Construcció d'un elèctrode d'ió selectiu amb membrana de PVC i marro de cafè com a ionòfor

Els elèctrodes són instruments d’anàlisi molt emprats per la seva gran eficiència, fàcil utilització, de resposta “in situ” i que ocupen poc espai. Tot i això, existeix una problemàtica actual dels elèctrodes, que és la no comercialització d’elèctrodes per tots els metalls que trobem dissolts en solucions d’interès analític. Per aquest motiu s’estudien possibles substàncies dins la formació de la membrana dels elèctrodes, ionòfors, que reaccionin amb espècies iòniques amb inexistència d’elèctrodes comercials. S’han dut a terme estudis amb residus vegetals com a ionòfors. Algunes dels biomaterials estudiats són la rapa i la iohimbe per a la detecció del Cr(VI) i l’Hg(II). Aquestes han sigut les motivacions que han dut a construir un elèctrode de ió selectiu amb membrana de PVC i marro de cafè com a ionòfor, i seguidament avaluar-ne la seva resposta

Disseny del capçal d'un molinet motoritzat per a realitzar extractes de plantes en el sector de la indústria farmacèutica

Una empresa de la indústria farmacèutica vol comercialitzar càpsules elaborades amb plantes medicinals. El procés a seguir per a aconseguir el producte final es realitza mitjançant un molí motoritzat que consta d’unes ganivetes, la funció de les quals és triturar les fulles de les plantes prèviament seleccionades a unes mides realment minúscules, de tal manera que llavors es puguin introduir dins les càpsules. Actualment el procés de trituració es realitza aproximadament a 3.000 rpm i en intentar assolir majors velocitats de treball el capçal de la màquina no les aguanta, cedint un o més dels seus components, patint sobretot l’eix de transmissió i els rodaments, que en ocasions acaben trencant-se. Per a intentar resoldre aquest problema, l’empresa subministradora de maquinària industrial es planteja la viabilitat d’un nou prototipus. La primera mesura que es proposa al client per a solucionar el problema derivat d’aquest augment de la producció és dissenyar un nou capçal del molí motoritzat perquè pugui treballar a velocitats superiors, aproximadament de 18.000 r.p.m, que significaria un canvi total de la transmissió de la màquina

Estudi d'un receptor quinasa atípic (Mark) i de les proteïnes que interaccionen amb el seu domini intracel·lular. Transducció del senyal i desenvolupament en blat de moro (Zea mays)

Aquesta tesi doctoral s'engloba dins d'un projecte general d'estudi de gens implicats en l'embriogènesi del blat de moro. L'embriogènesi del blat de moro, i en general la de totes les plantes superiors, es dóna en tres etapes: una primera etapa on es diferencien tots els diversos teixits que formaran l'embrió, una segona etapa on l'embrió acumula productes de reserva i un tercer període, la dormància, que finalitza quan les condicions ambientals són les idònies per a la germinació. En el laboratori estàvem interessats, concretament, en l'estudi de gens implicats en la primera etapa morfogenètica, on els diferents teixits i estructures embrionàries queden definides. Per tal d'estudiar gens que s'expressaven en aquest període, una de les estratègies que es va realitzar fou un crivellat diferencial entre teixit embrionari i teixit de planta adulta. D'entre els diferents clons obtinguts, un corresponia a un clon parcial que presentava similitud amb receptors quinasa i que fou objecte d'estudi. A partir d'aquest clon es va obtenir el clon complet i es va anomenar MARK (per Maize Atypical Receptor Kinase). MARK presenta una estructura típica d'un receptor quinasa amb un domini extracel.lular, que conté 6 còpies imperfectes de LRR (Leucine- Rich Repeats), un únic domini transmembrana i un domini quinasa intracel.lular. El domini quinasa de MARK presenta, però, algunes variacions en els residus aminoacídics que es consideren claus per a la funció catalítica dels dominis quinasa. En concret cinc dels aminoàcids considerats essencials per a la fosforilació es troben substituits en el domini quinasa de MARK (DK-MARK). Els experiments de fosforilació in vitro que es van realitzar al laboratori, van mostrar com MARK era incapaç de fosforilar in vitro. Aquesta característica no és, però, exclusiva de MARK. Una búsqueda en les bases de dades ens van permetre identificar altres seqüències que també presentaven els mateixos o altres canvis en aquestes posicions aminoacídiques. En les bases de dades de plantes es van identificar un conjunt de seqüències genòmiques o ESTs amb aquestes característiques i només una d'elles, la proteïna TMKL1 d'Arabidopsis, ha sigut descrita com un receptor quinasa incapaç de fosforilar in vitro. Respecte a la búsqueda de receptors similars a MARK en les bases de dades d'animals, es van identificar també un conjunt de proteïnes que, en alguns casos, s'ha descrit que no tenen activitat quinasa in vivo. Per exemple, un dels casos més ben estudiats és el del receptor erbB3 que forma part de la família de receptors del EGF (Epidermal Growth Factor). Aquesta família de receptors està formada per 4 receptors: erbB1, erbB2, erbB3 i erbB4, dels quals només l'erbB3 no presenta activitat catalítica. S'ha descrit que erbB3 és capaç, tot i no fosforilar in vivo, de participar activament en la transducció del senyal formant heterodímers amb els altres membres de la família. Així, erbB3 és fosforilat pel seu partner i pot iniciar la cascada de transducció del senyal. La participació d'erbB3 en la transducció del senyal és essencial ja que embrions de ratolí knock-out pel gen erbB3 són inviables. Així doncs, el fet que receptors quinasa catalíticament inactius participin en les cascades de transducció del senyal, suggereix l'existència de nous mecanismes d'acció per a la transducció del senyal. Per tant, l'objectiu d'aquest treball fou l'estudi del mecanisme d'acció de MARK mitjançant la caracterització les proteïnes capaces d'interaccionar amb el seu domini quinasa. Per tal d'assolir aquest objectiu, es va realitzar un crivellat de doble-híbrid amb una llibreria de cDNA d'embrions de blat de moro de 7 DAP. D'aquest crivellat es va obtenir un conjunt de possibles clons positius que foren seqüenciats i entre els quals es van escollir per un estudi més detallat aquells que s'havien obtingut més vegades com a clons independents. Aquests clons codificaven per: una SAMDC (S-Adenosil Descarboxilasa), una eIF5 (Eukaryotic translation initiation), una hypothetical protein, una unknown protein, una gamma-adaptina i una MAP4K. Amb aquests 6 clons es van fer estudis in vitro i in vivo per tal de confirmar al seva interacció amb DK-MARK. Els estudis in vivo es van realitzar amb la soca de llevat AH109, una soca més astringent que la utilitzada en el crivellat, ja que presenta tres gens marcadors: Histidina, Adenina i Lacz. Els resultats obtinguts van mostrar que els clons codificants per SAMDC i eIF5 no van créixer en un medi selectiu per His i Ade i, per tant o es tracta de falsos positius del sistema o la seva interacció amb DK-MARK és dèbil. D'altra banda, la resta dels clons analitzats (proteïna hipotètica, una proteïna de funció desconeguda, la gamma-adaptina i una MAP4K) van créixer en medis en absència de Histidina i Adenina. Els assatjos de b-galactosidasa van ser tots positius a excepció de la proteïna hipotètica suggerint que potser aquesta interacció sigui més feble. D'altra banda també es van realitzar estudis in vitro amb la tècnica del pull-down. Els resultats obtinguts amb aquesta tècnica van recolzar els obtinguts en cèl.lules de llevat, ja que tots els clons analitzats a excepció dels codificants per SAMDC i eIF5 van donar un resultat d'interacció amb KD-MARK in vitro positiu. Davant aquests resultats ens vam centrar en l'estudi de la proteïna similar a MAP4K, doncs algunes proteïnes de la seva família s'han relacionat amb receptors de membrana. Els clons que es va obtenir del crivellat codificaven per una proteïna similar amb el domini C-terminal a les proteïnes BnMAP4Ka1 i a2 de Brassica napus. Aquestes proteïnes presenten una forta similitud de seqüència amb proteïnes de la família GCK/SPS1 que formen part d'un grup particular de MAPK relacionades amb la proteïna Ste20 (sterile 20 protein) de llevat. Ste20p activa la MAP3K de llevat Ste11 directament per fosforilació, transduint d'aquesta manera el senyal del receptor de feromones de creuament de les cèl.lules de llevat i es pot, doncs, considerar com una proteïna del tipus MAP4K (mitogen-activated protein kinase kinase kinase kinase). En els darrers anys, s'han identificat un gran nombre de proteïnes similars a Ste20: fins a una trentena en mamífers, en Drosophila, en Caenorhabditis elegans i en altres organismes. Segons la seva estructura aminoacídica, la família Ste20 s'ha classificat en dues subfamílies: les proteïnes STE20/PAK (p21-activated kinases) i la subfamília GCK/SPS1 (germinal center kinases). Les dues subfamílies estan formades per proteïnes que contenen un domini quinasa i un domini regulador, però, mentre que les proteïnes PAK presenten el domini quinasa en la part C-terminal, les GCKs el presenten en la regió N terminal. Les proteïnes GCK presenten una elevada diversitat estructural en el domini regulador permetent la seva classificació en 6 subfamílies. Mitjançant la tècnica del RACE es va obtenir el clon de cDNA complet que es va anomenar MIK (MARK Interacting Kinase). Amb la tècnica del Southern blot es va poder determinar que el gen MIK és un gen de còpia única en el genoma de blat de moro. Per tal d'analitzar la possible interacció entre DK-MARK i MIK, es va estudiar tant el patró d'expressió d'ambdós gens com el seu patró d'acumulació d'ambdues proteïnes durant l'embriogènesi del blat de moro. El patró d'expressió, analitzat per Northen blot va mostrar uns patrons coincidents al llarg de l'embriogènesi des del seu inici fins als 20 DAP amb una acumulació màxima de mRNA en embrions de 15 DAP. D'altra banda per tal d'estudiar el patró d'acumulació de la proteïna MIK així com per comparar-lo amb el de MARK, es van realitzar estudis de Westerns blot. Els resultats també van mostrar una coincidència en el temps de l'acumulació de les proteïnes MARK i MIK durant l'embriogènesi de blat de moro amb una major acumulació en embrions de 15 i 20 DAP. Es van dur a terme també estudis d'immunolocalitzacions sobre embrions de blat de moro de 15 DAP per tal d'estudiar en quins teixits s'acumulaven ambdues proteïnes. Les immunolocalitzacions van mostrar una major acumulació tant de MARK com de MIK en les zones meristemàtiques i en el teixit vascular sobretot del coleòptil on s'aprecia una forta co-localització de MARK i MIK. Totes aquestes dades són compatibles, doncs, amb una possible interacció de les proteïnes MARK i MIK, tot i que no la demostren. Per tal de demostrar la interacció es van realitzar experiments d'immunoprecipitació in vivo a partir d'extractes d'embrions. Malauradament, els resultats no són clars i en aquests moments en el laboratori s'estan posant a punt aquests experiments. També es van realitzar estudis comparatius de seqüència amb diferents proteïnes de la família GCK, mostrant una major similitud amb les proteïnes de la subfamília GCK-III. La subfamília GCK-III ha estat molt poc estudiada i en formen part un conjunt de proteïnes amb funcions molt diverses des de l'apoptosi, la citoquinesi o l'anòxia cel.lular. Per tant, la similitud de seqüència possiblement fa referència a una conservació en el mecanisme d'acció més que no pas a una conservació funcional. La possible interacció de MARK amb el domini C-terminal de MIK (el domini regulador) podria activar aquesta última iniciant una cascada de transducció del senyal en un model en el que una proteïna del tipus GCK-III faria de lligam directa entre un receptor de membrana i una cascada de senyalització intracel.lular. Aquest tipus de lligam entre un recepctor de membrana i mòduls intracel.lulars de senyalització s'ha descrit per a altres proteïnes GCK, si bé no directament sinó a través de proteïnes adaptadores. D'altra banda, la interacció directa de MARK, un receptor quinasa atípic que no té activitat catalítica, amb MIK suggereix un mecanisme on receptors atípics podrien interaccionar en la transducció del senyal activant la via de les MAPK.

Efectes de la invasió de la formiga argentina, Linepithema humile (Mayr), sobre el procés de dispersió de llavors de plantes mediterrànies

La formiga invasora Linepithema humile (Mayr), també coneguda com la formiga argentina, és una espècie present a la península Ibèrica. En aquesta tesi s'ha estudiat com afecta la presència d'aquesta espècie plaga a la comunitat de formigues autòctones y al procés de dispersió de llavors de plantes mediterrànies. L'estudi es va dur a terme en una àrea de sureda i brolla d'estepes i bruc boal situada al nord-est peninsular, prop de la línia de costa mediterrània. Un dels primers y més notables efectes de la invasió a les nostres àrees d'estudi és la dramàtica alteració de la comunitat de formigues, en forma de una reducció de la riquesa específica i de la homogeneïtat d'abundàncies. A més, a les zones envaïdes no hi queda cap espècie de formiga autòctona dispersant de llavors. A causa de la gran abundància d'obreres de la formiga argentina a les zones envaïdes, i del seu elevat ritme d'activitat, aquesta espècie efectua un intens rastreig del sòl, la qual cosa li permet localitzar els recursos en un temps menor que les formigues autòctones de les zones no envaïdes. No obstant, la obertura mandibular de la comunitat de formigues esdevé molt disminuïda a les zones envaïdes a causa de la desaparició de les espècies autòctones, la majoria d'elles de mida més grossa que la formiga argentina, la qual cosa podria limitar la capacitat de manipulació de l'entorn que té la comunitat de formigues a les zones envaïdes, i podria explicar la falta de reemplaçament d'alguns dels rols que duien a terme les espècies de formigues autòctones abans de la invasió. La formiga argentina es mostra atreta per les llavors de les nou espècies vegetals estudiades (dues euforbiàcies: Euphorbia biumbellata i E. characias; dues compostes: Cirsium vulgare i Galactites tomentosa; i cinc papilionàcies: Genista linifolia, G. monspessulana, G. triflora, Sarothamnus arboreus i Ulex parviflorus), arribant a transportar i fins i tot introduir al niu algunes llavors, però amb probabilitats inferiors a les realitzades per les formigues autòctones de les zones no envaïdes. No obstant, el seu comportament davant les nou espècies de llavors és variable, de manera que sembla que el seu efecte sobre la dispersió de llavors podria ser diferent per a cada espècie vegetal. L'alteració del procés de dispersió no sembla alterar l'èxit reproductiu d'una espècie concreta, Euphorbia characias, a les zones envaïdes; ni el seu reclutament, ni la distribució espacial, ni la supervivència de les plàntules són significativament diferents a les zones envaïdes que a les no envaïdes. La desaparició de les espècies de formigues granívores de les zones envaïdes pot afectar la dinàmica de les llavors de plantes no mirmecòcores. Així, les llavors de tres papilionàcies (Calicotome spinosa, Psoralea bituminosa i Spartium junceum) resulten amb un menor nivell de transports (i probablement menor depredació) a les zones envaïdes per la formiga argentina.