Caracterização biológica e molecular da interação de Drechslera avenae (Eidam) Sharif com cultivares e linhagens de aveia (Avena sativa L.)

A helmintosporiose, incitada por Drechslera avenae (teleomorfo, Pyrenophora avenae), constitui fator limitante à produção e à qualidade do grão de aveia (Avena sativa L). A caracterização biológica e molecular da interação aveia - D. avenae pode contribuir para o manejo e a determinação de estratégias de controle da doença. Para a caracterização biológica, foram avaliadas trinta cultivares de aveia quanto à percentagem de área foliar com sintomas da doença e o tipo de lesão, inicialmente sob condições de inoculação artificial com três isolados do fungo e, após, no campo, sob condições naturais de infecção. Os resultados demonstraram haver interações significativas entre os genótipos da planta e isolados do patógeno. Classificaram-se como mais resistentes ao fungo OR 4, UFRGS 7, UFRGS 14, UFRGS 18 e UPF 19. Para a caracterização molecular da interação, cinco genótipos (CTC 5, ORLA 975, preta-comum, UFRGS 18 e UPF 17), não inoculados e inoculados com dois isolados do fungo, foram investigados para a análise de expressão diferencial de genes após 12, 24 e 72 horas após a inoculação. A partir do RNA total extraído das plantas submetidas aos tratamentos, realizaram-se a síntese de cDNA (RT-PCR), o isolamento de cDNAs expressados diferencialmente e a produção de sondas para a verificação de mRNAs induzidos, os quais foram hibridizados por meio de “Southern blot” e “Reverse Northern”. Foram observadas diferenças na expressão de genes, em nível de mRNA, entre plantas sadias e infectadas, tendo-se obtido sete fragmentos de cDNAs relacionados à interação com D. avenae, os quais foram comparados quanto a sua similaridade com seqüências depositadas no banco de dados do Genbank. Pela análise de “Reverse Northern”, pôde-se identificar um cDNA denominado E3-IFCO, relacionado com a resposta de defesa da planta.

Ocorrência de fungos micorrízicos arbusculares e colonização radicular em pomares e viveiros de citros sob manejo orgânico e convencional

Os Fungos Micorrízicos Arbusculares (FMAs) desempenham importante papel nos agroecossistemas. Quando bem manejados podem auxiliar na manutenção da qualidade do solo bem como promover melhor desenvolvimento e saúde aos vegetais. Em função disso os FMAs apresentam um grande potencial biotecnológico, mas para que seu emprego seja bem sucedido é necessário conhecermos como esses organismos respondem às práticas agrícolas. Com o objetivo de verificar a interação das comunidades de FMAs com diferentes sistemas produtivos, efetuou-se um levantamento em pomares e viveiros de citros com manejo convencional e orgânico no município de Montenegro/RS. O estudo foi realizado nos meses de agosto/2001, outubro/2001, março/2002 e agosto/2002. Foram coletadas um total de 88 unidades amostrais. Avaliou-se a colonização radicular, as estruturas presentes nas raízes e a ocorrência de espécies de FMAs, bem como, as características químicas do solo adjacente às raízes de citros. As comunidades de FMAs não diferiram em relação aos tipos de manejo, apesar das alterações químicas determinadas pela aplicações de adubos orgânicos, que elevou os valores de pH, MO, Ca e Mg. Porém o tempo de implantação e as regiões onde se localizaram os pomares e viveiros influenciaram as comunidades de FMAs. Isso se deve principalmente a estabilidade dos pomares mais antigos e as características evolutivas de cada local. Entre os elementos do solo a umidade afetou consideravelmente a micorrização. Os pomares localizados na várzea apresentaram baixos índices de estruturas e colonização por FMAs. Os demais pomares apresentaram altos índices de estruturas e colonização, independente dos teores de P que foram elevados em todos os pomares e viveiros.

Identificação e avaliação do potencial biotecnológico de leveduras e fungos semelhantes a leveduras isolados de filoplano do Hibiscus rosa-sinensis

O filoplano do Hibiscus rosa-sinensis abriga uma enorme biodiversidade de leveduras e fungos semelhantes a leveduras cujo potencial biotecnológico ainda é desconhecido. Foram isoladas 84 cepas de leveduras de filoplano desta planta, sendo identificadas pela metodologia clássica. Do total de isolados 37% são de afinidade ascomicética, 36% de afinidade basidiomicética e 27% de fungos semelhantes a leveduras.

Uso de fungos micorrízicos arbusculares no desenvolvimento de porta-enxertos de videira e no controle biológico de Fusarium oxysporum f. sp. herbemontis

Levando-se em conta as vantagens dos FMA, este trabalho foi desenvolvido tendo por objetivo avaliar a utilização destes microrganismos no desenvolvimento vegetativo e no controle biológico da fusariose, em porta-enxertos de videira oriundos de micropropagação.

Biorremediação de antraceno, fenantreno e pireno em um argissolo

O antraceno, o fenantreno e o pireno são hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (HAPs) que podem ser carcinogênicos e que não são degradados pela maioria dos microrganismos do solo. A biorremediação é uma estratégia para eliminação dos HAPs, que pode demandar a inoculação de microrganismos degradadores e a modificação das condições químicas e físicas do solo. O objetivo do presente estudo foi isolar, identificar e caracterizar microrganismos degradadores e mineralizadores de antraceno, fenantreno e pireno em meio mineral e no solo, assim como avaliar a influência do pH e da disponibilidade de água, N, P, Fe e S na biorremediação de um solo contaminado com antraceno. Seis amostras de solo de landfarming foram inoculadas individualmente a um solo contaminado em laboratório com antraceno. Após 176 dias, o solo com maior produção de C-CO2 foi utilizado para o enriquecimento em meio mineral mais antraceno. Os microrganismos foram isolados e identificados pelo seqüenciamento do gene do RNAr. A capacidade dos microrganismos em degradar os 3 HAPs no meio mineral e no solo foi avaliada por cromatografia gasosa. A mineralização de diferentes concentrações de antraceno, fenantreno e pireno no solo foi avaliada por respirometria, assim como o efeito de diferentes doses de N, P, S e Fe, de diferentes pH e umidades do solo na mineralização do antraceno. Isolou-se do solo de landfarming um consórcio microbiano composto por 6 bactérias, identificadas como Mycobacterium fortuitum, Bacillus cereus, Microbacterium sp., Gordonia polyisoprenivorans, Microbacteriaceae bacterium e Naphthaleneutilizing bacterium, e um fungo, Fusarium oxysporum. O consórcio microbiano degradou respectivamente 48, 67 e 22% do antraceno, fenantreno e pireno do meio mineral. No solo o consórcio degradou, em média, mais de 92% e mineralizou mais de 78% das diferentes concentrações destes 3 HAPs em 70 dias. As maiores mineralizações do antraceno ocorreram nos solos com as maiores umidades gravimétricas (12,5%) e pH (7,5). A adição de 100 kg ha-1 ou mais de nitrogênio no solo e a conseqüente redução da relação C:N para valores inferiores a 67:1 diminuíram a mineralização do antraceno no solo. O aumento da disponibilidade do fósforo, do ferro e do enxofre e a presença de amplas relações C:P (1076:1 a 50:1) e C:N:P (1076:16:1 a 50:1,3:1) no solo não influenciaram a mineralização do antraceno. Conclui-se que a seleção e a inoculação ao solo de microrganismos degradadores de HAPs, associado a modificação das condições ambientais, pode conduzir a um eficiente processo de biorremediação, onde a grande maioria dos HAPs é mineralizada em curto período de tempo.

Estudo da influência de manejos pós-colheita na incidência de fungos e micotoxinas no arroz (Oryza sativa L.)

Cerca de 15% da safra de arroz é perdida anualmente, principalmente em práticas inadequadas de pós-colheita. Nesse contexto, a avaliação de técnicas de secagem e armazenamento é necessária em função das perdas quali e quantitativas de grãos, resultantes do desenvolvimento de fungos. O objetivo desse trabalho foi analisar a contaminação fúngica e por micotoxinas do arroz submetido aos sistemas de secagem intermitente e estacionário, com armazenamento em sacaria e em silo-secador, avaliando o comportamento das principais variáveis de influência no processo. O trabalho foi realizado entre os meses de maio de 2003 a maio de 2004. As amostras de arroz com casca foram coletadas a cada dois meses, em duplicatas. Foram, ainda, analisadas amostras de arroz branco polido e parboilizado de ambos sistemas. O número de colônias de bolores e leveduras foi determinado e a capacidade produtora de micotoxinas dos isolados do gênero Aspergillus foi investigada. A detecção de aflatoxinas, ocratoxina A, zearalenona e citrinina foi realizada por cromatografia em camada delgada. Os grãos secados no sistema estacionário apresentaram maior contagem de colônias fúngicas. Enquanto no sistema intermitente, a contaminação foi mais uniforme ao longo do armazenamento. Predominaram representantes do gênero Penicillium nos dois sistemas, principalmente P. commune e P. islandicum. Entre os isolados do gênero Aspergillus, destacou-se A. flavus. Foram encontrados 7 (13, 20%) isolados de A.flavus produtores de aflatoxina B1, mas não foram detectadas micotoxinas nas amostras. A umidade dos grãos afetou significativamente a contaminação fúngica no manejo intermitente e no terço superior (altura 2) do silo-secador. A temperatura no interior do silo influenciou a contaminação no terço inferior (altura 1).

Biodeterioreção produzida por biofilmes de fungos e cianobactérias nas ruínas jesuíticas das Missões e avaliação do seu controle

As Ruínas das Missões Jesuíticas foram declaradas Patrimônio da Humanidade pela UNESCO em 1984. Nesse trabalho foi estudada a degradação das mesmas usando análises físico-químicas, petrológicas e microbiológicas. Amostras de blocos de arenito e pedra itacurú foram tomadas das ruínas de Santa Ana, Loreto, San Ignacio e Santa María no Nordeste da Argentina. Foram realizados estudos microbiológicos convencionais e de microscopia de varredura eletrônica para determinar a biodiversidade da microflora presente nos biofilmes das superfícies. Uma ampla variedade de microrganismos autotróficos e heterotróficos, principalmente cianobactérias, algas e fungos, foram achados, sendo que, nos sítios menos expostos à luz solar, a biodiversidade foi maior. Foi constatada a mobilização microbiana dos íons Fe e Mn do núcleo das pedras para a periferia, formando uma crosta superficial de óxidos minerais, a qual aumenta a suscetibilidade à degradação. Foram testados no laboratório vernizes protetores com três biocidas em dois veículos diferentes, utilizando-se testes em placa de Petri e em câmara tropical com inóculos de fungos filamentosos e cianobactérias isoladas das pedras degradadas. O biocida Coryna® DF (isotiazolinonas + derivados do benzimidazol) mostrou se mais eficiente contra a mistura de fungos, enquanto que o biocida Preventol® MP 260 (3-iodo-2-propinilbutil carbamato) foi mais ativo contra as cianobactérias. O verniz base solvente sem biocida apresentou ligeira ação inibitória contra fungos.

Estudo dos fatores genéticos de risco para o infarto agudo do miocárdio em idade precoce

O mecanismo patogênico mais importante no IAM é a oclusão trombótica de uma artéria coronariária no local de ruptura de uma placa aterosclerótica. Recentemente, diversos estudos têm investigado a associação entre o IAM e fatores genéticos protrombóticos. O presentetrabalho é um estudo tipo caso-controle a fim de avaliar o efeito de diversos polimorfismos genéticos em um grupo de pacientes com IAM antes dos 60 anos de idade. Foram investigados 283 pacientes e 93 indivíduos controles, todos caucasóides e sem diferenças quanto à proporção sexual e idade média entre os grupos.

Componentes da resistência quantitativa à ferrugem da folha em linhagens recombinantes de aveia

A ferrugem da folha da aveia, causada pelo fungo Puccinia coronata f. sp. avenae, é responsável por grandes decréscimos na produção, afetando tanto o rendimento como a qualidade de grãos. O controle através do uso de cultivares com resistência qualitativa tem se mostrado pouco efetivo em termos de durabilidade. Neste sentido, a resistência quantitativa pode ser uma alternativa de controle viável, em busca de uma resistência mais durável, já que exerce menor pressão de seleção sobre a população patogênica. A resistência quantitativa reduz a taxa de progresso da doença, pela combinação dos diversos componentes que a condicionam, como: longo período latente, curto período infeccioso, baixa eficiência de infecção e pústulas de comprimento reduzido. Não se sabe ao certo o papel individual de cada um destes componentes sobre o progresso da doença no campo, bem como, o número de genes que determinam estas características. Assim, este trabalho visou caracterizar os componentes da resistência quantitativa (período latente, período infeccioso, comprimento de pústulas e ASCPD) à ferrugem da folha da aveia, em planta adulta e plântulas, tanto em condições controladas como em condições de campo. Para tanto foram utilizadas 83 linhagens recombinantes F6:10 de aveia branca, oriundas do cruzamento de um pai suscetível (UFRGS 7) com um pai com resistência quantitativa (UFRGS 910906). As linhagens apresentaram variabilidade para as características avaliadas, exceto para comprimento de pústulas em planta adulta. Os componentes da resistência apresentaram distribuição normal, exceto o comprimento de pústulas em planta adulta e o período de latência em plântulas. Isto sugere a presença de vários genes de pequeno efeito atuando na expressão dos mesmos, não se enquadrando em nenhum modelo de poucos genes. Os resultados sugerem que a resistência quantitativa à ferrugem da folha da aveia é resultado da ação conjunta de todos os componentes que a condicionam, e não de apenas um deles. Ainda, mecanismos diferenciados parecem estar atuando em cada genótipo na expressão desta característica.

Identificação de genes envolvidos na interação entre Magnaporthe grisea e arroz (Oryza sativa L.)

A brusone, causada pelo fungo Magnaporthe grisea (Hebert) Barr, é uma das mais importantes doenças da cultura do arroz. A resistência genética é a forma mais efetiva para o controle da doença. Os objetivos do presente trabalho foram: identificar genes envolvidos na resposta de resistência à infecção de M. grisea em arroz através das técnicas de expressão diferencial; obter e caracterizar uma biblioteca de cDNAs utilizando como modelo linhas quase-isogênicas de arroz (NILs = Near Isogenic Lines), contendo os genes de resistência Pi-1 e Pi-2; e avaliar e comparar a expressão diferencial de mRNAs, através dos cDNAs isolados em uma série de cultivares com resposta distinta à infecção de M. grisea. Foram identificados dois isolados com virulência diferencial para as NILs e um isolado para os cultivares. Os cDNAs relacionados à resistência do arroz à M. grisea foram identificados a partir de mRNAs isolados das NILs. Foram obtidos 30 fragmentos de cDNAs e 232 clones de cDNAs pelas técnicas de cDNA-AFLP e SSH, respectivamente. A análise das seqüências permitiu identificar genes envolvidos nos processos de metabolismo, transporte de íon inorgânico; transdução de sinais; fatores de transcrição; metabolismo de coenzima; conversão e produção de energia; metabolismo e transporte de carboidrato e biossíntese de proteína. Noventa clones isolados através da técnica de SSH foram selecionados e a expressão diferencial foi avaliada via hibridização em macroarranjos de cDNAs. A ausência de conservação entre os mRNAs diferencialmente expressos nas interações analisadas e a diversidade dos grupos de genes reflete a complexidade das respostas. A análise funcional in vivo desses genes poderá contribuir para utilização dos mesmos na obtenção de uma resistência de espectro amplo à brusone do arroz.

Tratamento com calor no controle de Botryosphaeria dothidea (Moug.) Ces. & De Not.) em maçãs cv. Fuji

A necessidade de se prolongar o período pós-colheita fez com que a utilização de tratamentos em pós-colheita com o uso de defensivos agrícolas aumentasse nas últimas décadas. No entanto, a preocupação de consumidores quanto a resíduos as deficiências de controle observadas incentivaram a procura por tratamentos alternativos, entre os quais os tratamentos com calor vem sendo testados em frutos de várias espécies. No presente trabalho estudou-se o efeito do tratamento com calor no crescimento do micélio e germinação dos conídios de Botryosphaeria dothidea e, avaliou-se a viabilidade da termoterapia com calor, isolada ou em combinação com carbonato de sódio no controle da podridão branca e na manutenção da qualidade das maçãs ‘Fuji’ em diferentes estádios de maturação, mantidas ou não sob armazenamento refrigerado. Foi objetivo também verificar a expressão de genes que são regulados durante a interação maçã-Botryosphaeria dothidea, após tratamento com calor. Os experimentos foram conduzidos testando-se combinações de diferentes temperaturas e períodos de exposição ao calor sobre o patógeno B. dothidea e sobre frutos inoculados e não inoculados artificialmente com o patógeno. Os resultados obtidos sobre o patógeno mostraram que, independente da concentração de caldo batata-dextrose (BD) utilizada na suspensão, 45% dos conídios de B. dothidea germinaram nos frutos após 24h e 91% após 48h de incubação a 26°C. Constatou-se um aumento significativo da germinação dos conídios quando acrescentado 2,4% de caldo BD a suspensão. Sobre o efeito da temperatura no patógeno, as temperaturas inferiores a 62°C, em qualquer período de exposição não foram capazes de inibir o micélio do patógeno. Os conídios submetidos à temperatura de 58°C somente foram inativados quando o tratamento foi estabelecido por 60s. A termoterapia com calor associada ou não ao carbonato de sódio reduziu a incidência e severidade da doença podridão branca. A severidade da doença foi influenciada pelo estádio de maturação dos frutos verificando pelo aumento no número de lesões/fruto quanto mais avançada a maturação das maçãs. Os resultados obtidos no RT-PCR evidenciaram que os protocolos utilizados não produziram RNA de alta qualidade e desta forma inviabilizaram a análise da expressão diferencial dos genes na interação maçã-B.dothidea.

Ocorrência de fungos micorrízicos arbusculares em cultivos de videira (Vitis sp.) sob manejo orgânico e convencional

Com o objetivo de avaliar o impacto de diferentes práticas agrícolas sobre as comunidades de FMA, foi realizado um levantamento no município de Urussanga/SC, no qual foram estudados diferentes vinhedos conduzidos com manejo orgânico e convencional.

Biodiversidade e potencial biotecnológico de leveduras e fungos leveduriformes associados ao filoplano de bromélias do Parque de Itapuã-Viamão/RS

As bromélias abrigam uma grande diversidade de organismos. O objetivo do presente trabalho foi analisar a biodiversidade de leveduras e fungos leveduriformes presentes no filoplano de bromélias e avaliar seu potencial biotecnológico. Foram coletadas 50 amostras de folhas de bromélias no Parque Estadual de Itapuã/RS (Praia da Pedreira e Praia de Fora). Fragmentos das folhas foram submetidos a lavagens sucessivas com 0,5%Tween 20. Diluições decimais seriadas da última lavagem, amostras de água dos tanques de bromélias e de flores foram inoculadas em meio YM modificado e incubadas a 25°C por 5-7 dias. Representantes dos diferentes morfotipos foram purificados e identificados pela metodologia convencional. A análise da biodiversidade foi realizada através do índice de Shannon-Weaver. Dos 191 isolados obtidos, 182 foram identificados, sendo 11% leveduras de afinidade ascomicética, 67,6% de afinidade basidiomicética, 19,8% de fungos leveduriformes e 1,6% de algas. Doze isolados de leveduras tiveram as regiões ITS e D1/D2 do 26SrDNA sequenciadas e pertencem a uma espécie ainda não descrita do gênero Rhodotorula. A diversidade e a riqueza de leveduras foram maiores na Praia da Pedreira (H=3,225 e S=34) que na Praia de Fora (H=2,820 e S=26). Cento e noventa e um isolados tiveram sua capacidade para produzir enzimas testada. Desses, 40,2% foram positivos para amilase, 49,2% para caseinase, 14,8% para gelatinase, 58,0% para celobiase, 36,0% para lactase e 61,3% para esterase. O filoplano das bromélias apresentou uma grande biodiversidade de leveduras e fungos leveduriformes,.demonstrando ser um bom substrato para o isolamento de leveduras produtoras de enzimas de interesse industrial.

Avaliação do impacto do herbicida glifosato na microbiota do solo e biodegradação por cepas de Fusarium

Investigou-se o impacto e a biodegradação do glifosato pela microbiota do solo. O solo utilizado foi (Argissolo vermelho distrofico arênico) coletado a 30 e 60 cm de profundidade onde foi quantificado a taxa de CO2 produzido e as UFC de bactérias e fungos . Foram utilizadas 5 cepas de fungos filamentosos pertencentes do gênero Fusarium crescidos em meio de cultura Czapeck com adição de glifosato, no qual foram testadas: a utilização como substrato, a concentração máxima inibitória e a biodegradação em agitador e em biorreator. Foi observado que a introdução do herbicida no solo não apresentou efeito negativo sobre a microbiota e que a população de bactérias cultiváveis foi mais numerosa que a de fungos. Dentre as cepas testadas nenhuma foi inibida pela presença do glifosato, mesmo a altas concentrações. Todas as cepas estudadas foram capazes de biodegradá-lo e utilizá-lo como fonte de nutriente. A formação de consórcio não apresentou maior eficiência na metabolização do composto quando comparado as culturas crescidas puras, sendo a biodegradação em biorreator mais eficiente que aquela realizada em agitador horizontal.

Desenvolvimento de um sistema de expressão em Metarhizium anisopliae baseado no promotor homólogo do gene tef-1 α

Vetores de expressão são ferramentas moleculares úteis para investigar a função de genes tanto em sistemas procarióticos quanto eucarióticos. O fungo Metarhizium anisopliae, utilizado no controle biológico de artrópodes, é bem caracterizado em nível molecular. Genes candidatos a participar do processo de infecção de hospedeiros tem sido isolados utilizando estratégias em que o gene candidato é predefinido (enzimas hidrolíticas, por exemplo) ou estratégias mais globais como projetos de ESTs e a análise de bibliotecas de subtração. A superexpressão tem sido o método adotado para verificar a participação de genes isolados no processo de infecção. Esta estratégia tem sido baseada no promoter heterólogo PgpdA de Aspergillus nidulans. Neste trabalho, o gene que codifica o fator de alongamento de tradução tef-1 α de Metarhizium anisopliae foi clonado e a sua região promotora foi localizada e utilizada na construção de um vetor de expressão. Somente uma cópia do gene tef-1α está presente no genoma de M. anisopliae e o seu perfil de expressão foi analisado. Uma árvore filogenética foi construída baseada nos ortógos de tef-1 α e mostrou uma alta correlação com o fungo Cordyceps taii. A região de 639 pb à montante do codon de iniciação (ATG) foi utilizada com sucesso para a expressão do gene repórter sGFP e do gene bar, que confere resistência ao glifosinato de amônio, em M. anisopliae. Os transformantes construídos não apresentaram alteração na sua virulência em bioensaios com carrapatos, em relação a linhagem receptora. Além disso, demonstramos que o nível de expressão permite a detecção óptica da fluorescência de sGFP durante a infecção dos carrapatos. Desta forma, o vetor desenvolvido será uma ferramenta útil para a superexpressão em Metarhizium.