A practical approach on boar sperm cryodamage. Morphofunctional and immunocytochemical study of cryopreserved boar sperm intended for use in artificial insemination

L'ús d'esperma criopreservada en la inseminació artificial (IA) d'espècies d'interès productiu permet un major control sanitari i la creació de bancs de germoplasma d'alt valor genètic, entre d'altres avantatges. En el mercat porcí la major part de les inseminacions són encara realitzades amb semen refrigerat degut a l'èxit de l'aplicació de diluents de llarga durada i també a causa de la sensibilitat de l'esperma porcina a la criopreservació. Malgrat que aquesta sensibilitat ve donada per característiques particulars de la fisiologia espermàtica en l'espècie, algunes ejaculacions mantenen els paràmetres de qualitat espermàtica després de la criopreservació (ejaculacions amb bona "congelabilitat", GFEs) enfront d'altres que no sobreviuen al procés (ejaculacions amb mala "congelabilitat", PFEs). El primer objectiu de l'estudi va ser comparar ambdós grups en termes de fertilitat in vivo. El segon objectiu va ser testar l'eficiència de la inseminació postcervical (post-CAI) amb l'esperma criopreservada. El tercer objectiu va ser buscar predictors de la congelabilitat de les ejaculacions, tant en les GFEs com en les PFEs i en tres passos del procés de criopreservació (a 17ºC, a 5ºC i a 240 min postdescongelació). Aquest objectiu es va dur a terme mitjançant l'avaluació de paràmetres convencionals de qualitat espermàtica i a través de l'estudi de la localització i la reactivitat sota el microscopi de tres proteïnes (GLUT3, HSP90AA1 i Cu/ZnSOD) relacionades amb la fisiologia espermàtica i amb possibles rols en la congelabilitat. El quart objectiu va ser quantificar l'expressió de les tres proteïnes per transferència western, tant en espermatozoides d'ejaculacions GFEs com en els d'ejaculacions PFEs i en els tres passos abans esmentats, per tal de determinar el seu potencial com a predictores de la congelabilitat. Pel primer i el segon objectiu, 86 truges van ser inseminades per post-CAI amb 26 ejaculacions de mascles Piétrain dividides en una porció refrigerada a 17ºC (tractament control) i una porció criopreservada, ambdues porcions classificades alhora com a GFEs o PFEs. Els resultats més rellevants van demostrar que les probabilitats d'embaràs eren dues vegades menors en inseminacions amb esperma criopreservada d'ejaculacions PFEs (P < 0.05) que en inseminacions amb esperma criopreservada d'ejaculacions GFEs, fet que indica que les ejaculacions amb percentatges elevats d'espermatozoides mòbils progressius i d'integritat de membrana (per sobre del 40% en les GFEs) són més favorables a provocar embarassos que no pas aquelles ejaculacions amb una pobra funció espermàtica in vitro (PFEs). Ni el nombre de truges que van donar a llum, ni la quantitat de garrins, ni el risc de reflux espermàtic van ser significativament diferents entre les inseminacions amb esperma criopreservada d'ejaculacions GFEs i les inseminacions control amb semen refrigerat, la qual cosa demostra la bona aplicabilitat de la inseminació post-CAI amb l'esperma criopreservada. Finalment, pel tercer i quart objectius van ser criopreservades 29 i 11 ejaculacions de mascles Piétrain, respectivament. Dos paràmetres cinètics espermàtics, la linealitat (LIN) i la rectitud (STR), van mostrar una hiperactivació de la mobilitat superior en les ejaculacions PFEs que en les GFEs després de 30 min a 5ºC durant la criopreservació. A més, la combinació d'ambdós paràmetres va donar una fiabilitat propera al 72% en la predicció de la congelabilitat de les ejaculacions porcines. Tot i que no va ser possible predir la congelabilitat mitjançant l'avaluació de les tres proteïnes al microscopi, els resultats de transferència western van revelar diferències en l'expressió de la HSP90AA1 en l'esperma a 17ºC, molt possiblement relacionades amb la millor supervivència a la criopreservació dels espermatozoides d'ejaculacions GFEs. Aquests resultats suggereixen que la promoció de la criopreservació d'esperma porcina per la seva aplicació en IA passa pel desenvolupament de tests per la predicció de la congelabilitat en semen refrigerat.

Les sHsps en surera: capacitat protectora enfront l'estrés i variabilitat genètica

Els organismes responen a la temperatura i a molts altres estressos sintetitzant un grup de proteïnes anomenat proteïnes de xoc de calor (HSPs). En plantes les sHsps, d'entre 15 i 30 kDa formen el grup més abundant i divers, classificat en funció de la seva localització subcel.lular i homologia en: mitocondrials, cloroplàstiques, de reticle endoplasmàtic i citoplàsmiques de classe I i II. Les sHsps-CI s'ha descrit que s'indueixen per estrès tèrmic, hídric i oxidatiu (peròxid d'hidrògen, llum UV, ozó) i en resposta a algunes hormones. També s'expressen durant el desenvolupament, per exemple durant l'embriogènesi, on es creu que podrien tenir un paper protector de l'embrió enfront la dessecació. Tot i que hi ha abundants treballs que correlacionen la resistència a l'estrès i l'acumulació de sHsps-CI, els mecanismes moleculars d'aquesta activitat són poc conguts. Tot i això, per diverses sHsps-CI ha estat descrita una activitat xaperona in vitro i, més recentment, que la seva sobreexpressió augmenta la viabilitat de cèl.lules d'E.coli en condicions d'estrès tèrmic. L'estudi de l'acumulació de sHsps-CI en surera (Quercus suber) mitjançant immunodetecció en electroforesi bidimensional mostra uns patrons d'acumulació complexos i formats per dos grups d'espècies proteiques principals, a l'entorn dels 10 i 17 kDa respectivament, que mostren una inducció diferencial en funció del teixit i l'estrès. Mentre que les espècies proteiques de 17 kDa s'indueixen per temperatura però no per estrès oxidatiu, les de ca. 10 kDa ho fan per estrès oxidatiu i no per temperatura. Ambdós grups d'espècies proteiques s'acumulen conjuntament en fel.lema. Assajos de PCR i RT-PCR han permès clonar parcialment tres noves sHsps-CI en surera: Qshsp10-CI, QshspC-CI i QshspD-CI. Aquest fet confirma la multigeneïcitat de les sHsps-CI en surera que apuntava el patró bidimensional. Dels nous clons obtinguts destaca especialment Qshsp10-CI, un gen que presenta un codó stop enmig del domini -cristal.lí que fa que a la proteïna que se'n dedueix li manqui un 55% del domini -cristal.lí i tota l'extensió C-terminal. Es tractaria de la sHsp més petita i més truncada descrita fins al moment. L'anàlisi de l'expressió de Qshsp10-CI mitjançant RT-PCR mostra expressió en plantes tractades amb H2O2 però no en les que han estat sotmeses a un xoc de calor. Aprofitant l'oportunitat que oferia aquesta sHsp-CI de ser utilitzada com a model per l'estudi de la importància del domini -cristal.lí i l'extensió C-terminal en l'activitat protectora enfront l'estrès, es va voler determinar la capacitat que tenia d'augmentar la viabilitat de cèl.lules d'E. coli en condicions d'estrès tèrmic i oxidatiu. Els resultats mostren que la proteïna recombinant QsHsp10-CI, tot i la important truncació que té, és capaç de protegir cèl.lules d'E. coli en condicions d'estrès tèrmic i, remarcablement, en condicions d'estrès oxidatiu. Tots aquests resultats indiquen que les espècies proteiques de ca. 10 kDa podrien correspondre a Qshsp10-CI i tenir un paper en les cèl.lules del fel.lema en la protecció enfront l'estrès oxidatiu. L'estrès oxidatiu provoca lesions al DNA que poden produir errors en la replicació, transcripció o traducció i generar proteïnes aberrants. Donades les condicions d'estrès oxidatiu a les quals es troben sotmeses les cèl.lules del fel.lema, s'ha volgut estudiar la variabilitat dels seus àcids nucleics. La determinació de la taxa de mutació de la regió codificant del gen Qshsp17.4-CI en mRNA i DNA de fel.lema i àpex radicular, un teixit jove i en creixement actiu va mostrar unes taxes sorprenentment elevades en l'mRNA (1/1784 pb) i el DNA genòmic (1/1520 pb) del fel.lema. Aquestes taxes són les més altes descrites en un genoma nuclear eucariota i són similars a les dels virus d'RNA d'evolució ràpida com el virus de l'Hepatitis C. Amb aquestes taxes de mutació, un terç dels mRNAs del fel.lema de la surera contindrien missatges aberrants i la supervivència de les cel.lules es veuria compromesa. Això implica que el fel.lema hauria de ser considerat com un mosaic de cèl.lules genèticament heterogènies i, per tant, una sola seqüència no defineix en tota la seva amplitud un gen en aquest teixit. No es va detectar cap mutació en àpex de rel. Amb l'objectiu d'aprofundir en el coneixement de les mutacions que es donen en aquests dos teixits i per tal de poder fer una anàlisi qualitativa més completa que permetés especular sobre el seu origen, es va aplicar un mètode de selecció de seqüències mutants en base a la utilització d'enzims de restricció. Les mutacions detectades en fel.lema es corresponen amb les relacionades, en altres sistemes no nuclears (plasmidis, fags i DNA bacterià), amb l'estrès oxidatiu. En conseqüència, l'estrès oxidatiu al qual estan sotmeses les cèl.lules del fel.lema podria ser el causant de l'elevada taxa de mutació detectada. D'acord amb això, el tipus majoritari de productes d'oxidació de les bases del DNA que s'acumulen en brots de plàntules de surera en resposta al peròxid d'hidrògen produeixen el mateix tipus de mutacions detectades en l'mRNA del fel.lema de la surera. La major sensibilitat d'aquest nou mètode ha permès, a més, detectar mutacions en molècules d'mRNA de rel, un teixit en el qual no s'havia trobat cap mutació utilitzant el mètode de clonatge i seqüenciació directa. Tot i això, el tipus de mutacions predominants no estan relacionades amb l'estrès oxidatiu sinó amb erros en la reparació dels àcids nucleics.