Determinação da uréia sérica como medida de valor biológico de proteína para cães em crescimento

Este trabalho utilizou a medida da uréia sérica para a predição do valor biológico de proteína para cães. Foram utilizados nove cães filhotes, que foram submetidos a três diferentes experimentos. No primeiro experimento o objetivo foi determinar o pico máximo de uréia plasmática após a alimentação. Os animais foram alimentados com uma dieta contendo 30% de proteína. Após a alimentação os animais foram submetidos a cinco coletas de sangue, realizadas em um espaço de 1h entre cada coleta. Este experimento determinou, de forma significativa, que o pico máximo de uréia após a alimentação é 3:01h. Portanto este foi o horário para a coleta nos experimentos subseqüentes. No segundo experimento os animais foram alimentados com dietas contendo níveis crescentes de proteína, objetivando relacionar diferentes níveis de proteína, com valores de uréia sérica. Foram utilizadas dietas contendo 19, 24, 30, 36, e 41% de proteína. Foi demonstrado, de forma significativa (P<0,001), um crescimento linear nos níveis de uréia plasmática a medida em que aumentou o teor de proteína. O terceiro experimento relacionou diferentes níveis de inclusão de aminoácidos com os seus respectivos níveis resultantes de uréia plasmática. Foram utilizadas relações met-cis/lisina de 0,58, 0,62, 0,66 e 0,70. Foi demonstrado, de forma significativa (P<0,0001), que aumentando-se à inclusão de aminoácidos, diminuíram linearmente os níveis de uréia sérica, supondo que níveis maiores de inclusão de aminoácidos possam vir a ser benéficos para cães em crescimento.

O polimorfismo T102C do receptor serotonérgico 5-HT2A participa na manutenção do tabagismo e dos mecanismos de preferência alimentar

A serotonina tem sido relacionada aos comportamentos apetitivo, emocional, motor, cognitivo e autonômico. Os neurônios serotonérgicos estão localizados nos núcleos da rafe, projetam-se para todas as regiões do sistema nervoso central e atuam através de sete tipos de receptores diferentes (5-HT1-7). Os receptores do tipo 2 são categorizados em 3 sub-tipos (A, B e C). Os receptores 5-HT2A são receptores pós sinápticos que promovem a ativação da fosfolipase C, responsável pela hidrólise de fosfolipídios da membrana neuronal, dando origem aos segundos mensageiros diacilglicerol e trifosfato de inositol. O gene do receptor 5-HT2A apresenta alguns polimorfismos, entre os quais o T102C, onde na posição 102 pode estar ou uma timina (T) ou uma citosina (C). Este polimorfismo, apesar de não determinar uma alteração na seqüência de amionoácidos que compõem o receptor determina sua expressão em quantidade diferente. Nesta tese, o polimorfismo T102C do gene do receptor 5-HT2A foi empregado como uma ferramenta para o estudo da neuroquímica do tabagismo e do comportamento alimentar. No estudo acerca do tabagismo, um grupo de 625 sujeitos foi genotipado e classificado de acordo com seu comportamento em relação ao fumo (fumantes atuais, exfumantes ou não fumantes). Foram encontradas diferenças na distribuição dos genótipos quando fumantes atuais foram comparados com ex-fumantes e não fumantes, sugerindo que o polimorfismo T102C está associado com a manutenção, e não o início, do hábito de fumar. O genótipo CC era mais freqüente nos fumantes atuais do que nos ex-fumantes e não fumantes. No estudo sobre o comportamento alimentar, um grupo de 240 sujeitos idosos foi genotipado e sua dieta espontânea foi avaliada tanto quanto ao conteúdo de macro quanto de micro-nutrientes. Foram encontradas diferenças na dieta relacionadas ao polimorfismo T102C. Os indivíduos TT comem uma maior quantidade e proporção de proteínas, apesar de não alterar a quantidade de calorias ingeridas. Eles ingerem mais carne vermelha todos os aminoácidos essenciais. Concluindo, através de um instrumento da genética molecular que identifica sujeitos com suscetibilidade para terem uma menor ou maior quantidade de receptores 5-HT2A, para o qual não há agonistas específicos, é possível sugerir o provável envolvimento deste receptor tanto nos mecanismos de manutenção da adição ao tabaco quanto nos de preferência alimentar.

Efeitos do estresse hipo e hiperosmótico sobre as características do receptor à insulina e sobre a captação de glicose em branquias do caranguejo Chasmagnathus granulata

Neste trabalho investigou-se as características do receptor à insulina e a capacidade de captação de glicose nas brânquias do caranguejo Chasmagnathus granulata aclimatado a diferentes tempos (24, 72 e 144 horas) de estresse hiper e hiposmótico. Primeiramente, o cDNA do receptor para insulina foi parcialmente clonado e seqüenciado em brânquias posteriores de Chasmagnathus granulata. A seqüência peptídica mostrou a presença de 39 aminoácidos e foi designada CGIRLTK (C. granulata insulina receptor-like tyrosine kinase). Esta seqüência apresentou significativa homologia com o domínio tirosina quinase da subunidade b dos receptores para insulina de mamíferos (69%) e de Drosophila (74%). Sítios de ligação à insulina foram caracterizados nas membranas plasmáticas das brânquias através do estudo de ligação com 125I-insulina. A atividade tirosina quinase foi determinada pela capacidade do CGIRLTK de fosforilar o substrato sintético poly (Glu; Tyr 4:1). A captação de glicose foi avaliada pela captação de [14C] 2-deoxi-D-glicose pelo tecido branquial. Nas brânquias posteriores a insulina bovina estimulou significativamente a fosforilação do CGIRLTK nos animais aclimatados a 20‰ de salinidade (controle), já nas brânquias anteriores este estímulo não foi observado. O estresse hiperosmótico (34 ‰ de salinidade) levou a uma diminuição do número e da afinidade dos receptores à insulina nas brânquias posteriores, bem como a uma redução na atividade tirosina quinase. A captação de glicose não mudou durante os tempos de estresse osmótico estudados Esses resultados mostram que o estresse hiperosmótico modifica a sinalização da insulina, causando um estado de resistência à insulina nas brânquias posteriores. Nenhuma mudança foi observada na concentração dos receptores à insulina nas brânquias posteriores de caranguejos aclimatados durante 24 horas ao estresse hiposmótico (0‰). Contudo, foi observada uma redução na afinidade dos receptores pela insulina bovina. A fosforilação do CGIRLTK diminui às 24 horas de estresse e retornou aos valores basais às 144horas. A captação de glicose não foi alterada significativamente. Os resultados sugerem que o estresse hiposmótico modifica as características do CGIRLTK nas brânquias posteriores de C. granulata de forma tempo-dependente. Essas mudanças são parte dos ajustes necessários à sobrevivência à baixa salinidade. Nas brânquias anteriores, durante aclimatação ao estresse hiperosmótico, foi observada redução da concentração e da capacidade de fosforilação dos receptores insulínicos. Contudo, a insulina bovina não estimulou a fosforilação nas brânquias anteriores durante o estresse Nenhuma alteração foi observada na concentração e na afinidade de receptores à insulina nas brânquias anteriores após 24 horas de estresse hiposmótico. A fosforilação do receptor à insulina diminuiu após 24 horas de estresse e voltou aos valores basais após 72 horas. A capacidade de captação de glicose, por sua vez, não foi modificada em função de mudanças na osmoliridade do ambiente. Assim como no estresse hiperosmótico, a insulina bovina não estimulou a fosforilação nas brânquias anteriores no estresse hiposmótico. Os resultados deste trabalho demonstram que o estresse osmótico modifica as características do CGILRTK e conseqüentemente a transdução do sinal insulínico nas brânquias. As respostas às alterações de salinidade dependem do tipo de estresse ao qual o animal é submetido e da brânquia estudada (anterior ou posterior). As mudanças observadas no sinal insulínico fazem parte dos ajustes necessários para a regulação osmótica frente às mudanças ambientais de salinidade.

Características de crescimento de dois cruzamentos de frangos de corte recebendo dietas com diferentes níveis de lisina na primeira semana de vida

Dois experimentos foram conduzidos para avaliar o efeito do fornecimento de diferentes níveis de lisina na dieta pré-inicial sobre o crescimento e o desenvolvimento muscular de frangos de corte. No primeiro, dois cruzamentos (Cobb x Cobb 500 e Ross x Ross 308) de frangos de corte machos foram alimentados com dietas possuíndo níveis crescentes de lisina digestível (0,82%, 0,99%, 1,16% e 1,33%) e balanceamento ideal entre os aminoácidos essencias. A partir dos 8 dias de idade até 7 semanas, todas as aves receberam uma mesma dieta comercial. Cobb e Ross apresentaram diferentes curvas de crescimento sob diferentes níveis de lisina. O nível de 1,16% de lisina digestível apresentou impacto positivo no Cobb com maior taxa de maturidade e o menor tempo para alcançar a taxa máxima de crescimento. A avaliação dos coeficientes alométricos mostrarou que o nível de 0,82% de lisina disgestível resultou em amadurecimento tardio do peito desossado e do peitoral maior. O Cobb apresentou empenamento precoce comparado ao Ross. No segundo experimento, o efeito do jejum e de diferentes níveis de lisina digestível (0,82%, 0,99%, 1,16% e 1,33%), possuindo balanceamento ideal entre os aminoácidos essenciais, sobre a atividade mitótica das células satélites foi estudado em frangos de corte aos 3 dias de idade. Todas as aves foram injetadas com 5-Bromo-2´-deoxyuridine (BrdU) 2 horas antes de serem sacrificadas. No final do experimento, as aves foram abatidas e o músculo peitoral foi removido, fixado, desidratado, clarificado e embebido em parafina. As células satélites mitoticamente ativas foram identificadas através do método de imunohistoquímica utilizando-se BrdU e contadas utilizando-se análise de imagens por computador. A atividade mitótica nas aves em jejum foi significativamente menor quando comparada aos demais tratamentos. A atividade mitótica foi maior para o tratamento com 0,82% de lisina digestível. A área de secção transversal foi menor no grupo em jejum comparada aos demais tratamentos. A maior atividade mitótica das células satélites, observada no tratamento com 0,82% de lisina digestível, pode estar indicando um atraso no amadurecimento do músculo, através de um período mais longo de ativação das células satélites.

Efeito do tempo de autoclavagem sobre a digestibilidade dos grãos de soja integral em suínos na fase de crescimento

Foram conduzidos dois ensaios de metabolismo com suínos em crescimento para avaliar o efeito do tratamento térmico sobre a digestibilidade de grão de soja integral. No ensaio 1 foram utilizados 18 animais distribuídos em 6 dietas, à base de amido de milho e grão de soja, em um arranjo fatorial 3*2, composto por três tratamentos de calor submetidos ao grão (cru, AUTOCLAVADO e AUTOCLAVADO o dobro tempo) e dois níveis de lisina (85 e 100% das exigências do NRC (1988)). No ensaio 2 foram utilizados 18 suínos distribuídos em 18 dietas, à base de amido de milho e grão de soja (autoclavado ou autoclavado o dobro tempo) em um arranjo fatorial 3x3x2, composto por três níveis de lisina (80, 100 e 120% NRC (1988)), três suplementações de aminoácidos (0, metionina e treonina) dois tempos de tratamento térmico (autoclavado e dobro do tempo). No ensaio 1 foi observado efeito do tratamento térmico (P< 0,004) e do nível de lisina (P= 0,009) sobre o ganho de peso e do tratamento térmico (P= 0,006) sobre o consumo de matéria seca. Não foram observados efeitos do tratamento térmico e do nível de lisina sobre os coeficientes de digestibilidade da matéria seca, da proteína e da energia das dietas. No ensaio 2 foi observado efeito do nível de lisina (P= 0,008) sobre a excreção fecal de proteína bruta e de energia bruta (P= 0,003) e do tratamento térmico sobre a excreção fecal da energia bruta (P= 0,04).

Purificação e caracterização da microfilina, o segundo inibidor de trombina da saliva do carrapato Boophilus microplus

A saliva do carrapato bovino Boophilus microplus contém dois inibidores de trombina: o BmAP e a microfilina. Este trabalho apresenta a purificação e a caracterização deste último anticoagulante. A microfilina foi purificada da saliva por cromatografia de gel filtração, ultrafiltração em membrana de exclusão de 3 kDa e cromatografia de afinidade em trombina-Sepharose. A análise por espectrometria de massas mostrou uma massa molecular de 1770 Da. Com uma composição de 16 aminoácidos, a microfilina é o segundo menor inibidor peptídico de trombina já descrito. A microfilina inibe a fibrinocoagulação e a agregação plaquetária induzida por trombina com IC50 de 5 M. Como ela não inibe a atividade amidolítica da enzima sobre S2238, mas inibe a hidrólise de um substrato sintético longo que interage com o exosítio I da trombina, o mecanismo de ação proposto para a microfilina é o bloqueio do exosítio I da enzima. A microfilina é resistente à temperatura e não inibe a atividade amidolítica de fXa, plasmina, proteína C ativada, uroquinase, quimiotripsina e tripsina. O estudo mais detalhado da microfilina permitirá sua avaliação como antígeno contra o carrapato e/ou como droga antitrombótica.

Avaliação nutricional de ratos Wistar de 21 dias de idade cujas mães foram alimentadas com dietas contendo farelo de arroz

O farelo de arroz (FA) é constituido a partir do processo de beneficiamento do arroz, onde são extraídos do grão o germe, a película e a casca, ou seja, o maior conteúdo nutricional do grão se transforma em farelo. O farelo de arroz possui todos os aminoácidos essenciais, com exceção da lisina que se encontra em quantidade insuficiente. Também contém substâncias químicas com efeito hipocolesterolêmico, podendo se tornar um grande aliado contra as doenças cardiovasculares. Considerando a importância da nutrição no desenvolvimento e na organização do sistema nervoso central e seu reflexo nos processos de aprendizagem e memória faz-se necessários estudos sobre o efeito nutricional do farelo de arroz, pois o mesmo está sendo utilizado como suplemento alimentar na merenda escolar em escolas municipais da região centro-sul do estado (Camaquã, São Lourenço do Sul, Pelotas, e outros municípios adjacentes). Portanto, o objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito nutricional e hipocolesterolêmico do farelo de arroz sobre o desenvolvimento de ratos Wistar lactentes. Foram utilizados filhotes de ratas Wistar no período pós-natal, cujas mães receberam durante 21 dias as seguintes dietas: dieta comercial (dieta controle), dieta com FA soja c/lis, FA soja s/lis, FA c/lis e FA s/lis, ração e água ad labitum. As avaliações ponderais e bioquímicas foram realizada nos filhotes no 21º dia de vida e no final do período de lactação. Os resultados obtidos a partir das dosagens bioquímicas e avaliação ponderal foi possível observar algumas alterações que provocaram um atraso no crescimento e desenvolvimento dos filhotes, devido à desnutrição em que eles se apresentaram, quando suas mães foram submetidas à dieta com 92% de farelo de arroz (FA s/lis). Quando adicionado lisina à dieta houve uma resposta positiva, melhorando o quadro nutricional dos animais, porém muito inferior ainda em relação à dieta comercial. A suplementação de proteína de soja (92% pureza) restabeleceu o crescimento e desenvolvimento físico dos filhotes. Sendo assim, as dietas influenciaram diretamente a composição do leite materno, refletindo no estado nutricional dos filhotes.

Produção de hidrolisados protéícos de penas de frango utilizando bactérias queratinolíticas.

Com o crescimento populacional, a indústria avícola tem se desenvolvido rapidamente, devido à demanda de alimentos. O seu produto possui grande aceitação no mercado mundial, em função do seu valor nutricional e por não existirem restrições culturais. Entretanto, este alimento gera grande quantidade de resíduos, dentre eles, as penas. Elas são compostas principalmente por queratina, substância de difícil degradação. Neste trabalho foram utilizadas duas bactérias queratinolíticas de resíduos da indústria avícola, para se avaliar a capacidade de degradação das mesmas. Foram produzidos hidrolisados de penas por proteólise bacteriana com ambos microrganismos: Bacillus cereus (KR16) e Chryseobacterium sp. (KR6). O crescimento das bactérias em diferentes quantidades de penas, e o fator de degradação das penas comprovaram que em até 5 % obteve-se degradação para KR6, enquanto, para a KR16, obteve-se degradação até 1%. A digestibilidade in vitro dos hidrolisados foi avaliada. Observou-se que o hidrolisado da bactéria KR6 apresentou maior digestibilidade, enquanto o de farinha de penas apresentou o menor valor. A composição de aminoácidos dos hidrolisados foi determinada, sendo observadas baixas concentrações de metionina, histidina e lisina. A partir da digestibilidade in vitro e da composição de aminoácidos, foram calculados o escore de aminoácidos corrigidos (PDCAAs), o coeficiente de eficiência protéica (PER) e o valor biológico (BV). O tratamento das penas com KR6 resultou em hidrolisados com os valores mais altos de PDCAAs, PER e BV, sugerindo que este microrganismo produz hidrolisados com propriedades nutricionais superiores aos demais.

Parâmetros bioquímicos de alterações do citoesqueleto no modelo experimental da doença do Xarope do Bordo

A Doença do Xarope do Bordo (DXB) é um erro inato do metabolismo causado pela deficiência na atividade do complexo desidrogenase dos cetoácidos de cadeia ramificada, levando ao acúmulo de concentrações milimolares dos seguintes α-cetoácidos de cadeia ramificada (CACR): ácidos α-cetoisocapróico (CIC), α-ceto-β-metilvalérico (CMV), α-cetoisovalérico (CIV) e dos seus aminoácidos precursores, leucina, isoleucina e valina em tecidos de pacientes afetados. Essa doença é caracterizada por severos sintomas neurológicos que incluem edema e atrofia cerebral, entretanto, os mecanismos envolvidos na neuropatologia da DXB ainda não são bem estabelecidos. Neste trabalho utilizamos um modelo experimental de DXB com o objetivo de verificar os efeitos dos CACR que se acumulam nessa desordem neurodegenerativa sobre o citoesqueleto de células neurais de ratos. Nesse modelo fatias de córtex cerebral de ratos de diferentes idades, ou culturas de células neurais foram incubados com concentrações variando de 0,1 a 10 mM de cada metabólito. Inicialmente demonstramos que o CIC, CMV e CIV inibiram a captação de glutamato em fatias de córtex cerebral de ratos durante o desenvolvimento. O CIC inibiu a captação de glutamato em ratos de 9, 21 e 60 dias de idade, enquanto o CMV e o CIV inibiram a captação de glutamato em animais de 21 e 60 dias. Observamos que o CIC alterou a fosforilação de proteínas do citoesqueleto de um modo dependente do desenvolvimento através de receptores glutamatérgicos ionotrópicos em fatias de córtex cerebral de ratos. O metabólito causou diminuição da fosforilação dos filamentos intermediários (FI) em ratos de 9 dias de idade e aumento dessa fosforilação em animais de 21 dias de vida. Também demonstramos que em animais de 9 dias de idade o efeito do CIC foi mediado pelas proteínas fosfatases PP2A e principalmente pela PP2B, uma proteína fosfatase dependente de cálcio, enquanto que em animais de 21 dias de idade o efeito deste metabólito foi mediado pela proteína quinase dependente de AMP cíclico (PKA) e pela proteína quinase dependente de cálcio e calmodulina (PKCaMII). Além disso, verificamos que o CIC promoveu um aumento nos níveis intracelulares dos segundos mensageiros AMPc e Ca2+. O aumento do Ca2+ intracelular provocado pelo CIC foi demonstrado pelo uso de bloqueadores específicos de canais de cálcio dependentes de voltagem tipo L, por exemplo, nifedipina, canais de cálcio dependentes de ligantes, por exemplo, NMDA e de quelantes de cálcio intracelular, por exemplo, BAPTA-AM. Por outro lado, o CMV aumentou a fosforilação de FI somente em ratos de 12 dias de idade, sendo esse efeito mediado por receptores GABAérgicos do tipo A e B, desencadeando a ativação das proteínas quinases PKA e PKCaMII. É importante salientar que o CIV não alterou a atividade do sistema fosforilante em nenhuma das idades estudadas. Além dos efeitos causados pelos CACR que se acumulam na DXB sobre a atividade do sistema fosforilante associado aos FI em fatias de córtex cerebral de ratos, demonstramos que esses metabólitos foram capazes de alterar a fosforilação da proteína glial fibrilar ácida (GFAP) na linhagem de glioma C6. Essa alteração de fosforilação causou uma reorganização do citoesqueleto de GFAP e um aumento no imunoconteúdo da GFAP na fração citoesquelética. Também verificamos que o CIC, o CMV e o CIV, em concentrações encontradas em pacientes portadores de DXB, levaram a uma reorganização dos filamentos de GFAP e do citoesqueleto de actina de astrócitos em cultura, causando uma importante alteração na morfologia destas células. As alterações do citoesqueleto levaram a morte celular progressiva quando os astrócitos foram expostos por várias horas aos metabólitos. Demonstramos também que os efeitos dos CACR sobre a morfologia dos astrócitos foram desencadeados por mecanismos de membrana que diminuíram a atividade da Rho GTPase. Esse mecanismo foi evidenciado utilizando-se ácido lisofosfatídico (LPA), um ativador específico da RhoA, o qual preveniu os efeitos causados pelos CACR em culturas de astrócitos. É importante salientar que as alterações morfológicas e a morte celular induzida pelos CACR em culturas de astrócitos foram totalmente evitadas com a suplementação de creatina às culturas. Também verificamos que a atividade da creatina quinase foi inibida pelos metabólitos, indicando que a homeostase energética provavelmente estaria envolvida nos efeitos causados pelos CACR. XI Sabe-se que as alterações do citoesqueleto estão relacionadas com inúmeras doenças neurodegenerativas. Portanto, é provável que as alterações causadas pelos CACR nos mecanismos de membrana que regulam níveis de segundos mensageiros intracelulares e cascatas de sinalização celular, na perda do equilíbrio fisiológico do sistema fosforilante associado ao citoesqueleto e conseqüentemente na sua reorganização, possam ter importantes conseqüências para a função neural. Com base nos presentes resultados demonstramos que os CACR que se acumulam na DXB levam à desorganização do citoesqueleto em um modelo experimental podendo ser uma contribuição importante para o estudo da patogênese do sistema nervoso central característica dos pacientes portadores de DXB.

Relações crescentes entre treonina e lisina digestível a partir de l-treonina e farelo de soja para frangos de corte

Foi realizado um experimento com o objetivo de avaliar relações crescentes de treonina para lisina digestível em dietas formuladas com base no conceito de proteína ideal. Para tal, alojou-se 1.600 frangos de corte machos Ross x Ross 308 em arranjo fatorial com 3 relações entre treonina e lisina digestível (0,635; 0,660 e 0,685) e 2 fontes de treonina suplementar (Farelo de Soja (FS) e L-Treonina sintética (L-Thr)) com dois tratamentos controle (positivo e negativo). Assim, o experimento contou com oito tratamentos e oito repetições de 25 aves. Os tratamentos com as respectivas relações treonina:lisina digestível (TLD) e fontes de treonina foram: T1 (controle positivo) com relação TLD de 0,700 (FS+L-Thr); T2 (controle negativo) com relação 0,610 (FS); T3 com relação 0,635 (FS+L-Thr); T4 com relação 0,660 (FS+LThr); T5 com relação 0,685 (FS+L-Thr); T6 com relação 0,635 (FS); T7 com relação 0,660 (FS) e T8 com relação TLD 0,685 (FS). Todas as dietas foram formuladas para apresentarem o mesmo nível mínimo de nutrientes e energia sem restrição para o nível de proteína bruta. Não houve efeito da suplementação de treonina sobre as características avaliadas. Conversão alimentar (P=0,0095) e consumo de água (P=0,0113) foram significativamente melhores para a proteína intacta (FS) comparativamente às dietas com suplementação dos 3 primeiros AA limitantes (L-Thr). Contudo, a característica rendimento de peito apresentou resultado superior (P=0,0351) para as dietas suplementadas com treonina sintética. Não foi observado efeito dos tratamentos sobre as demais respostas estudadas. Desta forma, a menor relação entre treonina e lisina digestível estudada, ou seja, 0,610, foi suficiente para atender as exigências para ótimo desempenho dos frangos de corte dos 15 aos 37 dias de idade. Todavia, para a característica rendimento de peito recomenda-se a relação TLD mínima de 0,635. Em virtude de as melhores respostas terem sido obtidas com as dietas cuja fonte de treonina foi exclusivamente o FS, atribui-se estas respostas ao maior conteúdo de aminoácidos menos limitantes e aminoácidos não-essenciais contidos nas referidas dietas.

Efeitos in vivo e in vitro do ácido glutárico sobre parâmetros bioquímicos do metabolismo energético em cérebro médio, músculo esquelético e músculo cardíaco de ratos jovens

O ácido glutárico (AG) é o principal metabólito acumulado nos tecidos e fluidos corporais de pacientes afetados por acidemia glutárica tipo I (AG I), um erro inato do metabolismo da via catabólica dos aminoácidos lisina, hidroxilisina e triptofano causado pela deficiência severa da atividade da enzima glutaril-CoA desidrogenase. Clinicamente, os pacientes apresentam macrocefalia ao nascimento e uma hipomielinização ou desmielinização progressiva do córtex cerebral. Crises de descompensação metabólica com encefalopatia aguda ocorrem nestes pacientes principalmente entre 3 e 36 meses de vida, levando a uma marcada degeneração estriatal, que é a principal manifestação neurológica da doença. Depois de sofrer essas crises, os pacientes apresentam distonia e discinesia que progridem rapidamente e os incapacita para as atividades normais. Apesar dos sintomas neurológicos severos e achados neuropatológicos com atrofia cerebral, os mecanismos que levam ao dano cerebral na AG I são pouco conhecidos. O objetivo inicial do presente trabalho foi desenvolver um modelo animal por indução química de AG I através da injeção subcutânea do AG em ratos Wistar de forma que os níveis cerebrais deste composto atinjam concentrações similares aos encontrados em pacientes (~0,5 mM) para estudos neuroquímicos e comportamentais. Observamos que o AG atingiu concentrações no cérebro aproximadamente 10 vezes menores do que no plasma e 5 vezes menores do que nos músculos cardíaco e esquelético. O próximo passo foi investigar o efeito desse modelo sobre parâmetros do metabolismo energético no cérebro médio, bem como nos tecidos periféricos (músculo cardíaco e músculo esquelético) de ratos de 21 dias de vida Verificamos que a produção de CO2 a partir de glicose não foi alterada no cérebro médio dos ratos, bem como a atividade da creatina quinase no cérebro médio, músculo cardíaco e músculo esquelético. A atividade do complexo I-III da cadeia respiratória estava inibida em cérebro médio de ratos (25%), enquanto no músculo esquelético estavam inibidas as atividades dos complexos I-III (25%) e II-III (15%) e no músculo cardíaco não foi encontrada nenhuma inibição dos complexos da cadeia respiratória. Em seguida, testamos o efeito in vitro do AG sobre os mesmos parâmetros do metabolismo energético e observamos uma inibição das atividades do complexo I-III (20%) e da sucinato desidrogenase (30%) no cérebro médio na concentração de 5 mM do ácido. A produção de CO2, a partir de glicose e acetato, e a atividade da creatina quinase não foram alteradas pelo AG no cérebro médio dos animais. Assim, concluímos que o AG interfere no metabolismo energético celular, o que poderia explicar, ao menos em parte, a fisiopatogenia da AG I.

Efeito da ingestão crônica de cafeína na atividade de enzimas antioxidantres, peroxidação de lipídeos e na produção de radicais livres em diferentes regiões do sistema nervoso central de ratos adultos

Estresse oxidativo é um desequilíbrio entre a geração de radicais livres e a capacidade de defesa do sistema antioxidante endógeno. Sabe-se também que o acúmulo extracelular de aminoácidos excitatórios leva a uma exacerbada estimulação de seus receptores, provocando insultos oxidativos no cérebro e pode levar a uma série de eventos que podem ser os causadores de diversas patologias como isquemia e doenças neurodegenerativas. A adenosina, ao ligar-se aos seus receptores, age como neuromoduladora da liberação desses neurotransmissores, protegendo as células contra o estresse oxidativo. Alem disso, sabe-se que a ativação de receptores de adenosina promove um aumento da atividade de enzimas antioxidantes. A Cafeína tem sua principal ação farmacológica através do antagonismo não seletivo dos receptores de adenosina, causando o bloqueio dos mesmos, e neste caso leva ao acúmulo de neurotransmissores no meio extracelular. Entretanto em altas concentrações, ela pode, por si só, ter ação antioxidante, “seqüestrando” radicais livres e, desta maneira, protegendo a célula do dano oxidativo. Por outro lado, alguns estudos demonstram que ela também pode ter ação pró-oxidante, quando em presença de altas concentrações de íons cobre e pode ter ação pró-apoptótica, via ativação da caspase 3. O objetivo deste trabalho foi a caracterização do efeito da ingestão crônica de cafeína (1g/L) por 7dias, sobre a atividade de enzimas de defesa antioxidantes (CAT, GSH-Px, SOD) em homogenato de hipocampo, cerebelo e estriado de ratos Wistar adultos. Nós também medimos a produção de radicais livres e a peroxidação de lipídeos Os resultados obtidos demonstraram que cafeína, administrada cronicamente, causa um aumento na peroxidação dos lipídeos de membranas e uma diminuição nas atividades das enzimas antioxidantes SOD e GSH-Px, nas três estruturas analisadas quando comparadas ao controle, porém não foi observada alteração na atividade da catalase. Além disso, não encontramos alteração nos níveis de produção de radicais livres. Portanto, embora alguns trabalhos demonstrem que a ingestão crônica de cafeína pode ter uma ação neuroprotetora, em nosso trabalho nós demonstramos que cafeína pode potencialmente provocar dano celular em estruturas cerebrais através da diminuição das enzimas antioxidantes. Provavelmente, esse efeito seja devido a uma diminuição da expressão e/ou número de receptores de adenosina (A1 ou A2) ou a cafeína está agindo somente como antagonista competitivo, bloqueando a ação da adenosina endógena. Outros experimentos são necessários para comprovar esta hipótese.

Caracterização de genes de quitanases do entomopatógeno e acaricida Metarhizium anisopliae

O fungo entomopatogênico e acaricida Metarhizium anisopliae é patógeno de uma vasta gama de insetos, sendo extensivamente utilizado em experimentos, bem como, no controle efetivo de alguns insetos-praga. Seu potencial uso para o controle de carrapatos como Boophilus microplus é também considerável. O processo de infecção de M. anisopliae é o melhor caracterizado entre os fungos entomopatogênicos, e combina pressão mecânica, por diferenciação do apressório, síntese e secreção de enzimas hidrolíticas altamente reguladas como proteases e, provavelmente, quitinases e lipases. As quitinases em fungos também são importantes em processos que requerem digestão celular, como germinação, crescimento e ramificação das hifas e autólise, visto que a quitina é o maior constituinte da parede celular desses organismos, sendo um sistema altamente regulado. Objetivamos neste trabalho, obter mais informações sobre o sistema quitinolitico do fungo M. anisopliae var. anisopliae linhagem E6 durante o processo de infecção do hospedeiro ou na morfogênese e crescimento. Com o objetivo de analisarmos o gene chi2 de M. anisopliae E6, clonamos e caracterizamos sua seqüência genômica, incluindo a região flanqueadora 5’. O gene chi2 é interrompido por dois pequenos íntrons típicos, de 210 pb e 75 pb, respectivamente. A ORF do gene chi2 apresenta 1.545 pb e codifica uma proteína predita de 419 aminoácidos (denominada CHI2), com massa molecular estimada de 44 kDa. Um peptídeo sinal característico com sítio de clivagem no aminoácido V19 está presente. A forma madura dessa proteína tem uma massa molecular estimada de 42 kDa e um pI teórico de 4,8. Análise por Southern de DNA genômico indica cópia única de chi2 no genoma de M. anisopliae. A seqüência de consenso SXGG, correspondendo ao sítio de ligação à quitina, foi identificada e a seqüência NGFDFDIE, que compõem o domínio catalítico de quitinases, está presente em CHI2. A construção de uma árvore filogenética determinou que a quitinase CHI2 pertence a um grupo diferente daquele da CHIT42 a qual provavelmente não está envolvida na patogenicidade. Uma análise in sílico da seqüência 5’ franqueadora do gene chi2 para determinação de possíveis elementos regulatórios foi efetuada. A regulação da transcrição dos genes chit1 e chi2 em M. ansisoplaie frente a diferentes fontes de carbono e em diferentes tempos de cultivo foi analisada. Os genes chit1 e chi2 apresentaram uma expressão tardia no fungo, a partir de 30 horas. O gene chi2 foi expresso majoritariamente em cultivos com quitina e sua expressão foi reprimida por glicose. O gene chit1 foi induzido em presença de fontes de carbono facilmente assimiláveis, como glicose e NAcGlc. Ambos os genes, chit1 e chi2, apresentaram alta expressão quando a fonte de carbono já estava exaurida e o fungo estava em autólise, sugerindo o requerimento dessas enzimas nessa fase. O cDNA do chit1 foi inserido em um vetor de expressão, em ambas orientações senso e antisenso, sob regulação do promotor do gene tef1α de M. anisopliae e o terminador do gene trpC de A. nidulans. Os transformantes com o gene chit1 na orientação senso mostraram superexpressão de atividade de quitinase e o transformante com o gene na orientação antisenso apresentou uma redução na atividade de quitinase. Também construímos quatro deleções na região flanqueadora 5’ do gene chit1 fusionadas com a proteína repórter SGFP, para localizar seqüências reguladoras no promotor e, destas construções, três foram transformadas em M. anisopliae.

Estudo da adição de aminas em alcinos ativados : preparação de intermediários para a síntese de heterociclos nitrogenados

Neste trabalho estudou-se a adição nucleofílica de aminas secundárias cíclicas (pirrolidina, piperidina e morfolina) e a-aminoácidos (L-prolina e derivados) a alcinos ativados. Em todos os casos obteve-se sempre o aduto de Michael com estereoquímica E independente do alcino ser substituído ou não e das condições reacionais. Este fato evidencia uma adição do tipo sin, cujos possíveis estados de transição são discutidos. As reações de Michael foram sempre realizadas em condições brandas com rendimentos moderados a bons.Foram estudadas várias alternativas para a conversão de compostos enaminocarbonílios derivados da L-prolina a esqueletos do tipo cetopirrolizidínicos substituídos, possíveis precursores de alcalóides da classe das hiacintacinas. As tentativas de anelação direta dos compostos enaminoésteres, tanto em condições térmicas ou de adição-eliminação quanto em reações tandem não lograram sucesso. Estudou-se então condições redutivas (hidrogenação ou adição de hidreto) para obtenção de compostos do tipo aminodiésteres, substratos em ciclização do tipo Dieckmann. Testou-se tanto condições próticas (ROH / RONa) quanto apróticas (LDA, LHMDS), em diferentes solventes e catalisadores e, em todos os casos, obteve-se ou a recuperação do produto de partida ou sua degradação.Construiu-se desta forma intermediários avançados com potencial aplicação na síntese de alcalóides da família das hiacintacinas de forma curta e eficiente.