HLA-A Typing in formalin-fixed paraffin embedded tissue samples : towards potential retrospective analysis

El Antígeno Leucocitario Humano (HLA en inglés) ha sido descrito en muchos casos como factor de pronóstico para cáncer. La característica principal de los genes de HLA, localizados en el cromosoma 6 (6p21.3), son sus numerosos polimorfismos. Los análisis de secuencia de nucleótidos muestran que la variación está restringida predominantemente a los exones que codifican los dominios de unión a péptidos de la proteína. Por lo tanto, el polimorfismo del HLA define el repertorio de péptidos que se unen a los alotipos de HLA y este hecho define la habilidad de un individuo para responder a la exposición a muchos agentes infecciosos durante su vida. La tipificación de HLA se ha convertido en un análisis importante en clínica. Muestras de tejido embebidas en parafina y fijadas con formalina (FFPE en inglés) son recolectadas rutinariamente en oncología. Este procedimiento podría ser utilizado como una buena fuente de ADN, dado que en estudios en el pasado los ensayos de recolección de ADN no eran normalmente llevados a cabo de casi ningún tejido o muestra en procedimientos clínicos regulares. Teniendo en cuenta que el problema más importante con el ADN de muestras FFPE es la fragmentación, nosotros propusimos un nuevo método para la tipificación del alelo HLA-A desde muestras FFPE basado en las secuencias del exón 2, 3 y 4. Nosotros diseñamos un juego de 12 cebadores: cuatro para el exón 2 de HLA-A, tres para el exón 3 de HLA-A y cinco para el exón 4 de HLA-A, cada uno de acuerdo las secuencias flanqueantes de su respectivo exón y la variación en la secuencia entre diferentes alelos. 17 muestran FFPE colectadas en el Hospital Universitario de Karolinska en Estocolmo Suecia fueron sometidas a PCR y los productos fueron secuenciados. Finalmente todas las secuencias obtenidas fueron analizadas y comparadas con la base de datos del IMGT-HLA. Las muestras FFPE habían sido previamente tipificadas para HLA y los resultados fueron comparados con los de este método. De acuerdo con nuestros resultados, las muestras pudieron ser correctamente secuenciadas. Con este procedimiento, podemos concluir que nuestro estudio es el primer método de tipificación basado en secuencia que permite analizar muestras viejas de ADN de las cuales no se tiene otra fuente. Este estudio abre la posibilidad de desarrollar análisis para establecer nuevas relaciones entre HLA y diferentes enfermedades como el cáncer también.

"Refined mapping of a quantitative trait locus on chromosome 1 responsible for mouse embryonic death"

Recurrent spontaneous abortion (RSA) is defined as the loss of three or more consecutive pregnancies during the first trimester of embryonic intrauterine development. This kind of human infertility is frequent among the general population since it affects 1 to 5% of women. In half of the cases the etiology remains unelucidated. In the present study, we used interspecific recombinant congenic mouse strains (IRCS) in the aim to identify genes responsible for embryonic lethality. Applying a cartographic approach using a genotype/phenotype association, we identified a minimal QTL region, of about 6 Mb on chromosome 1, responsible for a high rate of embryonic death (,30%). Genetic analysis suggests that the observed phenotype is linked to uterine dysfunction. Transcriptomic analysis of the uterine tissue revealed a preferential deregulation of genes of this region compared to the rest of the genome. Some genes from the QTL region are associated with VEGF signaling, mTOR signaling and ubiquitine/proteasome-protein degradation pathways. This work may contribute to elucidate the molecular basis of a multifactorial and complex human disorder as RSA.

"Genome-Wide Linkage in a Highly Consanguineous Pedigree Reveals Two Novel Loci on Chromosome 7 for Non-Syndromic Familial Premature Ovarian Failure"

Background: The human condition known as Premature Ovarian Failure (POF) is characterized by loss of ovarian function before the age of 40. A majority of POF cases are sporadic, but 10–15% are familial, suggesting a genetic origin of the disease. Although several causal mutations have been identified, the etiology of POF is still unknown for about 90% of the patients. Methodology/Principal Findings: We report a genome-wide linkage and homozygosity analysis in one large consanguineous Middle-Eastern POF-affected family presenting an autosomal recessive pattern of inheritance. We identified two regions with a LODmax of 3.26 on chromosome 7p21.1-15.3 and 7q21.3-22.2, which are supported as candidate regions by homozygosity mapping. Sequencing of the coding exons and known regulatory sequences of three candidate genes (DLX5, DLX6 and DSS1) included within the largest region did not reveal any causal mutations. Conclusions/Significance: We detect two novel POF-associated loci on human chromosome 7, opening the way to the identification of new genes involved in the control of ovarian development and function.

Plasmodium vivax lineages: geographical distribution, tandem repeat polymorphism, and phylogenetic relationship

Background: Multi-drug resistance and severe/ complicated cases are the emerging phenotypes of vivax malaria, which may deteriorate current anti-malarial control measures. The emergence of these phenotypes could be associated with either of the two Plasmodium vivax lineages. The two lineages had been categorized as Old World and New World, based on geographical sub-division and genetic and phenotypical markers. This study revisited the lineage hypothesis of P. vivax by typing the distribution of lineages among global isolates and evaluated their genetic relatedness using a panel of new mini-satellite markers. Methods: 18S SSU rRNA S-type gene was amplified from 420 Plasmodium vivax field isolates collected from different geographical regions of India, Thailand and Colombia as well as four strains each of P. vivax originating from Nicaragua, Panama, Thailand (Pak Chang), and Vietnam (ONG). A mini-satellite marker panel was then developed to understand the population genetic parameters and tested on a sample subset of both lineages. Results: 18S SSU rRNA S-type gene typing revealed the distribution of both lineages (Old World and New World) in all geographical regions. However, distribution of Plasmodium vivax lineages was highly variable in every geographical region. The lack of geographical sub-division between lineages suggests that both lineages are globally distributed. Ten mini-satellites were scanned from the P. vivax genome sequence; these tandem repeats were located in eight of the chromosomes. Mini-satellites revealed substantial allelic diversity (7-21, AE = 14.6 +/- 2.0) and heterozygosity (He = 0.697-0.924, AE = 0.857 +/- 0.033) per locus. Mini-satellite comparison between the two lineages revealed high but similar pattern of genetic diversity, allele frequency, and high degree of allele sharing. A Neighbour-Joining phylogenetic tree derived from genetic distance data obtained from ten mini-satellites also placed both lineages together in every cluster. Conclusions: The global lineage distribution, lack of genetic distance, similar pattern of genetic diversity, and allele sharing strongly suggested that both lineages are a single species and thus new emerging phenotypes associated with vivax malaria could not be clearly classified as belonging to a particular lineage on basis of their geographical origin.

Refined mapping of a quantitative trait locus on chromosome 1 responsible for mouse embryonic death

Recurrent spontaneous abortion (RSA) is defined as the loss of three or more consecutive pregnancies during the first trimester of embryonic intrauterine development. This kind of human infertility is frequent among the general population since it affects 1 to 5% of women. In half of the cases the etiology remains unelucidated. In the present study, we used interspecific recombinant congenic mouse strains (IRCS) in the aim to identify genes responsible for embryonic lethality. Applying a cartographic approach using a genotype/phenotype association, we identified a minimal QTL region, of about 6 Mb on chromosome 1, responsible for a high rate of embryonic death (similar to 30%). Genetic analysis suggests that the observed phenotype is linked to uterine dysfunction. Transcriptomic analysis of the uterine tissue revealed a preferential deregulation of genes of this region compared to the rest of the genome. Some genes from the QTL region are associated with VEGF signaling, mTOR signaling and ubiquitine/proteasome-protein degradation pathways. This work may contribute to elucidate the molecular basis of a multifactorial and complex human disorder as RSA.

Enfermedad de Creutzfeldt-Jakob esporádica: estudio clínico, patológico y molecular de un caso

Generalidades. Las encefalopatías espongiformes transmisibles son enfermedades neurodegenerativas ocasionadas por la acumulación anormal de una variante mal plegada de la proteína priónica, lo cual induce la formación de conglomerados proteicos resistentes a la degradación. Además, son responsables de la disfunción sináptica, daño neuronal y de la sintomatología clásica acompañante. Esta proteína de membrana es codificada por el exón 2 del gen PRNP, ubicado en el brazo corto del cromosoma 20 y parece estar involucrada en la trasmisión sináptica, la transducción de señales, la actividad antioxidante de la superoxidodismutasa, neuroplasticidad y sobrevida celular. Un polimorfismo en el codón 129 se asocia con una susceptibilidad diferencial a la enfermedad Creutzfeldt-Jakob esporádica. Objetivo. Estudio clínico, patológico y molecular de un caso de una mujer de 58 años con diagnóstico de enfermedad de Creutzfeldt- Jakob esporádica. Métodos y resultados. Se presenta el caso de una mujer en quien aparece un trastorno depresivo del afecto con demencia progresiva y sintomatología general. Al final de la enfermedad, el cuadro progresó a un déficit neurológico focalizado en el área visual. La RMN mostró hiperintensidades inespecíficas córtico-subcorticales en el núcleo estriado; en el EEG se encontró pérdida de ritmos de fondo, patrón de descargas periódicas generalizadas y complejos trifásicos; en la biopsia cerebral postmorten se evidenció pérdida severa de la población neuronal en todas las capas, vacuolas en el neuropil, en el soma neuronal y en la glía. El análisis de secuencia del gen PRNP, a partir de extracción de DNA de sangre periférica, identificó homocigosis para metionina en el codón 129. La paciente fallece a los 3 meses del inicio de la sintomatología. Conclusión. Por epidemiología, curso clínico y exámenes paraclínicos se confirma el diagnóstico de enfermedad de Creutzfeldt- Jakob esporádica.La determinación del genotipo para los polimorfismos de riesgo se convierte en una herramienta útil para complementar por medios moleculares el diagnóstico y para profundizar la comprensión de la fisiopatología de la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, tanto para formas esporádicas como para la nueva variante.

Preliminary population study of Methylenetetrahydrofolate Reductase (MTHFR) C677T polymorphism determination in a pilot group of students from the University of Rosario

 Introduction: the 5, 10-methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR) is an essential enzyme in folate metabolism; their polymorphisms have been associated with heart disease risk increase, obstetric problems, neural tube defects in fetuses and cancer susceptibility. This gene has a single nucleotide polymorphism, a C-T change at nucleotide 677, which affects significantly its enzymatic activity. Objective: because of the biological importance of this enzyme and the Colombian population genetic heterogeneity characteristic, a study was performed to determine allele and genotype frequencies of MTHFR C677T polymorphism in healthy individuals, taking into account that in Colombia there are only studies that have involved case-control methodology. Methods: we analyzed this polymorphism trough the amplification of the DNA of a 206 students sample population. Additionally, Colombian overall frequencies were calculated, using data from healthy controls reported in other studies. Results: a Hardy-Weinberg disequilibri m was found in the sample tested. For the Colombian data, we found that the global population was in equilibrium. Conclusion: T allele population frequency seems to be under positive selection pressure, which is reflected in the population allele increase, despite its deleterious effect. A Spanish study reported similar results and identified folic acid supplementation on expectant mothers as a probably cause of this change. 

Enfermedad tiroidea autoinmune en pacientes colombianos con lupus eritematoso sistémico

Objetivos: Determinar la prevalencia y los factores asociados con el desarrollo de hipotiroidismo autoinmune (HA) en una cohorte de pacientes con lupus eritematoso sistémico (LES), y analizar la información actual en cuanto a la prevalencia e impacto de la enfermedad tiroidea autoinmune y la autoinmunidad tiroidea en pacientes con LES. Métodos: Este fue un estudio realizado en dos pasos. Primero, un total de 376 pacientes con LES fueron evaluados sistemáticamente por la presencia de: 1) HA confirmado, 2) positividad para anticuerpos tiroperoxidasa/tiroglobulina (TPOAb/TgAb) sin hipotiroidismo, 3) hipotiroidismo no autoinmune, y 4) pacientes con LES sin hipotiroidismo ni positividad para TPOAb/TgAb. Se construyeron modelos multivariados y árboles de regresión y clasificación para analizar los datos. Segundo, la información actual fue evaluada a través de una revisión sistemática de la literatura (RLS). Se siguieron las guías PRISMA para la búsqueda en las bases de datos PubMed, Scopus, SciELO y Librería Virtual en Salud. Resultados: En nuestra cohorte, la prevalencia de HA confirmado fue de 12% (Grupo 1). Sin embargo, la frecuencia de positividad para TPOAb y TgAb fue de 21% y 10%, respectivamente (Grupo 2). Los pacientes con LES sin HA, hipotiroidismo no autoinmune ni positividad para TPOAb/TgAb constituyeron el 40% de la corhorte. Los pacientes con HA confirmada fueron estadísticamente significativo de mayor edad y tuvieron un inicio tardío de la enfermedad. El tabaquismo (ORA 6.93, IC 95% 1.98-28.54, p= 0.004), la presencia de Síndrome de Sjögren (SS) (ORA 23.2, IC 95% 1.89-359.53, p= 0.015) y la positividad para anticuerpos anti-péptido cíclico citrulinado (anti-CCP) (ORA 10.35, IC 95% 1.04-121.26, p= 0.047) se asociaron con la coexistencia de LES-HA, ajustado por género y duración de la enfermedad. El tabaquismo y el SS fueron confirmados como factores predictivos para LES-HA (AUC del modelo CART = 0.72). En la RSL, la prevalencia de ETA en LES varío entre 1% al 60%. Los factores asociados con esta poliautoinmunidad fueron el género femenino, edad avanzada, tabaquismo, positividad para algunos anticuerpos, SS y el compromiso articular y cutáneo. Conclusiones: La ETA es frecuente en pacientes con LES, y no afecta la severidad del LES. Los factores de riesgo identificados ayudarán a los clínicos en la búsqueda de ETA. Nuestros resultados deben estimular políticas para la suspensión del tabaquismo en pacientes con LES.