Compositional Data in Biomedical Research

Modern methods of compositional data analysis are not well known in biomedical research. Moreover, there appear to be few mathematical and statistical researchers working on compositional biomedical problems. Like the earth and environmental sciences, biomedicine has many problems in which the relevant scienti c information is encoded in the relative abundance of key species or categories. I introduce three problems in cancer research in which analysis of compositions plays an important role. The problems involve 1) the classi cation of serum proteomic pro les for early detection of lung cancer, 2) inference of the relative amounts of di erent tissue types in a diagnostic tumor biopsy, and 3) the subcellular localization of the BRCA1 protein, and it's role in breast cancer patient prognosis. For each of these problems I outline a partial solution. However, none of these problems is \solved". I attempt to identify areas in which additional statistical development is needed with the hope of encouraging more compositional data analysts to become involved in biomedical research

“Unmixing” Tissue Gene Expression Signatures from Tumor Biopsies

Emergent molecular measurement methods, such as DNA microarray, qRTPCR, and many others, offer tremendous promise for the personalized treatment of cancer. These technologies measure the amount of specific proteins, RNA, DNA or other molecular targets from tumor specimens with the goal of “fingerprinting” individual cancers. Tumor specimens are heterogeneous; an individual specimen typically contains unknown amounts of multiple tissues types. Thus, the measured molecular concentrations result from an unknown mixture of tissue types, and must be normalized to account for the composition of the mixture. For example, a breast tumor biopsy may contain normal, dysplastic and cancerous epithelial cells, as well as stromal components (fatty and connective tissue) and blood and lymphatic vessels. Our diagnostic interest focuses solely on the dysplastic and cancerous epithelial cells. The remaining tissue components serve to “contaminate” the signal of interest. The proportion of each of the tissue components changes as a function of patient characteristics (e.g., age), and varies spatially across the tumor region. Because each of the tissue components produces a different molecular signature, and the amount of each tissue type is specimen dependent, we must estimate the tissue composition of the specimen, and adjust the molecular signal for this composition. Using the idea of a chemical mass balance, we consider the total measured concentrations to be a weighted sum of the individual tissue signatures, where weights are determined by the relative amounts of the different tissue types. We develop a compositional source apportionment model to estimate the relative amounts of tissue components in a tumor specimen. We then use these estimates to infer the tissuespecific concentrations of key molecular targets for sub-typing individual tumors. We anticipate these specific measurements will greatly improve our ability to discriminate between different classes of tumors, and allow more precise matching of each patient to the appropriate treatment

Spermiogenesis particularities of a sperm storage species: Helicolenus dactylopterus (Teleostei: Scorpaenidae)

A study of the spermiogenesis and spermatozoa of Helicolenus dactylopterus was conducted. Females of this species have the capacity to store sperm within their ovaries, and male gametes have a considerable cytoplasmic mass surrounding their heads to survive the long period of intraovarian sperm storage. Our observations show that early spermatids are round-shaped cells and have a spherical nucleus with diffuse chromatin. The nuclear volume decreases as a result of progressive chromatin condensation during spermiogenesis, causing the nucleus to take on a U-shape. Flagellar insertion is not central to the nucleus but consistently occurs at an oblique angle towards one side of it. The flagellum is inserted into the nuclear fossa, without subsequent nuclear rotation. In mature spermatozoa, the flagellum is adjacent to the nucleus. A comparison of the spermatozoa in the testicular lobules and those in the intraovarian storage structures suggests that the increase in volume of the cytoplasmic mass may occur in the posterior region of the testis, in the testicular duct. Spermatozoa enter the ovary in groups that reach the ovarian lumen and are surrounded by the ovarian epithelium for storage in sperm storage crypts

Estructura i ultraestructura testicular del mascle reproductor porcí (Sus domesticus)

El present treball analitza al microscopi òptic i al microscopi electrònic de transmissió el testicle de Sus domesticus (raça Landrace - varietat anglesa) a partir de mascles reproductors porcins adults i sans. L'objectiu principal de tots els centres d'Inseminació Artificial Porcina i de les Explotacions de Selecció i Multiplicació Porcina és garantir una excel·lent qualitat espermàtica al llarg de la vida reproductiva útil d'un mascle reproductor porcí. Així doncs, un millor coneixement dels patrons estructural i ultraestructural normals del testicle permetrà diagnosticar amb facilitat quina ha estat l'estructura o funció testicular afectada quan s'observa una disminució de la qualitat del semen. Les anàlisis seminals i hormonals són certament crucials en la valoració d'aquests mascles, però, no són totalment informatives de les alteracions testiculars, ja que és necessari conèixer l'organització microscòpica. Diversos estudis sobre testicle han demostrat que els marcadors més sensibles per a l'avaluació de la funció testicular són els següents: (1) la grandària testicular, (2) el gruix i l'organització de la càpsula testicular, (3) el percentatge de túbuls seminífers i de teixit intersticial en el parènquima testicular, (4) el diàmetre dels túbuls seminífers, (5) l'alçada i la composició de cèl·lules germinals de l'epiteli seminífer, (6) el gruix i l'organització de la làmina pròpia i, (7) la morfologia i la grandària de les cèl·lules de Leydig. El primer objectiu concret del present estudi ha estat, per tant, caracteritzar tots aquests paràmetres testiculars en mascles porcins sans i adults. L'organització estructural del testicle i les mesures quantitatives utilitzades com a marcadors no mostren diferències significatives ni entres els mascles porcins (P > 0,01), ni entre el testicle dret i l'esquerre (P > 0,01). Els testicles, de 330,80  16,99 g de pes, estan envoltats per una càpsula, de 2.375,13  246,68 m de gruix, la qual es divideix en tres capes: la túnica vaginalis constitueix l'1,82  0,78 % de la càpsula i està composta per una capa mesotelial externa i una capa interna de teixit conjuntiu dens; la túnica albuginea representa el 37,31  3,27 % i és de teixit conjuntiu dens i, la túnica vasculosa constitueix el 64,24 4,40 % i és de teixit conjuntiu lax. En el parènquima testicular els túbuls seminífers i el teixit intersticial representen el 72,44  2,12 % i el 27,46  2,12 %, respectivament. Els túbuls seminífers, de 226,23  18,08 m de diàmetre, es troben fortament recargolats i empaquetats, i estan compostos per la làmina pròpia i l'epiteli seminífer. La làmina pròpia, de 4-4,5 m de gruix, està formada per la làmina basal i dues capes de cèl·lules peritubulars. L'epiteli seminífer, amb una alçada mitjana de 66,11  10,62 m, és columnar i estratificat amb cèl·lules de Sertoli i diferents generacions d'espermatogònies, espermatòcits i espermàtides. El teixit intersticial és un teixit conjuntiu lax amb abundants cèl·lules de Leydig polièdriques fortament empaquetades (ca. 15 x 12 m). El segon objectiu concret d'aquest estudi ha estat estudiar des del punt de vista morfològic i morfomètric (alçada, longitud, freqüència relativa d'aparició i durada) els estadis del cicle de l'epiteli seminífer en els mascles porcins de la raça Landrace (varietat anglesa), classificats d'acord amb el mètode de la morfologia tubular. Els estadis premeiòtics ( I, II i III) ocupen el 31,9 % del cicle espermatogènic i es caracteritzen, principalment, per la presència de cèl·lules en les fase inicials de la meiosi I. Les primeres etapes de la meiosi I no afecten els paràmetres morfomètrics de l'epiteli seminífer ja que els valors obtinguts per l'alçada de l'epiteli seminífer, la freqüència relativa, la longitud i la durada d'aquests estadis són molt variables. Els estadis meiòtics (IV i V) representen el 16,4 % del cicle espermatogènic i estan constituïts, principlament, per cèl·lules en un estat avançat de la meiosi I i /o cèl·lules en meiosi II. Les últimes fases de la meiosi I i també de la meiosi II tenen lloc ràpidament, la qual cosa resulta en una baixa freqüència relativa d'aparició i, per tant, en una baixa durada dels estadis meiòtics. Els estadis postmeiòtics (VI, VII i VIII) ocupen el 50,6 % del cicle espermatogènic. L'esdeveniment més important que té lloc en aquests estadis és la fase de maduració de l'espermiogènesi. En la fase de maduració, les espermàtides experimenten diverses modificacions morfològiques i estructurals que donen lloc, finalment, als espermatozoides. La complexitat d'aquests processos fa que els estadis postmeiòtics presentin valors més grans de freqüència relativa, longitud i durada. El tercer objectiu concret d'aquest treball ha estat descriure a nivell ultraestructural el procés d'espermiogènesi, i relacionar les transformacions que experimenten les espermàtides en fase d'elongació amb els canvis ultraestructurals que tenen lloc en les diferents cèl·lules que constitueixen el testicle (cèl·lules germinals, de Sertoli i de Leydig, principalment). L'espermiogènesi del mascle porcí de la raça Landrace (varietat anglesa) s'ha dividit en 9 passos que vénen definits per 9 tipus diferents d'espermàtides. Al llarg de l'espermiogènesi no s'observen diferències ultraestructurals significatives (P > 0,01) ni entre els mascles porcins ni entre el testicle esquerre i dret en les cèl·lules que constitueixen el testicle.

L'oviparisme en la família Scorpaenidae (Pisces: Scorpaeniformes)

En aquest treball de tesi doctoral es descriu l'estructura gonadal, gametogènesi i cicle anual de Scorpaena porcus, S. scrofa i S. elongata per tal d'aprofundir en el coneixement dels diferents graus d'especialització dins l'oviparisme en peixos. Es pretén fer èmfasi en aquells trets inusuals que difereixen del què s'ha descrit fins ara per la majoria de les espècies ovípares de teleostis, i relacionar-los amb l'estratègia reproductiva de les espècies que els presenten El mostreig s'ha dut a terme de forma intensiva entre l'any 2000 i 2002, tot i que s'ha continuat recol·lectant mostres fins a l'agost de 2004, amb més o menys freqüència segons la necessitat. En total s'han obtingut 258 exemplars de S. porcus, 119 de S. scrofa i 46 de S. elongata. S'ha pogut veure com S. porcus, S. scrofa i S. elongata són espècies ovípares ovulípares especialitzades, ja que la seva estructura ovàrica presenta tot una sèrie de trets molt particulars i poc comuns a la resta de peixos ovípars estudiats fins ara: posició central del raquis musculo-connectiu que es troba envoltat completament pel lumen i la paret ovàrica; presència de peduncles en oòcits en fase de creixement secundari; escassetat i mida petita dels alvèols corticals; poc gruix de la zona radiata; i secreció d'una massa gelatinosa que engloba els ous en el moment de la posta. Totes aquestes característiques també s'han observat en Scorpaena notata, suggerint que l'especialització de l'oviparisme ovulípar es dóna en tot el gènere Scorpaena. L'estructura testicular i l'espermatogènesi d'aquestes espècies també és força particular. Per una banda els testicles són del tipus lobular no-restringit, tot i que presenten algunes característiques com la ordenació parcial dels cists segons l'estadi de maduració de les cèl·lules germinals que contenen i l'absència de lumen central, que actualment només s'ha observat en testicles del tipus lobular restringit de les espècies de la sèrie Aterinomorpha. Per l'altre banda, l'espermatogènesi és del tipus semicística, és a dir, els cists s'obren abans d'acabar tot el procés i les cèl·lules germinals s'acaben de desenvolupar a la llum del lòbul fins a espermatozoides. La posta d'aquestes espècies és múltipla i constisteix en una massa gelatinosa d'ous pelàgica, que en el cas de S. porcus s'alliberen entre els mesos de juny i agost, i en S. scrofa, a partir del mes de juliol. S'ha relacionat la presència d'aquesta massa amb un aparellament mascle-femella, de manera que el mascle alliberaria l'esperma directament sobre la massa d'ous, assegurant així la fartilització total dels mateixos.

Development of molecular-based techniques for the detection, identification and quantification of food-borne pathogens

La presencia de microorganismos patógenos en alimentos es uno de los problemas esenciales en salud pública, y las enfermedades producidas por los mismos es una de las causas más importantes de enfermedad. Por tanto, la aplicación de controles microbiológicos dentro de los programas de aseguramiento de la calidad es una premisa para minimizar el riesgo de infección de los consumidores. Los métodos microbiológicos clásicos requieren, en general, el uso de pre-enriquecimientos no-selectivos, enriquecimientos selectivos, aislamiento en medios selectivos y la confirmación posterior usando pruebas basadas en la morfología, bioquímica y serología propias de cada uno de los microorganismos objeto de estudio. Por lo tanto, estos métodos son laboriosos, requieren un largo proceso para obtener resultados definitivos y, además, no siempre pueden realizarse. Para solucionar estos inconvenientes se han desarrollado diversas metodologías alternativas para la detección identificación y cuantificación de microorganismos patógenos de origen alimentario, entre las que destacan los métodos inmunológicos y moleculares. En esta última categoría, la técnica basada en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se ha convertido en la técnica diagnóstica más popular en microbiología, y recientemente, la introducción de una mejora de ésta, la PCR a tiempo real, ha producido una segunda revolución en la metodología diagnóstica molecular, como pude observarse por el número creciente de publicaciones científicas y la aparición continua de nuevos kits comerciales. La PCR a tiempo real es una técnica altamente sensible -detección de hasta una molécula- que permite la cuantificación exacta de secuencias de ADN específicas de microorganismos patógenos de origen alimentario. Además, otras ventajas que favorecen su implantación potencial en laboratorios de análisis de alimentos son su rapidez, sencillez y el formato en tubo cerrado que puede evitar contaminaciones post-PCR y favorece la automatización y un alto rendimiento. En este trabajo se han desarrollado técnicas moleculares (PCR y NASBA) sensibles y fiables para la detección, identificación y cuantificación de bacterias patogénicas de origen alimentario (Listeria spp., Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis y Salmonella spp.). En concreto, se han diseñado y optimizado métodos basados en la técnica de PCR a tiempo real para cada uno de estos agentes: L. monocytogenes, L. innocua, Listeria spp. M. avium subsp. paratuberculosis, y también se ha optimizado y evaluado en diferentes centros un método previamente desarrollado para Salmonella spp. Además, se ha diseñado y optimizado un método basado en la técnica NASBA para la detección específica de M. avium subsp. paratuberculosis. También se evaluó la aplicación potencial de la técnica NASBA para la detección específica de formas viables de este microorganismo. Todos los métodos presentaron una especificidad del 100 % con una sensibilidad adecuada para su aplicación potencial a muestras reales de alimentos. Además, se han desarrollado y evaluado procedimientos de preparación de las muestras en productos cárnicos, productos pesqueros, leche y agua. De esta manera se han desarrollado métodos basados en la PCR a tiempo real totalmente específicos y altamente sensibles para la determinación cuantitativa de L. monocytogenes en productos cárnicos y en salmón y productos derivados como el salmón ahumado y de M. avium subsp. paratuberculosis en muestras de agua y leche. Además este último método ha sido también aplicado para evaluar la presencia de este microorganismo en el intestino de pacientes con la enfermedad de Crohn's, a partir de biopsias obtenidas de colonoscopia de voluntarios afectados. En conclusión, este estudio presenta ensayos moleculares selectivos y sensibles para la detección de patógenos en alimentos (Listeria spp., Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis) y para una rápida e inambigua identificación de Salmonella spp. La exactitud relativa de los ensayos ha sido excelente, si se comparan con los métodos microbiológicos de referencia y pueden serusados para la cuantificación de tanto ADN genómico como de suspensiones celulares. Por otro lado, la combinación con tratamientos de preamplificación ha resultado ser de gran eficiencia para el análisis de las bacterias objeto de estudio. Por tanto, pueden constituir una estrategia útil para la detección rápida y sensible de patógenos en alimentos y deberían ser una herramienta adicional al rango de herramientas diagnósticas disponibles para el estudio de patógenos de origen alimentario.