Toxicidade induzida pelos peptídeos AB42 e AB25-35 em modelo de cultura organotípica de hipocampo de ratos

O crescimento da expectativa de vida média da população mundial tem sido acompanhado do aumento na prevalência de doenças neurodegenerativas, como a doença de Parkinson, isquemia cerebral e, especialmente, a doença de Alzheimer. A doença de Alzheimer (DA) caracteriza-se por um crescente declínio na função mental e memória do paciente. Estes sintomas são explicados por uma profunda perda neuronal e pela presença de alterações estruturais no tecido cerebral: as placas senis, extracelulares e os emaranhados neurofibrilares, intracelulares. O passo que desencadeia a neurodegeneração na DA é ainda objeto de estudo, mas a hipótese mais aceita atualmente é a de que a secreção anormal do peptídeo β amilóide (Aβ), principal componente das placas senis, dê início ao processo. O presente trabalho teve como objetivos investigar a toxicidade induzida pelo peptídeo Aβ1-42 e seu fragmento, o peptídeo Aβ25-35 em culturas organotípicas de hipocampo de ratos. Na primeira parte do trabalho, investigamos a toxicidade induzida pela exposição de culturas organotípicas de hipocampo de ratos a 10 ou 20 μM do peptídeo Aβ1-42, por 24 ou 72 h. Além disso, investigamos o envolvimento das proteínas iNOS e GSK-3β no mecanismo de morte celular induzida pelo peptídeo Aβ1-42. Na segunda parte do trabalho, investigamos a toxicidade induzida pelo fragmento Aβ25-35 na concentração de 25 μM, nos tempos de 1, 3, 6, 12, 24 ou 48 h de exposição às culturas organotípicas, e seu efeito sobre as proteínas Akt, GSK-3β e PTEN. A morte celular foi quantificada pela incorporação do iodeto de propídeo, corante marcador excluído de células sadias, e as proteínas foram quantificadas por imunodetecção com o uso de anticorpos específicos. Nossos resultados mostraram que o peptídeo Aβ1-42 apresentou toxicidade nas concentrações de 10 e 20 μM, induzindo a uma considerável morte celular após 72 h de exposição. A análise do imunoconteúdo da proteína iNOS mostrou um aumento significativo em relação ao controle, após 72 h de exposição ao peptídeo e na concentração de 20 μM. Os resultados obtidos na segunda parte do trabalho mostraram uma morte celular significativa apenas após 48 h de exposição ao peptídeo Aβ25- 35 na concentração de 25 μM. O tratamento com peptídeo Aβ25-35 levou ao aumento no estado de fosforilação da proteína Akt após 6 h de exposição e também da proteína GSK-3β, um potencial substrato da Akt. Após 12 h de exposição ao peptídeo, observamos uma diminuição de ambas as proteínas (Akt e GSK-3β). Porém, após 24 h de exposição ao peptídeo, a proteína Akt continua menos fosforilada enquanto que a proteína GSK-3β apresenta um novo pico de fosforilação. O imunoconteúdo da proteína fosfatase PTEN apresentou um aumento significativo em 24 h e 48 h. Os resultados do presente estudo mostraram que o tratamento das culturas organotípicas de hipocampo de ratos com o peptídeo Aβ1-42 como com o fragmento Aβ25-35 apresentou toxicidade após um período de aproximadamente 48 h de tratamento, e mostrou ser um bom modelo para o estudo de sua toxicidade. Com relação ao mecanismo investigado, os dados sugerem que a proteína iNOS pode estar envolvida na toxicidade induzida pelo peptídeo Aβ1-42. Além disso, sugerem que o fragmento Aβ25-35 possa exercer sua toxicidade através da inibição da via de sobrevivência celular PI3-K, por diminuir a fosforilação/ativação da proteína Akt, parecendo envolver a proteína fosfatase PTEN, principal regulador negativo da via PI3-K/Akt.

Desenvolvimento e validação de método analítico para quantificação da boldina em peumus boldus mol. (monimiaceae) e avaliação preliminar de sua estabilidade

Peumus boldus Molina (Monimiaceae) é uma árvore comum e abundante no Chile, e suas folhas são amplamente empregadas pela medicina tradicional para o tratamento de uma variedade de afecções do sistema digestivo e hepatobiliar. Seus principais constituintes químicos são alcalóides do tipo aporfínicos, sendo a boldina seu maior e mais característico representante, cujas propriedades antioxidantes são extensivamente relatadas na literatura, servindo desta forma como marcador químico para a espécie. Com o objetivo de contribuir com parâmetros de controle de qualidade, um estudo botânico macro e microscópico das folhas e do pó da espécie foi realizado. Características morfológicas, identificadas pela análise macroscópica, como pilosidade, tipologia dos tricomas, proeminência ao redor da base dos tricomas e aparência do bordo, e características microscópicas como estômatos anomocíticos, folha hipoestomática e ocorrência de cristais de oxalato de cálcio denotam valor taxonômico. Parâmetros farmacopéicos como cinzas totais e perda por dessecação foram determinados, e um método de quantificação da boldina foi desenvolvido e validado utilizando a CLAE. O limite mínimo de boldina observado na análise de 10 amostras adquiridas foi de aproximadamente 0,016%. A fim de avaliarse o comportamento de seus constituintes químicos frente a variações de temperatura e umidade, realizou-se estudo de estabilidade acelerada (40ºC ± 2ºC / 75% ± 5% U.R.). A degradação máxima de boldina foi observada após 90 dias em câmara climática chegando a aproximadamente 52%. A reação de degradação sugerida foi de segunda ordem, e o tempo de vida útil e meia-vida calculados foram de aproximadamente 18 dias e 165 dias, respectivamente. Por fim, realizou-se a quantificação de alguns metais pesados nas folhas da espécie, que decresceram na ordem de Fe> Mn> Cu> Ni, sendo que Pb, Cr e Co tiveram níveis abaixo do limite de detecção de 5 μg/g.

Caracterização de fungos micorrízicos arbusculares autóctones de parreirais da Serra Gaúcha e otimização de métodos de multiplicação em espécies aromáticas para aplicação na fruticultura

Este estudo teve por objetivos realizar a caracterização morfológica e molecular dos fungos micorrízicos arbusculares (FMA) autóctones de parreirais da Serra Gaúcha; a otimização do método de produção de inóculos de FMA em plantas aromáticas; além de verificar a eficiência destes inóculos em porta-enxertos de plantas frutíferas. Coletouse solo rizosférico e raízes secundárias de videira em vinte parreirais distribuídos em cinco cidades da Serra Gaúcha (Bento Gonçalves, Caxias, Garibaldi, Nova Pádua e Farroupilha), amostrando-se quatro parreirais por município. A identificação morfológica dos esporos presentes nas amostras foi realizada através de microscopia óptica. A caracterizarão molecular foi realizada por PCR-TTG e seqüenciamento da região rDNA 18S dos esporos previamente identificados pela microscopia. Para a PCR foi utilizado DNA oriundo dos esporos isolados e também de macerado de raízes. Pelo método morfológico, identificaram-se 33 espécies distribuídas em 8 gêneros distintos de FMA. Obtiveram-se quatro perfis moleculares por PCR -TTGE do rDNA 18S de raízes e cinco perfis moleculares por PCR -TTGE do rDNA 18S de esporos das espécies. Através do alinhamento de seqüências obtidas da região de rDNA 18S com as seqüências depositadas no banco de dados NCBI foi possível identificar 7 espécies de FMA. Foram testadas três espécies de plantas aromáticas, hortelã pimenta (Mentha piperita L.), orégano (Origanum vulgare L.) e melissa (Melissa officinalis L.) como multiplicadoras de três espécies de FMA (Glomus clarum Nicol. & Schenck, Glomus etunicatum Becker & Gerd. e Acaulospora sp.) em dois volumes de recipiente (bandeja de isopor com alvéolo de 40 ml e bandeja de isopor com alvéolo de 100 ml). Verificouse a eficiência das plantas aromáticas para produzirem os inóculos destas três espécies de FMA, na colonização do sistema radicular e no desenvolvimento vegetativo de portaenxertos de videira (cv. SO4), citros (cv. Citrange Troyer) e, como dados complementares, em pessegueiro (cv. Okinawa). As plantas aromáticas estudadas multiplicaram com sucesso as espécies de FMA, sendo o inóculo gerado pelas mesmas eficiente em colonizar os porta-enxertos Citrange Troyer, SO4 e Okinawa, propiciando, inclusive, melhor desenvolvimento vegetativo aos dois últimos.