A comparative analysis by means of quantum molecular similarity measures of density distributions derived from conventional ab initio and density functional methods

A procedure based on quantum molecular similarity measures (QMSM) has been used to compare electron densities obtained from conventional ab initio and density functional methodologies at their respective optimized geometries. This method has been applied to a series of small molecules which have experimentally known properties and molecular bonds of diverse degrees of ionicity and covalency. Results show that in most cases the electron densities obtained from density functional methodologies are of a similar quality than post-Hartree-Fock generalized densities. For molecules where Hartree-Fock methodology yields erroneous results, the density functional methodology is shown to yield usually more accurate densities than those provided by the second order Møller-Plesset perturbation theory

Anàlisi polifàsica de soques de "Pseudomonas fluorescens" potencials agents de biocontrol de malalties de fruiters

Molts bacteris del grup fluorescent del gènere Pseudomonas són capaços de controlar malalties de les plantes causades per fongs i bacteris fitopatògens (ACBs) o mostren activitat com a bacteris promotors del creixement de les plantes (BPCPs). S'han descrit diversos metabòlits que intervenen de manera important en la seva activitat com a ACBs i BPCPs entre els quals en destaquen el 2,4-diacetilfloroglucinol (Phl), àcid fenazin-1-carboxílic (PCA), Pirrolnitrina (Prn), àcid cianhídric (HCN), àcid 3-indolacètic (IAA), sideròfors i quitinases. L'objectiu principal del nostre treball ha estat la comparació de les característiques d'un grup de Pseudomonas del grup fluorescent utilitzant una aproximació polifàsica amb la finalitat d'establir possibles relacions entre algunes de les característiques i la capacitat d'actuar com a ACB o BPCP. Atesa la importància en el biocontrol de la producció de metabòlits com Phl, PCA i Prn, l'objectiu preliminar ha estat la recerca i obtenció de soques productores d'aquests metabòlits. Per assolir aquest objectiu s'ha emprat una aproximació molecular basada en la detecció dels gens biosintètics implicats en la seva producció en lloc de la detecció directa dels metabòlits per evitar els efectes que poden tenir les condicions de cultiu en la inducció o repressió de la seva síntesi. S'han realitzat diferents protocols basats (i) en la cerca assistida de productors mitjançant l'ús de marcadors fenotípics i posterior confirmació per PCR i, (ii) en l'ús de la PCR per a la detecció dels gens directament dels extractes bacterians, d'enriquiments d'aquests extractes i la realització de la hibridació en colònies per al posterior aïllament. La cerca assistida de productors de Phl mitjançant marcadors fenotípics i posteriorment la utilització de tècniques moleculars (amplificació per PCR del gen phlD), ha estat el millor mètode en el tipus de mostres processades en el nostre treball, on la proporció de productors és relativament baixa. En total s'han aïllat a partir de diversos ambients 4 soques portadores dels gens de la síntesi de PCA, 15 de Phl i 1 de Prn. S'ha constituït una col·lecció de 72 soques de Pseudomonas del grup fluorescent que inclou 18 aïllats propis portadors dels gens biosintètics necessaris per la producció de Phl PCA i Prn; 6 soques de referència procedents de col·leccions de cultius tipus, 14 soques productores dels diferents antibiòtics cedides per altres investigadors i una selecció de 34 soques procedents d'un treball previ realitzat en el nostre grup de recerca. A la col·lecció s'hi troben soques candidates a ACB i BPCP de diverses malalties i plantes. Les 72 soques s'han caracteritzat fenotípica i genotípicament. La caracterització fenotípica s'ha portat a terme mitjançant la identificació a nivell d'espècie amb galeries API 20NE i proves bioquímiques específiques; la producció de metabòlits com PCA, Phl, Prn, IAA, HCN, quitinases i sideròfors mitjançant l'ús de diferents tècniques; antagonisme in vitro en diversos medis enfront dos fongs (Stemphylium vesicarium i Penicillium expansum) i tres bacteris fitopatògens (Erwinia amylovora, Pseudomonas syringae pv. syringae i Xanthomonas arboricola pv. juglandis); l'eficàcia de la inhibició de la infecció en bioassaigs in vivo sobre material vegetal enfront els fongs P. expansum en poma i S. vesicarium en fulles de perera i enfront el bacteri E. amylovora en fruits immadurs de perera i, finalment, en assaigs de promoció de creixement en dos portaempelts comercials de Prunus. Cal destacar que P. expansum causa la podridura blava en pomes i peres en postcollita, S. vesicarium la taca bruna de la perera i E. amylovora el foc bacterià de les rosàcies. El nombre de soques de Pseudomonas, sobre el total de les 72 estudiades, productores d'IAA (4) i quitinases (6) és baix, mentre que és elevat en el cas del HCN (32), que a més està associat a la producció de Phl. Els resultats obtinguts en l'antagonisme in vitro han mostrat en el cas dels bacteris que és dependent del patogen indicador i del medi de cultiu. La presència o absència de ferro no sembla ser un factor que potencií l'antagonisme. En el cas dels fongs no s'ha observat però, influència del medi de cultiu emprat. En el total de 72 soques s'ha observat un percentatge baix de soques que manifesten antagonisme en tots els medis assajats vers 3 o 4 dels patògens (7). Solament 2 d'aquestes 7 soques han mostrat ser també efectives en bioassaigs d'inhibició de les infeccions causades per 2 dels 3 patògens assajats. Algunes de les soques efectives en els bioassaigs no són antagonistes in vitro en cap dels medis assajats enfront el mateix patogen. En el cas de la promoció del creixement, s'han observat més soques promotores del creixement del portaempelts de prunera Marianna 2624 que no en l'híbrid de presseguer-ametller GF677 i les eficàcies assolides són també majors en el cas de Marianna 2624, detectant una elevada especificitat soca/portaempelts La caracterització genotípica s'ha realitzat mitjançant l'anàlisi dels polimorfismes en la longitud dels fragments de restricció de DNA ribosomal (RFLP-rDNA) i l'anàlisi dels polimorfismes en la longitud dels fragments de macrorestricció genòmica de DNA cromosòmic separats per electroforesi en camp polsant (MRFLP-PFGE). Ambdues anàlisis van mostrar una gran heterogeneïtat genètica entre les soques caracteritzades i no s'ha pogut relacionar les agrupacions obtingudes amb les característiques fenotípiques o capacitat d'actuar com a ACB o BPCP. Els patrons de macrorestricció genòmica (MRFLP-PFGE) del bacteri model P. fluorescens EPS288 són estables en el temps i independents de les condicions de cultiu assajades al laboratori o en mostres naturals, mostrant ser una tècnica eficaç en la identificació de reaïllats de mostres naturals inoculades prèviament amb el bacteri. Una selecció de soques que comparteixen el fet de produir floroglucinol s'han caracteritzat mitjançant RFLP i seqüenciació del gen phlD. S'ha establert una relació entre les agrupacions obtingudes en les anàlisis RFLP-rDNA, RFLP-phlD i les seqüències del gen. En l'anàlisi filogenètica de les seqüències del gen phlD s'ha observat un elevat grau de polimorfisme obtenint-se 3 agrupacions principals. Les agrupacions semblen relacionar-se amb els patrons de producció de metabòlits (Phl, HCN i Prn en una primera agrupació; Phl i HCN en la segona i solament Phl en la tercera), però aquestes no s'han pogut relacionar amb l'origen geogràfic de les soques o la seva activitat com a ACBs i/o BPCP. Amb les dades obtingudes de la caracterització fenotípica i genotípica s'ha realitzat una anàlisi multivariant (correspondències, correlacions d'Spearman i de freqüències amb variables categòriques). S'ha demostrat la importància de disposar d'una tècnica que permeti depurar una col·lecció de soques descartant les soques genèticament idèntiques, ja que influeixen en els resultats de les anàlisis. Pels tres patògens assajats com a indicadors i els dos portaempelts emprats, no s'ha observat cap correlació entre la inhibició de la infecció o la promoció del creixement amb les característiques fenotípiques i genotípiques de les soques que fos significatiu i consistent en les tres tècniques emprades.

Estructura computacional i aplicacions de la semblança molecular quàntica

La tesis tracta diferents aspectes relacionats amb el càlcul de la semblança quàntica, així com la seva aplicació en la racionalització i predicció de l'activitat de fàrmacs. Es poden destacar dos progressos importants en el desenvolupament de noves metodologies que faciliten el càlcul de les mesures de semblança quàntica. En primer lloc, la descripció de les molècules mitjançant les funciones densitat aproximades PASA (Promolecular Atomic Shell Approximation) ha permès descriure amb suficient precisió la densitat electrònica dels sistemes moleculars analitzats, reduint substancialment el temps de càlcul de les mesures de semblança. En segon lloc, el desenvolupament de tècniques de superposició molecular específiques de les mesures de semblança quàntica ha permès resoldre el problema de l'alineament en l'espai dels compostos comparats. El perfeccionament d'aquests nous procediments i algoritmes matemàtics associats a les mesures de semblança molecular quàntica, ha estat essencial per poder progressar en diferents disciplines de la química computacional, sobretot les relacionades amb les anàlisis quantitatives entre les estructures moleculars i les seves activitats biològiques, conegudes amb les sigles angleses QSAR (Quantitative Structure-Activity Relationships). Precisament en l'àrea de les relacions estructura-activitat s'han presentat dues aproximacions fonamentades en la semblança molecular quàntica que s'originen a partir de dues representacions diferents de les molècules. La primera descripció considera la densitat electrònica global de les molècules i és important, entre altres, la disposició dels objectes comparats en l'espai i la seva conformació tridimensional. El resultat és una matriu de semblança amb les mesures de semblança de tots els parells de compostos que formen el conjunt estudiat. La segona descripció es fonamenta en la partició de la densitat global de les molècules en fragments. S'utilitzen mesures d'autosemblança per analitzar els requeriments bàsics d'una determinada activitat des del punt de vista de la semblança quàntica. El procés permet la detecció de les regions moleculars que són responsables d'una alta resposta biològica. Això permet obtenir un patró amb les regions actives que és d'evident interès per als propòsits del disseny de fàrmacs. En definitiva, s'ha comprovat que mitjançant la simulació i manipulació informàtica de les molècules en tres dimensions es pot obtenir una informació essencial en l'estudi de la interacció entre els fàrmacs i els seus receptors macromoleculars.

Funcions densitat i semblança molecular quàntica: nous desenvolupaments i aplicacions

La present tesi, tot i que emmarcada dins de la teoria de les Mesures Semblança Molecular Quántica (MQSM), es deriva en tres àmbits clarament definits: - La creació de Contorns Moleculars de IsoDensitat Electrònica (MIDCOs, de l'anglès Molecular IsoDensity COntours) a partir de densitats electròniques ajustades. - El desenvolupament d'un mètode de sobreposició molecular, alternatiu a la regla de la màxima semblança. - Relacions Quantitatives Estructura-Activitat (QSAR, de l'anglès Quantitative Structure-Activity Relationships). L'objectiu en el camp dels MIDCOs és l'aplicació de funcions densitat ajustades, ideades inicialment per a abaratir els càlculs de MQSM, per a l'obtenció de MIDCOs. Així, es realitza un estudi gràfic comparatiu entre diferents funcions densitat ajustades a diferents bases amb densitats obtingudes de càlculs duts a terme a nivells ab initio. D'aquesta manera, l'analogia visual entre les funcions ajustades i les ab initio obtinguda en el ventall de representacions de densitat obtingudes, i juntament amb els valors de les mesures de semblança obtinguts prèviament, totalment comparables, fonamenta l'ús d'aquestes funcions ajustades. Més enllà del propòsit inicial, es van realitzar dos estudis complementaris a la simple representació de densitats, i són l'anàlisi de curvatura i l'extensió a macromolècules. La primera observació correspon a comprovar no només la semblança dels MIDCOs, sinó la coherència del seu comportament a nivell de curvatura, podent-se així observar punts d'inflexió en la representació de densitats i veure gràficament aquelles zones on la densitat és còncava o convexa. Aquest primer estudi revela que tant les densitats ajustades com les calculades a nivell ab initio es comporten de manera totalment anàloga. En la segona part d'aquest treball es va poder estendre el mètode a molècules més grans, de fins uns 2500 àtoms. Finalment, s'aplica part de la filosofia del MEDLA. Sabent que la densitat electrònica decau ràpidament al allunyar-se dels nuclis, el càlcul d'aquesta pot ser obviat a distàncies grans d'aquests. D'aquesta manera es va proposar particionar l'espai, i calcular tan sols les funcions ajustades de cada àtom tan sols en una regió petita, envoltant l'àtom en qüestió. Duent a terme aquest procés, es disminueix el temps de càlcul i el procés esdevé lineal amb nombre d'àtoms presents en la molècula tractada. En el tema dedicat a la sobreposició molecular es tracta la creació d'un algorisme, així com la seva implementació en forma de programa, batejat Topo-Geometrical Superposition Algorithm (TGSA), d'un mètode que proporcionés aquells alineaments que coincideixen amb la intuïció química. El resultat és un programa informàtic, codificat en Fortran 90, el qual alinea les molècules per parelles considerant tan sols nombres i distàncies atòmiques. La total absència de paràmetres teòrics permet desenvolupar un mètode de sobreposició molecular general, que proporcioni una sobreposició intuïtiva, i també de forma rellevant, de manera ràpida i amb poca intervenció de l'usuari. L'ús màxim del TGSA s'ha dedicat a calcular semblances per al seu ús posterior en QSAR, les quals majoritàriament no corresponen al valor que s'obtindria d'emprar la regla de la màxima semblança, sobretot si hi ha àtoms pesats en joc. Finalment, en l'últim tema, dedicat a la Semblança Quàntica en el marc del QSAR, es tracten tres aspectes diferents: - Ús de matrius de semblança. Aquí intervé l'anomenada matriu de semblança, calculada a partir de les semblances per parelles d'entre un conjunt de molècules. Aquesta matriu és emprada posteriorment, degudament tractada, com a font de descriptors moleculars per a estudis QSAR. Dins d'aquest àmbit s'han fet diversos estudis de correlació d'interès farmacològic, toxicològic, així com de diverses propietats físiques. - Aplicació de l'energia d'interacció electró-electró, assimilat com a una forma d'autosemblança. Aquesta modesta contribució consisteix breument en prendre el valor d'aquesta magnitud, i per analogia amb la notació de l'autosemblança molecular quàntica, assimilar-la com a cas particular de d'aquesta mesura. Aquesta energia d'interacció s'obté fàcilment a partir de programari mecanoquàntic, i esdevé ideal per a fer un primer estudi preliminar de correlació, on s'utilitza aquesta magnitud com a únic descriptor. - Càlcul d'autosemblances, on la densitat ha estat modificada per a augmentar el paper d'un substituent. Treballs previs amb densitats de fragments, tot i donar molt bons resultats, manquen de cert rigor conceptual en aïllar un fragment, suposadament responsable de l'activitat molecular, de la totalitat de l'estructura molecular, tot i que les densitats associades a aquest fragment ja difereixen degut a pertànyer a esquelets amb diferents substitucions. Un procediment per a omplir aquest buit que deixa la simple separació del fragment, considerant així la totalitat de la molècula (calcular-ne l'autosemblança), però evitant al mateix temps valors d'autosemblança no desitjats provocats per àtoms pesats, és l'ús de densitats de Forats de fermi, els quals es troben definits al voltant del fragment d'interès. Aquest procediment modifica la densitat de manera que es troba majoritàriament concentrada a la regió d'interès, però alhora permet obtenir una funció densitat, la qual es comporta matemàticament igual que la densitat electrònica regular, podent-se així incorporar dins del marc de la semblança molecular. Les autosemblances calculades amb aquesta metodologia han portat a bones correlacions amb àcids aromàtics substituïts, podent així donar una explicació al seu comportament. Des d'un altre punt de vista, també s'han fet contribucions conceptuals. S'ha implementat una nova mesura de semblança, la d'energia cinètica, la qual consisteix en prendre la recentment desenvolupada funció densitat d'energia cinètica, la qual al comportar-se matemàticament igual a les densitats electròniques regulars, s'ha incorporat en el marc de la semblança. A partir d'aquesta mesura s'han obtingut models QSAR satisfactoris per diferents conjunts moleculars. Dins de l'aspecte del tractament de les matrius de semblança s'ha implementat l'anomenada transformació estocàstica com a alternativa a l'ús de l'índex Carbó. Aquesta transformació de la matriu de semblança permet obtenir una nova matriu no simètrica, la qual pot ser posteriorment tractada per a construir models QSAR.

Synthesis of antimicrobial peptides derived from BP100 and BPC194

In the present PhD thesis we studied the solid-phase peptide synthesis of antimicrobial peptides derived from the lead peptides BP100 and BPC194. First, peptides derived from BP100 containing D-amino acids at different positions of the sequences were prepared. Moreover, peptidotriazoles derived from BP100 were also synthesized containing the triazole ring at the side-chain of different amino acids. Then, we proceeded to perform studies for the synthesis of multivalent peptides derived from BPC194. To achieve this objective, the synthesis of cyclic peptides containig a triazole ring at amino acids side-chain with different elongations was carried out. Finally, we prepared various carbopeptides containing 2 and 4 units of BP100 and/or its derivatives. The evaluation of the biological activity allowed the identification of active sequences against the economically important phytopathogenic bacteria and fungi and not toxic against eukaryotic cells.