maoir atividade mitocondrial, onde aproximadamente 5% do oxigênio utilizado na mitocôndria, como aceptor de eletrons, é liberado na forma de superóxido. Porém, especula-se que as espécies reativas de oxigênio, são geradas no exercício anaeróbio por um aumento na atividade da xantina oxidase, pela liberação de prótons, provocada pela acidose láctica (que em estudos in vitro, mostrou ser um potente fator pró-oxidante), por uma atividade aumentada da óxido nítrico sintase, pela autooxidação de catecolaminas, pela síndrome de esquemia/reperfusão, entre outras fontes. O organismo, para se proteger desses danos oxidativos, possui dois tipos de proteção antioxidante, a enzimática: como a catalase, a superóxido dismutase e a glutationa peroxidase, e o sistema antioxidante não-enzimatico, onde, podemos citar dentro de uma vasta lista: ácido úrico, vitaminas E, A e C, bilirrubina, albumina e compostos fenólicos, entre outros. O treinamento físico induz adaptações antioxidante ao organismo dos indivíduos, onde os sujeitos são expostos cronicamente a condição de estresse oxidativo, que é onde a formação de espécies reativas de oxigênio é maior que a capacidade protetora, e isto faz com que ocorra um aumento na atividade ou conteúdo dos antioxidantes, ou então que a produção desses oxidantes seja menor. Com isso, o objetivo desse estudo foi comparar o estresse oxidativo induzido pelo exercício, através de aspectos bioquímicos e fisiológicos comparando atletas profissionais de voleibol de quadra, jogadores de vôlei de praia e indivíduos não treinados. Todos os sujeitos foram voluntários, do sexo masculino, não fumantes, sem fazer uso de drogas/suplementos/medicamentos, não ingeriram bebidas alcoólicas, assim como também não praticaram atividade física exaustiva 48 h antes dos testes. Os sujeitos executaram um teste máximo de carga progressiva para determinar o consumo máximo de oxigênio, servindo para determinação da carga do teste aeróbio submáximo de 1 hora, que foi igual para todos os voluntários (10% abaixo do segundo limiar ventilatório), além do teste anaeróbio Wingate com 30 segundos de duração. Os indivíduos receberam a prescrição de uma dieta padrão, que se constituiu 100% da RDA para cada indivíduo.

O efeito da N-acetilcisteína sobre a síndrome hepatopulmonar induzida por cirrose biliar e secundária em ratos

Este trabalho avaliou o potencial antioxidante da N-acetilcisteína (NAC) frente a síndrome hepatopulmonar, uma complicação da cirrose, no modelo de cirrose biliar secundária através da ligadura de ducto biliar em ratos. Foi utilizado ratos machos Wistar e investigou-se a integridade hepática através de enzimas séricas e a gasometria arterial, juntamente com o dano oxidativo, enzimas antioxidantes, nitratos totais, assim como a histologia através de hematoxilina e eosina do fígado e pulmão e picrosírius do fígado desses animais. Os animais foram divididos em quatro grupos experimentais: CO – no qual foi simulado a cirurgia de ligadura de ducto biliar principal; LDB – no qual foi realizada a cirurgia de ligadura de ducto biliar principal; CO + NAC – no qual foi simulado a cirurgia de ligadura de ducto biliar principal e recebeu tratamento com NAC após o 14º dia da cirurgia; LDB + NAC – no qual foi realizada a cirurgia de ligadura de ducto biliar principal e recebeu tratamento com NAC após o 14º dia da cirurgia. A NAC foi administrada por via intraperitoneal, numa concentração de 10mg/Kg, durante 14 dias Foi observado melhora nos parâmetros enzimáticos e gasométricos após o tratamento com a NAC. Constatou-se redução do dano oxidativo, verificado pelas substâncias que reagem ao acido tiobarbitúrico (TBARS), assim como as enzimas antioxidantes, superóxido dismutase, catalase e glutationa peroxidase, que mostram-se com valores próximos ao do grupo controle após a administração da NAC. Na avaliação de nitratos totais, observou-se aumento na produção destes metabólitos no pulmão dos ratos cirróticos após o tratamento com NAC esses valores se equipararam ao grupo controle. Através da análise histológica, verificou-se nódulos de fibrose no tecido hepático e vasodilatação do tecido pulmonar, esses fenômenos foram revertidos após o uso da NAC. A partir desse dados, constatamos que a NAC mostra-se promissora no estudo das complicações hepáticas.

Efeito das prostaglandinas ciclopentenônicas sobre a expressão gênica do fator nuclear PPAR-γ, do receptor de scavenger CD36 e proteínas de apoptose em macrófagos : implicações para a fisiopatologia da aterosclerose

Considerando que as doenças cardiovasculares representam a maior causa de mortalidade e morbidade em países ocidentais, a aterosclerose se destaca pelo fato de predispor os pacientes ao infarto do miocárdio, a acidentes vasculares cerebrais e a doenças vasculares periféricas. Neste contexto, a oxidação de lipoproteínas do plasma, particularmente LDL, é um dos fatores de risco para eventos cardiovasculares, pois é reconhecida e internalizada por macrófagos, ocasionando a sua diferenciação em foam cells. Diversos fatores participam deste processo de diferenciação, como a expressão de receptores de scavenger CD 36, proporcionando aumento na captação de LDL oxidada, aumento na síntese endógena de colesterol e ativação de fatores nucleares que iniciam a transcrição de proteínas específicas e fatores de crescimento que disparam a aterogênese. Os fenômenos celulares relacionados à apoptose também são de especial importância, tanto no desenvolvimento da lesão aterosclerótica como na estabilidade da placa e formação de trombos. As prostaglandinas (PGs) ciclopentenônicas (CP-PGs), em particular a PGA2 e a 15-desóxi-∆12,14-PGJ2 são uma classe especial de PGs que, em diminutas concentrações, disparam a expressão das proteínas de choque térmico (hsp), que são citoprotetoras. Além disso, CP-PGs bloqueiam a ativação do fator nuclear pró-inflamatório NF-κB tornando-as potentes agentes antiinflamatórios. Embora as PGs das famílias A e J guardem uma série de características em comum, a 15-desóxi-∆12,14- PGJ2 é o ligante fisiológico do fator nuclear pró-aterogênico PPAR-γ, enquanto as PGs da família A ativam apenas a via citoprotetora das hsp. Este trabalho teve como objetivo avaliar os efeitos das CP-PGs sobre a expressão gênica de fatores relacionados à diferenciação de macrófagos em foam cells, bem como proteínas reguladoras do processo de apoptose, em células da linhagem pró-monocítica humana U937. Para tal, as células foram tratadas com CPPGs em presença e/ou ausência de LDL nat e LDL ox, o RNA foi extraído para a realização de RT-PCR para PPAR-γ, CD 36, HMG-CoA redutase e proteínas de apoptose Caspase 3, p53 e Bcl-xL. O tratamento estatístico utilizado foi análise de variância (ANOVA one-way) e teste “t” de student, com resultados expressos como médias + desvios-padrão da média, com P<0,05. Os resultados obtidos demontraram que as CP-PGs PGA2 (20µM-24h) e PGJ2 (1,5µM-24h) inibiram a expressão gênica do fator nuclear PPAR- γ (64 % (PGA2), 88 % (15- d-PGJ2)) nas células U937, em presença de LDL oxidada, quando comparado ao controle. PGA2 inibiu a expressão de HMG-CoA redutase (33 %), enzima chave da síntese de colesterol intracelular, e o tratamento com as CP-PGs também inibiu a apoptose nas células tratadas em presença de LDL oxidada. Os dados sugerem que as CP-PGs apresentam grande potencial para o tratamento da aterosclerose, já que, além de apresentarem efeito antiinflamatório, inibem a expressão do fator nuclear pró-aterogênico PPAR-γ, do receptor de scavenger CD36 (apenas a 15-desóxi-∆12,14-PGJ2) e da enzima HMG-CoA redutase. O bloqueio da apoptose nas células estudadas pode estar relacionado à citoproteção oferecida por estas PGs. Embora investigações in vivo deste laboratório tenham mostrado a eficácia do tratamento com CP-PGs em camundongos portadores de aterosclerose, estudos adicionais são necessários para esclarecer-se o efeito antiaterogênico das mesmas.

Efeito in vitro dos ácidos 2-metilacetoacético e 2-metil-3-hidroxibutírico sobre alguns parâmetros do metabolismo energético em córtex cerebral de ratos jovens

As deficiências da β-cetotiolase mitocondrial e da 2-metil-3-hidroxibutiril-CoA desidrogenase (MHBD) são erros inatos do catabolismo da isoleucina. Os pacientes afetados pela deficiência da β-cetotiolase apresentam crises agudas de cetose e acidose metabólica, podendo apresentar convulsões que podem evoluir ao coma e morte. Bioquimicamente, são caracterizados por excreção urinária aumentada de ácido 2-metilacetoacético (MAA), 2-metil-3-hidroxibutírico (MHB) e tiglilglicina (TG). Alguns indivíduos apresentam acidemia láctica durante as crises de descompensação metabólica. Por outro lado, os indivíduos afetados pela deficiência da MHBD são caracterizados por retardo mental, convulsões e acidose láctica severa, apresentando excreção urinária aumentada de MHB e TG. O aumento do ácido láctico em ambas as enfermidades sugere um comprometimento do metabolismo energético. Tendo em vista que os mecanismos fisiopatogênicos de ambas desordens são totalmente desconhecidos e que os achados bioquímicos sugerem um déficit na produção de energia dos pacientes, o presente trabalho teve por objetivo investigar os efeitos in vitro do MAA e do MHB sobre alguns parâmetros do metabolismo energético em córtex cerebral de ratos jovens. Nossos resultados demonstraram que o MAA inibiu a produção de CO2 a partir de glicose, acetato e citrato, indicando um bloqueio do ciclo do ácido cítrico. Em adição, o complexo II da cadeia respiratória bem como a enzima succinato desidrogenase foram inibidos na presença do MAA. Portanto, é possível que a inibição da cadeia respiratória tenha levado à inibição secundária do ciclo de Krebs. As enzimas Na+,K+-ATPase e creatina quinase (CK) não foram afetadas pelo MAA. O MHB inibiu a produção de CO2 a partir dos três substratos testados bem como o complexo IV da cadeia respiratória, sugerindo que a inibição da cadeia respiratória tenha levado à inibição da produção CO2 pelo ciclo de Krebs. A enzima Na+,K+- ATPase não foi afetada pelo ácido. No entanto, o MHB inibiu a atividade total da CK às custas da CK mitocondrial (mi-CK). A presença do inibidor da enzima óxido nítrico sintase L-NAME e do antioxidante glutationa reduzida (GSH) preveniram a inibição da atividade total da CK, enquanto que a GSH preveniu a inibição da mi-CK, sugerindo que os efeitos do MHB sobre a CK estejam relacionados à oxidação de grupamentos tióis essenciais à atividade enzimática. Tais resultados sugerem que o metabolismo energético cerebral é inibido in vitro pelo MAA e pelo MHB. Caso estes achados se confirmem nas deficiências da β-cetotiolase e da MHBD, é possível que um prejuízo no metabolismo energético causado pelo acúmulo destes metabólitos possa explicar, ao menos em parte, o dano neurológico encontrado nos pacientes portadores destas doenças.

Efeito in vitro do guanidino acetato sobre as atividades da Na+, K+-ATPase e da acetilcolinesterase em cérebro de ratos jovens

A deficiência de guanidino acetato metiltransferase (GAMT) é um erro inato do metabolismo da creatina caracterizado por hipotonia muscular, movimentos extrapiramidais involuntários e epilepsia. A doença é bioquimicamente caracterizada por acúmulo de guanidino acetato e deficiência de creatina e fosfocreatina nos tecidos dos pacientes afetados. Os mecanismos de disfunção neurológica que ocorrem nessa doença ainda são desconhecidos. A Na+,K+-ATPase desempenha um papel fundamental no sistema nervoso central (SNC), sendo responsável pela manutenção dos gradientes iônicos e pela propagação do impulso nervoso, consumindo cerca de 50% do ATP formado no cérebro. A acetilcolinesterase (AChE) é uma importante enzima regulatória que controla a transmissão de impulsos nervosos através de sinapses colinérgicas pela hidrólise da acetilcolina, e apresenta um papel fundamental na cognição. Com o propósito de ampliar o conhecimento sobre os mecanismos fisiopatológicos da deficiência de GAMT, esse trabalho teve como objetivo investigar o efeito do guanidino acetato, o principal metabólito acumulado na deficiência de GAMT, sobre as atividades das enzimas Na+,K+-ATPase, Mg2+-ATPase e AChE em estriado de ratos. A cinética de inibição da Na+,K+-ATPase causada pelo guanidino acetato também foi estudada. Além disso, investigamos o efeito in vitro do guanidino acetato sobre as atividades da Na+,K+-ATPase, Mg2+-ATPase e da AChE de hipocampo de ratos. Nossos resultados mostraram que o guanidino acetato não altera as atividades da AChE e Mg2+-ATPase. No entanto, a atividade da Na+,K+-ATPase foi inibida por esse composto guanidínico (CG), e a análise cinética mostrou uma inibição do tipo acompetitiva. Também foi demonstrada uma interação entre o guanidino acetato e o ácido arginínico, sugerindo um sítio comum de ligação entre esses dois compostos na Na+,K+-ATPase. Os resultados mostraram que, o guanidino acetato inibiu a atividade da Na+,K+-ATPase in vitro mas não alterou as atividades da Mg2+-ATPase e da AChE. Considerando que o guanidino acetato e outros compostos guanidínicos (CG) induzem a formação de espécies reativas de oxigênio e que a Na+,K+-ATPase e a AChE são inibidas por radicais livres, estudamos o efeito da pré-incubação de homogeneizado de hipocampo de ratos na presença de guanidino acetato sobre a atividade dessas enzimas. Além disso, o efeito da pré-incubação de homogeneizado de ratos com guanidino acetato foi investigado na presença e ausência de antioxidantes, tais como glutationa (GSH), trolox, taurina e L-NAME. A pré-incubação de homogeneizado de hipocampos na presença de guanidino acetato inibiu a atividade da Na+,K+-ATPase, mas não alterou a atividade da Mg2+-ATPase. No entanto, L-NAME e taurina foram capazes de prevenir tal efeito. Dessa forma, propõem-se que a inibição da atividade da Na+,K+-ATPase pelo guanidino acetato seja um dos mecanismos envolvidos na disfunção neuronal observada em pacientes com deficiência de GAMT.

Papel do estresse oxidativo na neurotoxicidade do ácido L-piroglutâmico : relevância dos distúrbios hereditários do ciclo gama-glutamil

O ácido L-piroglutâmico (PGA) é o principal intermediário do ciclo γ-glutamil, que está relacionado à síntese e degradação da glutationa. Altos níveis de PGA no líquido cefalorraquidiano, sangue e outros tecidos, juntamente com a alta excreção urinária do mesmo (acidúria piroglutâmica ou 5-oxoprolinúria), ocorrem em alguns erros inatos do metabolismo envolvendo diferentes enzimas do ciclo γ-glutamil. Essas desordens são clinicamente caracterizadas por anemia hemolítica, acidose metabólica e disfunção neurológica severa. No entanto, os mecanismos de dano cerebral permanecem ainda não esclarecidos. Várias ações neurotóxicas foram previamente atribuídas ao PGA, como excitotoxicidade, inibição da atividade da Na+,K+-ATPase e alteração do metabolismo energético cerebral. No presente estudo, investigamos o possível papel do estresse oxidativo na neurotoxicidade do PGA. O efeito in vitro do PGA nas concentrações de 0,5 – 3,0 mM foi estudado sobre o potencial antioxidante total (TRAP), a reatividade antioxidante total (TAR), quimiluminescência, susbtâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBA-RS), e atividade das enzimas antioxidantes catalase (CAT), superóxido dismutase (SOD) e glutationa peroxidase (GPx) em córtex cerebral e cerebelo de ratos de 14 dias de vida. Tanto o TRAP quanto o TAR foram significativamente reduzidos nas estruturas estudadas. Ao contrário, a quimiluminescência e o TBA-RS não foram afetados pelo PGA. As atividades da CAT, SOD e GPx também não foram alteradas. Esses resultados mostram que o PGA pode diminuir as defesas antioxidantes nãoenzimáticas em córtex cerebral e cerebelo de ratos. Outros estudos, no entanto, parecem válidos a fim de melhor caracterizar o papel dos radicais livres na neurotoxicidade do PGA.

Estudo de diferentes parâmetros de estresse oxidativo na adrenoleucodistrofia ligada ao X

A adrenoleucodistrofia ligada ao cromossomo X (X-ALD) é uma doença peroxissomal bioquimicamente caracterizada pelo acúmulo de ácidos graxos de cadeia muito longa (“Very Long Chain Fatty Acids” - VLCFA), principalmente os ácidos hexacosanóico (C26:0) e tetracosanóico (C24:0), em diferentes tecidos e fluidos orgânicos. A doença é clinicamente caracterizada por progressiva desmielinização central e periférica e insuficiência adrenal. Os mecanismos exatos do dano cerebral na X-ALD são pouco conhecidos. O tratamento usual para X-ALD com a mistura gliceroltrioleato/gliceroltrierucato na proporção 4:1, conhecido como óleo de Lorenzo (OL), em combinação com uma dieta de restrição dos VLCFA normaliza os níveis de VLCFA, mas em pacientes sintomáticos os sintomas neurológicos persistem ou progridem. Os radicais livres parecem estar envolvidos em um grande número de enfermidades no ser humano, tais como nas doenças neurodegenerativas (como doença de Parkinson, doença de Alzheimer e esclerose múltipla), nas doenças crônico-inflamatórias, nas doenças vasculares e no câncer. Considerando que a geração de radicais livres está envolvida em várias desordens neurodegenerativas, no presente estudo foram avaliados vários parâmetros de estresse oxidativo em plasma, eritrócitos e fibroblastos de pacientes sintomáticos com X-ALD. Também foi avaliado o efeito do tratamento com OL sobre diferentes parâmetros de estresse oxidativo em plasma e em eritrócitos de pacientes sintomáticos e assintomáticos com X-ALD tratados e não tratados com OL. Considerando que não é possível estudar estresse oxidativo em córtex cerebral de pacientes com X-ALD, foi avaliado o efeito in vitro da mistura VI ácido oleico (C18:1)/ácido erúcico (C22:1) sobre diversos parâmetros de estresse oxidativo em plasma e em eritrócitos humanos normais e em córtex cerebral de ratos adicionados dos ácidos hexacosanóico(C26:0) e tetracosanóico (C24:0). Foi verificado um aumento significativo da quimiluminescência e das espécies reativas do ácido tiobarbitúrico (TBA-RS), refletindo uma indução da peroxidação lipídica, bem como uma diminuição da reatividade antioxidante total (TAR) medida em plasma de pacientes sintomáticos, indicando uma capacidade deficiente em rapidamente combater um aumento das espécies reativas. Também foi observado um aumento da atividade da glutationa peroxidase (GPx) em eritrócitos e das atividades da catalase (CAT) e da superóxido dismutase (SOD) em fibroblastos dos pacientes sintomáticos estudados. Estes dados sugerem que o estresse oxidativo pode estar envolvido na fisiopatologia da X-ALD. Verificamos também que o OL não reverteu o aumento do TBA-RS no plasma de indivíduos X-ALD. A determinação de TAR não apresentou alterações no plasma de pacientes X-ALD sintomáticos e assintomáticos antes e após o tratamento com OL. A atividade das enzimas antioxidantes CAT, GPx e SOD não se mostrou alterada em eritrócitos destes pacientes tratados ou não com OL. Nos experimentos in vitro, foi constatado um aumento significativo da quimiluminescência e de TBA-RS em plasma humano e em córtex cerebral de ratos adicionados dos ácidos C26:0C24:0, porém a mistura C18:1/C22:1 não reverteu este efeito. A medida de TAR não se mostrou alterada em córtex cerebral de ratos adicionado de C26:0C24:0, bem como não foi modificada pela mistura C18:1/C22:1. Por outro lado, a adição de C26:0C24:0 em plasma humano diminuiu a medida de TAR, porém a mistura C18:1/C22:1 não alterou esse efeito. As atividades das enzimas antioxidantes CAT e GPx não foram alteradas em eritrócitos humanos e em córtex cerebral de ratos pela adição de C26:0C24:0 , nem pela mistura C18:1/C22:1. O mesmo foi observado na medida de SOD em eritrócitos humanos adicionados de C26:0C24:0. A medida da atividade da SOD em córtex cerebral de ratos apresentou um aumento significativo induzido por C26:0C24:0 , porém a presença da mistura C18:1/C22:1 não modificou este efeito. Estes resultados sugerem fortemente que o estresse oxidativo possa estar envolvido na fisiopatologia da X-ALD e que o tratamento com óleo de Lorenzo não modifica estes parâmetros de estresse oxidativo. Assim, novas estratégias terapêuticas deveriam ser investigadas para pacientes de X-ALD.

Efeito in vitro do ácido gama-hidroxibutírico sobre parâmetros de estresse oxidativo em córtex cerebral de ratos jovens

A deficiência da semialdeído succínico desidrogenase, ou acidúria γ-hidroxibutírica, é um erro inato do metabolismo do ácido γ-aminobutírico. Bioquimicamente, é caracterizada pelo acúmulo de elevadas concentrações do ácido γ-hidroxibutírico nos tecidos, líquido cefalorraquidiano, sangue e urina dos pacientes. As manifestações clínicas descritas nesses pacientes são muito variadas e inespecíficas, mas observa-se que os principais sintomas e sinais clínicos são neurológicos. Entretanto, os mecanismos responsáveis pela disfunção neurológica desses pacientes são pouco conhecidos. Neste trabalho, o efeito in vitro do ácido γ-hidroxibutírico foi investigado sobre a quimiluminescência, as substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBA-RS), o potencial antioxidante total (TRAP), a reatividade antioxidante total (TAR) e as atividades das enzimas antioxidantes superóxido dismutase (SOD), catalase (CAT) e glutationa peroxidase (GPX) em homogeneizados de córtex cerebral de ratos jovens com o intuito de esclarecer, ao menos em parte, a etiopatogenia dos sintomas neurológicos característicos dessa doença. O ácido γ-hidroxibutírico aumentou significativamente a quimiluminescência e os níveis de TBA-RS, enquanto que o TRAP e o TAR foram marcadamente reduzidos. No entanto, as atividades das enzimas antioxidantes não foram alteradas pelo ácido γ-hidroxibutírico. Esses resultados indicam que o ácido γ-hidroxibutírico estimula a lipoperoxidação e reduz as defesas antioxidantes não-enzimáticas, sugerindo a participação do estresse oxidativo na neuropatologia da deficiência da semialdeído succínico desidrogenase. Porém, esses achados devem ser confirmados em pacientes afetados por essa doença.

Efeito in vitro das substâncias acumuladas na doença de Lesch-Nyhan sobre a atividade da Na+,K+-ATPase em estriado de ratos

A doença de Lesch-Nyhan é um erro inato do metabolismo das purinas caracterizado pela deficiência na enzima hipoxantina- guanina fosforibosiltransferase. O bloqueio dessa reação resulta no acúmulo tecidual de hipoxantina, xantina e ácido úrico. A doença caracteriza-se por hiperuricemia, variado grau de retardo mental e motor, espasticidade e auto-mutilação. No sistema nervoso central, a Na+, K+ - ATPase é responsável pela manutenção da homeostase dos íons Na+ e K+, regulando o volume celular, a excitabilidade neuronal, o transporte de neurotransmissores e outras moléculas. Evidências na literatura demonstram que a redução na atividade da Na+, K+ - ATPase está relacionada com diversas doenças neurodegenerativas, tais como isquemia cerebral e doenças de Parkinson e de Alzheimer. No presente estudo, investigamos o efeito in vitro da hipoxantina, xantina e ácido úrico sobre a atividade da Na+, K+- ATPase em membrana plasmática sináptica de estriado de ratos. Estudamos, também, a cinética de inibição causada pela hipoxantina e de interação entre hipoxantina, xantina e ácido úrico. Nossos resultados demonstram que hipoxantina, xantina e ácido úrico inibem significativamente a atividade da Na+, K+- ATPase. O estudo dos mecanismos de inibição da atividade enzimática causados pela hipoxantina demonstrou um efeito inibitório não competitivo com o substrato ATP. Além disso, o estudo de interação cinética entre hipoxantina, xantina e ácido úrico sugere que esses compostos atuem em um mesmo sítio de ligação na enzima. Verificamos, também, o efeito da preincubação de homogeneizado de estriado de ratos na presença de hipoxantina (10 µM) sobre a atividade da Na+, K+- ATPase de membrana plasmática sináptica com a adição ou não de antioxidantes (glutationa e trolox), bem como alguns parâmetros de estresse oxidativo denominados TBARS (medida de lipoperoxidação) e TRAP (capacidade antioxidante tecidual não-enzimática) no intuito de verificar a participação do estresse oxidativo nos mecanismos de inibição enzimática provocados pela hipoxantina. Os resultados monstraram que a hipoxantina inibe significativamente a atividade da Na+, K+- ATPase. Adicionalmente, nossos resultados demonstraram que glutationa, mas não o trolox, na concentração de 1 mM, foi capaz de prevenir a inibição enzimática causada pela hipoxantina. Nossos resultados também mostraram que a hipoxantina, na mesma concentração, aumentou TBARS e diminuiu TRAP que essa substância induz o estresse oxidativo. É possível que a inibição na atividade da Na+, K+- ATPase possa estar envolvida nos mecanismos pelos quais as oxipurinas são neurotóxicas. Acreditamos que nossos resultados possam contribuir, pelo menos em parte, na compreensão da disfunção neurológica encontrada em pacientes portadores da doença de Lesch-Nyhan.

Papel da MRP1/bomba GS-X na regulação do potencial redox celular, e a influência do estado redox celular na expressão e atividade da MRP1/bomba GS-X

Uma das complicações que levam o paciente terminal de câncer à morte é a imunossupressão. Por sua vez, a superprodução de prostaglandinas ciclopentenônicas (CP-PGs) no plasma desses indivíduos é um fator de risco para depressão imunológica já que as CP PGs bloqueiam inúmeras interações entre células imunológicas. Estudos de nosso grupo revelaram que células tumorais apresentam alta atividade da ATPase bomba GS X/MRP que exporta conjugados sulfidrila, inclusive CP PG na forma de S-conjugados de glutationa. A glutationa é uma das, ou a mais importante substância para manutenção do estado redox celular. Como o acúmulo de proteínas de choque térmico (HSP) induzidas pelas CP PGs em células imunológicas é indicativo do grau de estresse ao qual cada célula está sendo submetida, neste trabalho, buscamos determinar qual a influência da MRP1/bomba GS-X na presença de estresse celular causado por desbalanço redox e os parâmetros de estresse celular necessários para influenciar a expressão e/ou a atividade da MRP1/bomba GS-X. Nossos resultados sugerem que linfócitos respondem bem a transfecção por eletroporação com o gene da MRP1/bomba GS-X e que a presença desta proteína possa conferir resistência ao tratamento com substâncias eletrofílicas de maneira a ajustar o estado redox celular mais rapidamente, o que impede o efeito citotóxico destas substâncias.