Tipificação molecular de amostras de Brucella spp. utilização a técnica de BOX-PCR

O gênero Brucella é formado por coco-bacilos Gram negativos patogênicos ao homem e animais, sendo classificado como patógeno de grupo de risco III. A identificação dessas bactérias apresenta várias limitações como: exigência de inoculação em vários meios, tempo de incubação longo e necessidade de soros imunes e bacteriófagos. Devido à sua alta patogenicidade e ao longo tempo de exposição dos laboratoristas à bactéria, a brucelose é uma das infecções mais freqüentemente adquiridas em laboratório. Além da contaminação em laboratório, a transmissão ao homem pode ocorrer através de animais infectados e ingestão de produtos derivados, como o leite cru. A procura de métodos rápidos de identificação das espécies e biovares pode ser útil para diminuir os riscos do manuseio desta bactéria e na tomada de medidas de controle epidemiológico. O principal objetivo deste trabalho foi facilitar a classificação de cepas de referência de Brucella spp. e isoladas no Brasil utilizando a técnica de rep-PCR com oligonucleotídeos do elemento BOX, uma seqüência repetida presente no genoma de várias bactérias. Foram analisados 38 isolados representando diferentes espécies e biovares de Brucella sp. e 13 isolados de gêneros relacionados como controle da especificidade da reação. Foi realizada uma confirmação prévia dos isolados de brucela por testes bioquímicos e PCR gênero-específica. A técnica de BOX-PCR agrupou todas as espécies e biovares de Brucella em um único grupo com nível de similaridade entre 100 e 74%. Diferenças entre os isolados, quanto a presença ou ausência de bandas, puderam ser observadas. Entretanto, essas divergências não caracterizam uma espécie ou biovar. Bandas comuns a todos os isolados de Brucella sp. podem caracterizar o gênero.

Variabilidade, herdabilidade e regiões genômicas associadas à expressão da resistência parcial à ferrugem da folha em aveia (Avena sativa L.) avaliada em parcelas

As condições ambientais do subtrópico brasileiro favorecem o desenvolvimento da ferrugem da folha da aveia de maneira que a severidade torna-se alta e extremamente danosa. O desenvolvimento de variedades com resistência parcial (RP), tem sido sugerido como uma estratégia para tornar a efetividade da resistência à ferrugem da folha mais durável. Este trabalho teve por objetivos determinar a variabilidade, quantificar a herdabilidade e identificar as regiões genômicas (QTLs) associadas à expressão da RP, em linhagens do cruzamento UFRGS 7 x UFRGS910906, avaliadas na média de parcelas. Oitenta e três linhagens F6:7 e F6:8 e os genitores UFRGS 7 (suscetibilidade) e UFRGS 910906 (parcialmente resistente) foram avaliados, em 2002 e 2003, quanto à severidade da ferrugem da folha da aveia no decorrer do ciclo da cultura, em parcelas experimentais. A partir desses dados, foi calculada a área sob a curva do progresso da doença (ASCPD), a severidade máxima (SM) e o tempo em dias para atingir 12,5% da SM (T12,5). O rendimento de grãos (REND) e o peso de hectolitro (PH) das linhagens com RP foram comparados nos tratamentos com e sem fungicida. Uma análise por intervalo simples foi utilizada para identificar em mapa molecular F6, anteriormente desenvolvido, QTLs associados à ASCPD, SM e T12,5. A população de UFRGS 7 X UFRGS 910906 apresentou variabilidade para os parâmetros da RP, com as linhas 211, 238, 241, 243 e 245 apresentando os menores valores de ASCPD, SM e T12,5, nos dois anos. As estimativas de herdabilidade de ASCPD (0,87), SM (0,86), T12,5 (0,76), REND (0,99) e PH (0,64) foram altas. Seis QTLs foram identificados para as características ASCPD, SM e T12,5, avaliadas com base em parcelas experimentais, nos dois anos de estudo. Os resultados permitem concluir que a avaliação em parcelas da RP à ferrugem da folha de UFRGS 910906 é efetiva na distinção de genótipos resistentes. O nível de RP conferido por UFRGS 910906 não fornece proteção suficiente para manter o rendimento e qualidade de grãos, na presença de alta severidade da moléstia. A RP de UFRGS 910906 apresenta um QTL identificado pelo marcador AFLP PaaMtt340 com consistência de expressão em diferentes ambientes, capaz de ser detectado na avaliação de parcelas experimentais e com potencial para ser explorado através do uso de seleção assistida por marcadores moleculares em programas de melhoramento de aveia.

Componentes da resistência quantitativa à ferrugem da folha em linhagens recombinantes de aveia

A ferrugem da folha da aveia, causada pelo fungo Puccinia coronata f. sp. avenae, é responsável por grandes decréscimos na produção, afetando tanto o rendimento como a qualidade de grãos. O controle através do uso de cultivares com resistência qualitativa tem se mostrado pouco efetivo em termos de durabilidade. Neste sentido, a resistência quantitativa pode ser uma alternativa de controle viável, em busca de uma resistência mais durável, já que exerce menor pressão de seleção sobre a população patogênica. A resistência quantitativa reduz a taxa de progresso da doença, pela combinação dos diversos componentes que a condicionam, como: longo período latente, curto período infeccioso, baixa eficiência de infecção e pústulas de comprimento reduzido. Não se sabe ao certo o papel individual de cada um destes componentes sobre o progresso da doença no campo, bem como, o número de genes que determinam estas características. Assim, este trabalho visou caracterizar os componentes da resistência quantitativa (período latente, período infeccioso, comprimento de pústulas e ASCPD) à ferrugem da folha da aveia, em planta adulta e plântulas, tanto em condições controladas como em condições de campo. Para tanto foram utilizadas 83 linhagens recombinantes F6:10 de aveia branca, oriundas do cruzamento de um pai suscetível (UFRGS 7) com um pai com resistência quantitativa (UFRGS 910906). As linhagens apresentaram variabilidade para as características avaliadas, exceto para comprimento de pústulas em planta adulta. Os componentes da resistência apresentaram distribuição normal, exceto o comprimento de pústulas em planta adulta e o período de latência em plântulas. Isto sugere a presença de vários genes de pequeno efeito atuando na expressão dos mesmos, não se enquadrando em nenhum modelo de poucos genes. Os resultados sugerem que a resistência quantitativa à ferrugem da folha da aveia é resultado da ação conjunta de todos os componentes que a condicionam, e não de apenas um deles. Ainda, mecanismos diferenciados parecem estar atuando em cada genótipo na expressão desta característica.

Caracterização fenotípica e genotípica de amostras de Salmonella enterica sorovar Typhimurium isoladas de suínos no Rio Grande do Sul

A aplicação de métodos de tipificação baseados na caracterização fenotípica e genotípica em vários pontos da cadeia de produção de suínos pode ser uma importante ferramenta para identificar a principal fonte de contaminação por Salmonella sp. A partir disso, o trabalho propôs tipificar uma coleção de 97 amostras de Salmonella enterica subsp. enterica ser. Typhimurium (ST) isolada de suínos levados ao abate em três diferentes frigoríficos no Rio Grande do Sul, por meio de fagotipificação, hibridização com IS200, resistência a antimicrobianos, amplificação da região spvR, amplificação de sequências repetitivas (rep-PCR) e PFGE. Paralelamente, os isolados de ST foram avaliados frente a dois desinfetantes (amônia quaternária e iodofor) pela técnica da diluição em tubo. Os isolados foram classificados em 12 fagotipos distintos, sendo o DT177 o mais freqüentemente identificado. Houve o predomínio de um padrão único de hibridização com o IS200 e em apenas três isolados, a região spvR foi detectada. Um alto número de amostras resistentes à tetraciclina, sulfonamida e estreptomicina foi encontrado, sendo o perfil de resistência relacionado ao frigorífico de origem dos isolados. No rep-PCR, usando seqüências iniciadoras para REP e ERIC, um único padrão de bandas foi gerado entre os isolados de ST. A análise por PFGE mostrou doze diferentes padrões de bandas. Sessenta e quatro isolados apresentaram um padrão idêntico no PFGE. Todas amostras foram inibidas pelo composto quaternário de amônio, na concentração recomendada pelo fabricante e numa concentração inferior à indicada. Frente ao iodofor, quatro amostras mostraram-se resistentes na concentração indicada e 59 na sub-concentração. A combinação da fagotipificação e do perfil de PFGE permitiu alcançar uma melhor discriminação das amostras, sendo essas técnicas consideradas as mais adequadas. Por outro lado, a presença de linhagens clonais parecem estar presentes na região, indicando possíveis pontos comuns de infecção.

As vozes da AIDS na imprensa : um estudo das fontes de informação dos jornais Folha de S. Paulo e O Globo

O jornalismo, entendido como construtor de sentidos sobre a realidade, é um discurso que deve representar a diversidade de pensamento da sociedade contemporânea. Nesta pesquisa, buscamos responder se os jornais O Globo e Folha de S. Paulo, principais jornais de referência no Brasil, tratam de forma equilibrada a pluralidade de vozes para falar sobre o tema da Aids. Usando conceitos da Análise de Conteúdo e Análise do Discurso, realizamos um mapeamento dos temas abordados nos textos e, na seqüência, das fontes de informação, verificando os movimentos de dominância e silenciamento dos diferentes grupos. Foram analisados 310 textos jornalísticos sobre HIV/Aids, o total publicado nesses dois jornais no ano de 2004. Verificamos que a Aids foi tratada, na maioria das vezes, como uma questão grave de saúde pública que deve ser combatida pelos países desenvolvidos. Mesmo com o domínio de fontes oficiais, através do conceito de enunciador identificamos que as vozes dominantes foram as que cobraram ações dos governos na luta contra a Aids. Registramos o cruzamento de enunciadores nos textos, o que caracterizou a pluralidade de vozes; contudo, a fala das pessoas vivendo com HIV/Aids praticamente não esteve presente nos jornais pesquisados. Desta forma, não houve um equilíbrio nas vozes em textos sobre HIV/Aids.

Doença infecciosa bursal: estudo sobre amostras vacinais e de campo, imunidade materna e desafio com amostra muito virulenta do vírus.

As aves foram separadas em quatro grupos, dois vacinados e dois não vacinados no 1º dia de vida. As aves foram desafiadas no 1º,4º,7º,10º,13º,16º,19º e 22º dias de vida. A cada dia de desafio eram coletados e medidos, antes e depois, os seguintes itens do grupo: peso relativo da bolsa de Fabrício, diâmetro da bolsa, bolsa de Fabrício para exame histológico e soro para medir os anticorpos contra a DIB, através de Elisa e avaliação clínica da DIB. Os resultados mostraram uma queda de anticorpos sem diferença significativa entre aves vacinadas e não vacinadas. Analisando os diferentes resultados, foi estabelecido que um título de Elisa (log10) de 3,4, foi o ponto de corte entre aves saudáveis e aves doentes. Foram construídas equações de regressão, para o estabelecimento do melhor dia para a vacinação ou do título de Elisa (log10), que as aves podem ter numa determinada idade. Assim sendo, os pintos da Empresa A deveriam receber vacina contra a DIB a partir do 6º - 7º dia, e os da Empresa B deveriam receber a vacina entre o 11º-12º dia de idade. Com os resultados obtidos neste experimento fica claro que as aves não devem ser vacinadas no 1º dia de vida, que o esquema de vacinação das reprodutoras ocasiona diferenças na proteção da progênie e que não se deve aplicar o mesmo esquema de vacinação indiscriminadamente para todos os lotes de frangos.

Avaliação do potencial genotóxico de amostras ambientais da região hidrográfica da bacia do Lago Guaíba

O uso de bioensaios genéticos é uma importante ferramenta na avaliação da contaminação ambiental. Esta poluição, que em grande parte tem origem nas atividades humanas, é liberada no ambiente tendo como destino final, preferencialmente, os corpos d’água. No Rio Grande do Sul, a maior parcela da população e da produção interna do estado estão localizados na Região Hidrográfica do Lago Guaíba, sendo este, por conseqüência, um grande receptor de contaminantes urbanos, industriais e rurais. Neste contexto, o bivalve exótico Limnoperna fortunei (mexilhão dourado) foi escolhido, com base em dados de sua população e distribuição, como possível organismo biomonitor nesta região. Neste estudo, foram padronizadas as metodologias do ensaio cometa e teste de micronúcleos para hemócitos de L. fortunei. A sensibilidade dos mexilhões in vitro, foi avaliada pela exposição das células à radiação ultravioleta e in vivo pela exposição dos organismos aos agentes químicos com potencial genotóxico sulfato de cobre e pentaclorofenol. A radiação ultravioleta induziu uma relação dose resposta, com dano máximo, detectado pelo ensaio cometa, na dose de 4.2 J/m2. Para as avaliações in vivo, os organismos foram expostos aos agentes químicos por duas horas para o ensaio cometa e 24 e 48 horas para o teste de micronúcleos. Ambos compostos induziram danos gerando uma curva dose-resposta. O sulfato de cobre induziu a maior genotoxicidade na dose de 20 μg/ml, apresentando toxicidade em 48 horas de exposição. Para pentaclorofenol, o máximo de dano foi observado na exposição de 150 μg/L em ambos os ensaios. Animais expostos a pentaclorofenol apresentaram 100% de reparação do DNA 2 horas após a exposição. Em exposição dos mexilhões por sete dias a amostras ambientais contaminadas por compostos genotóxicos, também foi possível a detecção de danos por ambos os ensaios. Após a padronização das metodologias e verificação da sensibilidade, o mexilhão dourado foi utilizado para avaliar o potencial genotóxico de amostras de água superficial e sedimento da Bacia do Guaíba. As amostras de água e sedimento foram coletadas em oito pontos da Região Hidrográfica do Lago Guaíba, cinco na região de foz dos principais rios formadores do lago Guaíba (Gravataí, Sinos, Caí, Jacuí e Taquarí), um na foz do arroio Dilúvio, que corta a cidade de Porto Alegre, e em dois pontos dentro do lago Guaíba (Guaíba PC e Guaíba BR), próximo a locais de liberação de esgoto urbano (Guaíba BR e Guaíba PC). Foram avaliadas as estações do ano inverno e primavera e verão. Os moluscos foram coletados no Parque Estadual de Itapuã e aclimatados por no mínimo 7 dias em laboratório. Os organismos foram expostos por 7 dias as diferentes amostras ambientais, sendo trocado ¼ do volume de água e sedimento a cada 24h. Foi evidenciada indução de dano ao DNA pelas amostras do rio Jacuí, possivelmente relacionado com atividades de extração de carvão nesta região. As amostras do rio Taquari também induziram genotoxicidade, provavelmente como conseqüência da intensa liberação de efluentes da indústria alimentícia na região. Foi possível observar uma fraca relação entre a presença de elementos inorgânicos, detectada pelo método de PIXE (Próton Induced X Ray Emission), no corpo mole dos moluscos e a indução de danos ao DNA. No entanto, mais de 60% dos resultados positivos encontrados em ambos os ensaios, foram relacionados a locais com ampla liberação de esgoto (rio Gravataí, do arroio Dilúvio e os dois locais de coleta no lago Guaíba). Entendendo que a contaminação de origem urbana parece ser o maior problema dentro desta Região Hidrográfica, dois dos locais de coleta que sofrem com esta influência, Guaíba BR e Guaíba PC, foram mais detalhadamente avaliados em duas estações do ano, inverno e verão. Amostras de água superficial e de lixiviado de sedimento foram testadas por método direto quanto à indução de mutagênese pelo ensaio Salmonella/microsoma. Exemplares de L. fortunei, também foram avaliados em dois tipos de exposição: in situ, onde exemplares coletados diretamente nos locais avaliados foram avaliados sem tratamento no laboratório e exposição em laboratório, onde os animais foram coletados em Itapuã e expostos as amostras em laboratório. Apenas uma amostra de água superficial, Guaíba BR no inverno, apresentou mutagenicidade na linhagem TA98 em presença de ativação metabólica. Esta mesma amostra induziu danos ao DNA, detectados pelo ensaio cometa, em hemócitos de moluscos expostos em laboratório e coletados in situ e também aumentou a freqüência de micronúcleos em animais expostos in situ. As amostras do ponto Guaíba PC induziram aumento significativo de micronúcleos em moluscos expostos tanto em laboratório quanto in situ. A influência de elementos inorgânicos, detectados pelo método de PIXE nas amostras de água e no corpo mole dos moluscos, parece ser menos importante do que a contaminação por compostos orgânicos. Estes resultados salientam a forte influência de contaminantes orgânicos nesta região, destacando o biomonitoramento com o mexilhão dourado como uma importante ferramenta no diagnóstico deste tipo de contaminação.

Junções rasas em Si e SIMOX

Foi estudado o comportamento do As (dopante tipo n) em dois tipos diferentes de substratos de Si: bulk e SIMOX (Separation by IMplanted OXygen). Ambos os substratos receberam uma implantação de 5x1014 cm-2 de As+ com energia de 20 keV. Após as implantações, as amostras foram recozidas por um dos dois processos a seguir: recozimento rápido (RTA, Rapid Thermal Annealing) ou convencional (FA, Furnace Annealing). A caracterização física e elétrica foi feita através do uso de diversas técnicas: SIMS (Secondary Ion Mass Spectrometry), RBS (Rutherford Backscattering Spectrometry), MEIS (Medium Energy Ion Scattering), medidas de resistência de folha, medidas Hall e medidas de perfil de portadores por oxidação anódica. Na comparação entre os substratos SIMOX e Si bulk, os resultados indicaram que o SIMOX se mostrou superior ao Si bulk em todos os aspectos, ou seja, menor concentração de defeitos e menor perda de dopantes para a atmosfera após os recozimentos, maior concentração de portadores e menor resistência de folha. A substitucionalidade do As foi maior no SIMOX após RTA, mas semelhante nos dois substratos após FA. Na comparação entre RTA e FA, o primeiro método se mostrou mais eficiente em todos os aspectos mencionados acima. As explicações para o comportamento observado foram atribuídas à presença de maior concentração de vacâncias no SIMOX do que no Si bulk e à interação destas vacâncias com os dopantes.

Estabelecimento de uma nova metodologia para o cálculo do índice de patoigenicidade em amostras de escherichia coli provenientes da produção de frango de corte

Essa dissertação possui como objetivo traçar, uma nova metodologia de classificação de patogenicidade da Escherichia.coli,.através de um índice no qual, além do número de animais mortos, também foi considerado o tempo de morte e a capacidade da cepa causar lesão compatível à colibacilose em pintos de 1 dia. Para gerar esse critério, foram utilizadas 300 amostras de E.coli oriundas de lotes com lesão de celulite, cama desses mesmos aviários e amostras de quadros respiratórios. Através desse experimento foi possível observar que as amostras de E.coli originadas das camas dos aviários, apresentavam índice de patogenicidade significativamente menor do que aquelas isoladas das lesões cutâneas e de quadros respiratórios.Também foi associado às cepas de E.coli a capacidade de causar lesões de: pericardite, perihepatite, aerossaculite, peritonite e celulite. Dentre as lesões citadas somente a celulite foi considerada de apresentação significativamente mais freqüente em comparação às outras.

Isolamento e identificação de amebas de vida livre potencialmente patogênicas em amostras de ambientes do Hospital de Clínicas de Porto Alegre - RS

Amebas de vida livre (AVL), tais como Acanthamoeba spp., Naegleria spp. e Balamuthia mandrillaris, são potenciais agentes de infecções humanas podendo ser encontradas no meio ambiente como solo, água fresca e ar atmosférico. No Brasil, de um modo geral, há poucos trabalhos relatando a importância do estudo desses patógenos em ambientes hospitalares. Assim este trabalho visou estudar a presença de Acanthamoeba spp. e Naegleria spp. na poeira e biofilmes de 15 ambientes diferentes (CTI, UTI pediátrica, Centro Cirúrgico, Centro Cirúrgico Ambulatorial, Emergência, Cozinha, Reservatórios de Azulejo e de Concreto, 06 Bebedouros e 01 Torneira) do Hospital de Clínicas de Porto Alegre, RS (HCPA). Coletas mensais de poeira e biofilmes foram realizadas com suabes passados aleatoriamente nos locais de coleta, de julho de 2004 e março de 2005, totalizando 135 amostras. Após sedimentação do material, o sedimento foi usado como inóculo em placas de Petri com ágar não nutriente 1,5%, previamente inoculadas com E. coli. As amostras foram incubadas durante 10 dias a 30°C. Das 135 amostras coletadas dos 15 ambientes do HCPA, 47 (35%) foram positivas para AVL, segundo critérios morfológicos de Page. Destas, 34% apresentaram características morfológicas próprias do gênero Acanthamoeba, sendo 03 desses isolados confirmados por PCR.

Desenvolvimento e validação de método analítico para quantificação da boldina em peumus boldus mol. (monimiaceae) e avaliação preliminar de sua estabilidade

Peumus boldus Molina (Monimiaceae) é uma árvore comum e abundante no Chile, e suas folhas são amplamente empregadas pela medicina tradicional para o tratamento de uma variedade de afecções do sistema digestivo e hepatobiliar. Seus principais constituintes químicos são alcalóides do tipo aporfínicos, sendo a boldina seu maior e mais característico representante, cujas propriedades antioxidantes são extensivamente relatadas na literatura, servindo desta forma como marcador químico para a espécie. Com o objetivo de contribuir com parâmetros de controle de qualidade, um estudo botânico macro e microscópico das folhas e do pó da espécie foi realizado. Características morfológicas, identificadas pela análise macroscópica, como pilosidade, tipologia dos tricomas, proeminência ao redor da base dos tricomas e aparência do bordo, e características microscópicas como estômatos anomocíticos, folha hipoestomática e ocorrência de cristais de oxalato de cálcio denotam valor taxonômico. Parâmetros farmacopéicos como cinzas totais e perda por dessecação foram determinados, e um método de quantificação da boldina foi desenvolvido e validado utilizando a CLAE. O limite mínimo de boldina observado na análise de 10 amostras adquiridas foi de aproximadamente 0,016%. A fim de avaliarse o comportamento de seus constituintes químicos frente a variações de temperatura e umidade, realizou-se estudo de estabilidade acelerada (40ºC ± 2ºC / 75% ± 5% U.R.). A degradação máxima de boldina foi observada após 90 dias em câmara climática chegando a aproximadamente 52%. A reação de degradação sugerida foi de segunda ordem, e o tempo de vida útil e meia-vida calculados foram de aproximadamente 18 dias e 165 dias, respectivamente. Por fim, realizou-se a quantificação de alguns metais pesados nas folhas da espécie, que decresceram na ordem de Fe> Mn> Cu> Ni, sendo que Pb, Cr e Co tiveram níveis abaixo do limite de detecção de 5 μg/g.

Detecção de Chlamydia trachomatis em amostras cervicais por reação em cadeia da polimerase

Chlamydia trachomatis é o agente causal de uma das infecções sexualmente transmissíveis (IST) mais prevalentes da atualidade. Os maiores problemas no controle desta IST estão no caráter assintomático da infecção e no seu difícil diagnóstico laboratorial. Com o advento dos testes moleculares, grandes avanços ocorreram na área do diagnóstico laboratorial da infecção clamidial. O presente trabalho teve por objetivo desenvolver um método de detecção de C. trachomatis por PCR a partir de amostras cérvico-vaginais. A seqüência alvo escolhida para amplificação consiste de um segmento da ORF 4 do plasmídio críptico de ocorrência natural nesta bactéria. Noventa e duas amostras cérvico-vaginais foram submetidas ao protocolo de PCR in house proposto. Os produtos de PCR foram detectados por visualização direta após eletroforese em gel de agarose com brometo de etídio e por exposição radiográfica após hibridização com sonda homóloga. As amostras foram testadas paralelamente pelo método de captura híbrida para detecção de C. trachomatis. O kit COBAS Amplicor (Roche) foi utilizado para resolver resultados discrepantes. A seqüência do fragmento de 201pb foi confirmada por clivagem enzimática e por seqüenciamento. O teste de especificidade dos primers confirmou especificidade dos mesmos frente ao DNA de diferentes agentes patogênicos e da flora normal feminina. Do total de amostras analisadas, 50 foram positivas por captura híbrida, 51 foram positivas por PCR in house e 67 positivaram após hibridização.O teste de McNemar indicou haver concordância entre os métodos analisados dois a dois (P<0,001). Verificou-se concordância moderada nos comparativos entre captura híbrida e PCR (valor de Kappa: 0,45; DP 0,093), captura híbrida e hibridização (valor de kappa: 0,389; DP 0,091) e, PCR e hibridização (valor de Kappa: 0,634: DP 0,077). O método de PCR in house proposto para a detecção de C. trachomatis é uma técnica rápida e de baixo custo para o diagnóstico, controle e monitoramento dos casos da infecção. Estudos complementares, no entanto, são necessários para implementação deste teste em laboratórios da rede pública.