Development of molecular-based techniques for the detection, identification and quantification of food-borne pathogens

La presencia de microorganismos patógenos en alimentos es uno de los problemas esenciales en salud pública, y las enfermedades producidas por los mismos es una de las causas más importantes de enfermedad. Por tanto, la aplicación de controles microbiológicos dentro de los programas de aseguramiento de la calidad es una premisa para minimizar el riesgo de infección de los consumidores. Los métodos microbiológicos clásicos requieren, en general, el uso de pre-enriquecimientos no-selectivos, enriquecimientos selectivos, aislamiento en medios selectivos y la confirmación posterior usando pruebas basadas en la morfología, bioquímica y serología propias de cada uno de los microorganismos objeto de estudio. Por lo tanto, estos métodos son laboriosos, requieren un largo proceso para obtener resultados definitivos y, además, no siempre pueden realizarse. Para solucionar estos inconvenientes se han desarrollado diversas metodologías alternativas para la detección identificación y cuantificación de microorganismos patógenos de origen alimentario, entre las que destacan los métodos inmunológicos y moleculares. En esta última categoría, la técnica basada en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se ha convertido en la técnica diagnóstica más popular en microbiología, y recientemente, la introducción de una mejora de ésta, la PCR a tiempo real, ha producido una segunda revolución en la metodología diagnóstica molecular, como pude observarse por el número creciente de publicaciones científicas y la aparición continua de nuevos kits comerciales. La PCR a tiempo real es una técnica altamente sensible -detección de hasta una molécula- que permite la cuantificación exacta de secuencias de ADN específicas de microorganismos patógenos de origen alimentario. Además, otras ventajas que favorecen su implantación potencial en laboratorios de análisis de alimentos son su rapidez, sencillez y el formato en tubo cerrado que puede evitar contaminaciones post-PCR y favorece la automatización y un alto rendimiento. En este trabajo se han desarrollado técnicas moleculares (PCR y NASBA) sensibles y fiables para la detección, identificación y cuantificación de bacterias patogénicas de origen alimentario (Listeria spp., Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis y Salmonella spp.). En concreto, se han diseñado y optimizado métodos basados en la técnica de PCR a tiempo real para cada uno de estos agentes: L. monocytogenes, L. innocua, Listeria spp. M. avium subsp. paratuberculosis, y también se ha optimizado y evaluado en diferentes centros un método previamente desarrollado para Salmonella spp. Además, se ha diseñado y optimizado un método basado en la técnica NASBA para la detección específica de M. avium subsp. paratuberculosis. También se evaluó la aplicación potencial de la técnica NASBA para la detección específica de formas viables de este microorganismo. Todos los métodos presentaron una especificidad del 100 % con una sensibilidad adecuada para su aplicación potencial a muestras reales de alimentos. Además, se han desarrollado y evaluado procedimientos de preparación de las muestras en productos cárnicos, productos pesqueros, leche y agua. De esta manera se han desarrollado métodos basados en la PCR a tiempo real totalmente específicos y altamente sensibles para la determinación cuantitativa de L. monocytogenes en productos cárnicos y en salmón y productos derivados como el salmón ahumado y de M. avium subsp. paratuberculosis en muestras de agua y leche. Además este último método ha sido también aplicado para evaluar la presencia de este microorganismo en el intestino de pacientes con la enfermedad de Crohn's, a partir de biopsias obtenidas de colonoscopia de voluntarios afectados. En conclusión, este estudio presenta ensayos moleculares selectivos y sensibles para la detección de patógenos en alimentos (Listeria spp., Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis) y para una rápida e inambigua identificación de Salmonella spp. La exactitud relativa de los ensayos ha sido excelente, si se comparan con los métodos microbiológicos de referencia y pueden serusados para la cuantificación de tanto ADN genómico como de suspensiones celulares. Por otro lado, la combinación con tratamientos de preamplificación ha resultado ser de gran eficiencia para el análisis de las bacterias objeto de estudio. Por tanto, pueden constituir una estrategia útil para la detección rápida y sensible de patógenos en alimentos y deberían ser una herramienta adicional al rango de herramientas diagnósticas disponibles para el estudio de patógenos de origen alimentario.

Mejora de la seguridad alimentaria en productos cárnicos listos para el consumo mediante la aplicación combinada de tecnologías de conservación emergentes

La demanda creixent de productes mínimament processats i llestos per al consum planteja un important repte per a la seguretat alimentaria i ha conduit al desenvolupament de tractaments suaus que permetin inhibir el creixement microbià conservant la qualitat dels aliments. Els treballs recollits a la present tesi van plantejar diverses estratègies consistents en la combinació d'obstacles al creixement microbià per a millorar la seguretat de productes carnis llestos per al consum. Amb l'objectiu de millorar la seguretat dels embotits poc àcids, es va valorar l'aplicació del tractament per alta pressió hidrostàtica (APH) i l'addició de cultius iniciadors en embotits poc àcids. Per altra banda, per a reduir el risc de L. monocytogenes durant la conservació del pernil cuit llescat, es va avaluar l'efecte combinat de l'addició d'antimicrobians naturals (lactatat-diacetat i enterocines), afegits directament o a través de l'envasament antimicrobià, i el tractament per alta pressió hidrostàtica.

Revaloració de la fracció cel·lular de la sang de porc procedent d'escorxadors industrials

La sang de porc és un subproducte comestible que es genera als escorxadors industrials durant el procés d'obtenció de la canal. Aquest subproducte es caracteritza per presentar una elevada càrrega contaminant i, degut a l'elevat volum que es genera, és necessari trobar estratègies que permetin la seva revaloració i aprofitament, a la vegada que disminuïm la contaminació ambiental i les despeses que es deriven del seu processament abans de l'abocament. La fracció cel·lular (FC) constitueix el 40 % de la sang de porc i conté principalment l'hemoglobina (Hb), que representa al voltant del 90 % del contingut en proteïna d'aquesta fracció (un 35 % aproximadament). L'elevat percentatge en proteïna i en ferro, i les seves bones propietats funcionals fan que l'aprofitament d'aquest subproducte com a primera matèria o ingredient de la indústria alimentària sigui una alternativa molt útil a l'hora de reduir les despeses de la indústria càrnia, sempre que es resolguin els problemes de l'enfosquiment i dels sabors estranys que pot conferir la FC quan s'addiciona a productes alimentaris. Una altra possible utilització de la FC és aprofitar les propietats colorants de l'Hb o del grup hemo, com a colorant d'origen natural en diversos productes alimentaris. Els objectius del present treball eren, en primer lloc, determinar les millors condicions d'aplicació del procés de conservació de la FC mitjançant la deshidratació per atomització i caracteritzar físico-químicament i microbiològica el concentrat d'Hb en pols. En segon lloc, avaluar l'eficàcia de diferents additius antioxidants i/o segrestants del ferro per prevenir l'enfosquiment que pateix la FC durant la deshidratació. En tercer lloc, aplicar tractaments d'altes pressions hidrostàtiques com a procés d'higienització i avaluar els efectes d'aquest tractament sobre la microbiota contaminant, el color i les propietats funcionals de la FC. Finalment, desenvolupar un procés d'obtenció d'hidrolitzats proteics descolorats a partir de l'Hb amb la finalitat d'utilitzar-los com a ingredients nutricionals i/o funcionals. La millor temperatura de deshidratació per atomització de la FC hemolitzada era 140ºC. La FC en pols presentava un contingut en humitat del 5,3 % i un percentatge de solubilitat proteica del 96 %. La deshidratació per atomització induïa canvis en l'estructura nativa de l'Hb i, per tant, un cert grau de desnaturalització que pot conduir a una disminució de les seves propietats funcionals. L'extracte sec de la FC en pols estava composat per un 94,6 % de proteïna, un 3 % de sals minerals i un 0,7 % de greix. Els valors CIE L*a*b* del color de la FC en pols eren força constants i reflectien el color vermell marró fosc d'aquesta, a causa de l'oxidació del ferro hèmic que es produeix durant la deshidratació. La càrrega contaminant de la FC fresca de la sang de porc era força elevada i el tractament d'hemòlisi amb ultrasons i la centrifugació posterior no produïen una reducció significativa de la microbiota contaminant, obtenint un producte amb uns recomptes microbiològics de l'ordre de 106 ufc·mL-1. La deshidratació per atomització produïa una disminució d'una unitat logarítmica dels recomptes totals de la FC hemolitzada. Tanmateix, el producte en pols encara reflectia l'elevada contaminació de la primera matèria, fet que condiciona negativament la seva utilització com a ingredient alimentari, a no ser que es millorin les condicions de recollida de la sang a l'escorxador o que aquesta o la FC es sotmeti a algun tractament d'higienització prèviament a la deshidratació. Les isotermes de sorció a 20ºC de la FC en pols tenien forma sigmoïdal i una histèresi estreta i llarga. L'equació GAB és un bon model matemàtic per ajustar les dades de sorció obtingudes experimentalment i determinar la isoterma d'adsorció de la FC deshidratada per atomització. El percentatge d'humitat de la FC deshidratada a 140ºC es corresponia a un valor d'aw a 20 ºC d'aproximadament el 0,16. Tenint en compte que estava per sota dels valors d'aw corresponents a la capa monomolecular, es pot garantir la conservació a temperatura ambient del producte, sempre que s'envasi en recipients tancats que no permetin l'entrada d'humitat de l'exterior. De l'estudi de la possible estabilització del color de la FC deshidratada per atomització mitjançant l'addició d'antioxidants i/o segrestants de ferro, es va observar que només l'àcid ascòrbic, la glucosa, l'àcid nicotínic i la nicotinamida, tenien efectes positius sobre el color del producte en pols. L'ascòrbic i la glucosa no milloraven la conservació del color de l'Hb però disminuïen l'enfosquiment que es produeix durant la deshidratació, amb la qual cosa es pot obtenir un producte en pols de color marró més clar. L'addició de dextrina o L-cisteïna no disminuïa l'enfosquiment ni evitava el canvi de color de l'Hb. L'àcid nicotínic i la nicotinamida protegien el color de l'Hb durant el procés de deshidratació i l'emmagatzematge de la FC en pols. Les millors condicions d'aplicació del tractament amb altes pressions hidrostàtiques (HHP) sobre la FC eren 400 MPa, a 20ºC, durant 15 minuts, perquè produïen una millora significativa de la qualitat microbiològica, no afectaven negativament al color, no comprometien gaire la solubilitat proteica l'Hb i, malgrat que produïen un augment de la viscositat, la FC romania fluida després del tractament. Aquest tractament permetia una reducció de la microbiota contaminant de la FC d'entre 2 i 3 unitats logarítmiques. L'aplicació de l'alta pressió i la posterior deshidratació per atomització permetien obtenir un producte en pols amb recomptes totals de l'ordre de 2,8 unitats logarítmiques. El color de la FC pressuritzada en pols era igual que el de la FC control deshidratada, perquè ambdues mostres presentaven la mateixa susceptibilitat a l'oxidació del grup hemo produïda per la deshidratació. L'alta pressió incrementava la susceptibilitat de l'Hb als efectes desnaturalitzants de la deshidratació, fonamentalment a pH 7 (PIE), ja que es va observar una disminució de la solubilitat proteica a pH neutre després dels 2 processos tecnològics. La FC en pols presentava una màxima capacitat escumant al PIE de l'Hb. L'aplicació del tractament HHP produïa una disminució de la capacitat escumant de la FC en pols, però no tenia efectes negatius sobre l'estabilitat de l'escuma formada. Tampoc es van observar efectes negatius del tractament HHP sobre l'activitat emulsionant de l'Hb. La màxima activitat emulsionant de l'Hb s'aconseguia amb una concentració de FC en pols de l'1,5 % a pH 7 i de l'1 % a pH 4,5. Les pastes obtingudes per escalfament de la FC presentaven característiques molt diferenciades depenent del pH. A pH neutre es formaven unes pastes dures i consistents, mentre que a pH àcid les pastes eren poc consistents, molt adhesives i més elàstiques que les anteriors. Aquestes tenien una capacitat de retenció d'aigua molt superior que les de pH 7, en les quals l'aigua quedava retinguda per capil·laritat. La textura i capacitat de retenció d'aigua de les pastes tampoc eren afectades pel tractament HHP. El tractament HHP incrementava l'activitat de la Tripsina sobre l'Hb quan el substrat i l'enzim es tractaven conjuntament i afavoria el procés d'obtenció d'hidrolitzats descolorats a partir de la FC, la qual cosa permetia assolir el mateix grau de descoloració amb una dosi d'enzim inferior. El tractament d'hidròlisi de la FC amb la utilització combinada de Tripsina seguida d'un tractament amb Pepsina permetia l'obtenció d'un hidrolitzat proteic d'Hb descolorat i hidrolitzava completament la globina, donant lloc a 2 pèptids de 10,8 i 7,4 KDa. Val a dir que també produïa un 60 80 % de nitrogen soluble en TCA, constituït fonamentalment per pèptids petits i aminoàcids lliures. Els hidrolitzats trípsics i pèpsics d'Hb, obtinguts a partir de FC no pressuritzada i deshidratats per atomització a 180ºC, eren de color blanc i tenien un contingut en humitat del 4,7 %, un 84,2 % de proteïna i 9,7 % de sals minerals. El procés d'hidròlisi permetia una reducció considerable de la contaminació de la FC, obtenint un producte en pols amb uns recomptes totals de l'ordre de 102-103 ufc·g-1. Pel que fa a la funcionalitat dels hidrolitzats d'Hb deshidratats per atomització, aquests presentaven una elevada solubilitat proteica a pH 5 i 7 i romanien solubles després d'un escalfament a 80ºC durant 30 min. Tanmateix, aquesta hidròlisi afectava molt negativament la capacitat de mantenir escumes estables i l'activitat emulsionant.