Active control of structures with uncertain coupled subsystems and actuator dynamics

This paper deals with the problem of stabilizing a class of structures subject to an uncertain excitation due to the temporary coupling of the main system with another uncertain dynamical subsystem. A Lyapunov function based control scheme is proposed to attenuate the structural vibration. In the control design, the actuator dynamics is taken into account. The control scheme is implemented by using only feedback information of the main system. The effectiveness of the control scheme is shown for a bridge platform with crossing vehicle

Pressure-jump-induced kinetics reveals a hydration dependent folding/unfolding mechanism of ribonuclease A

Pressure-jump (p-jump)-induced relaxation kinetics was used to explore the energy landscape of protein folding/unfolding of Y115W, a fluorescent variant of ribonuclease A. Pressure-jumps of 40MPa amplitude (5ms dead-time) were conducted both to higher (unfolding) and to lower (folding) pressure, in the range from 100 to 500MPa, between 30 and 50°C. Significant deviations from the expected symmetrical protein relaxation kinetics were observed. Whereas downward p-jumps resulted always in single exponential kinetics, the kinetics induced by upward p-jumps were biphasic in the low pressure range and monophasic at higher pressures. The relative amplitude of the slow phase decreased as a function of both pressure and temperature. At 50°C, only the fast phase remained. These results can be interpreted within the framework of a two-dimensional energy surface containing a pressure- and temperature-dependent barrier between two unfolded states differing in the isomeric state of the Asn-113–Pro-114 bond. Analysis of the activation volume of the fast kinetic phase revealed a temperature-dependent shift of the unfolding transition state to a larger volume. The observed compensation of this effect by glycerol offers an explanation for its protein stabilizing effect

Estabilitat conformacional de variants de la ribonucleasa A: pressió i temperatura com a inductors dels desplegament proteic

A fi d'analitzar la contribució de la regió C-terminal proposada com a iniciadora del plegament (CFIS 106-118) a l'estabilitat de l'RNasa A, els residus alifàtics d'aquesta regió es van substituir, mitjançant mutagènesi dirigida, per altres residus en els quals la cadena lateral alifàtica era rogressivament escurçada. La major part de les substitucions projectades suposaven delecions no disruptives de grups metil(è). A més, es va reemplaçar la Tyr115 per un Trp, de manera que, potencialment, s'introduïa una única sonda fluorescent, no desestabilitzant, per tal de seguir els canvis conformacionals que es poguessin generar en la regió durant el procés de legament/desplegament de la proteïna. Tant els paràmetres cinètics, com els espectres d'FTIR i CD, determinats per cadascuna de les ribonucleases variants, indiquen que els reemplaçaments aminoacídics efectuats presenten, en general, poc o cap efecte en l'estructura nativa i en l'activitat de l'enzim. Es va emprar l'espectroscòpia d'absorció a l'ultraviolat de quarta derivada, la fluorescència (per la variant amb Trp) i l'espectroscòpia d'infraroig per transformada de Fourier, per tal de seguir i caracteritzar, en condicions d'equilibri, les transicions conformacionals de cada variant en funció de la pressió i de la temperatura. Els resultats es van comparar amb els que es van obtenir per la proteïna salvatge. Per determinar més a fons les característiques del procés de desplegament de la variant Y115W, les transicions de desnaturalització induïdes per urea d'aquesta variant i de la proteïna salvatge, van ésser examinades per mitjà d'electroforesi en gradient d'urea i espectroscòpia de fluorescència. Curiosament, els canvis conformacionals que resulten de la desnaturalització per pressió són molt semblants als que s'obtenen per temperatura. Enfront d'un augment gradual tant de pressió com de temperatura, l'estructura terciària i els elements d'estructura secundària de les proteïnes estudiades es perden de manera conjunta i reversible. Aquestes variacions estructurals que es promouen descriuen un procés de desplegament molt cooperatiu i en dos estats. Atès que ambdues tècniques (UV i FTIR) utilitzen cadascuna un règim de concentració proteica molt diferent, els resultats indiquen que el procés de desplegament per pressió i per temperatura és intramolecular. Els resultats obtinguts suggereixen que la hidrofobicitat i el volum de les cadenes laterals del CFIS, juntament amb les interaccions de van der Waals entre elements d'estructura secundària intervenen de manera molt notable en l'estabilització de la proteïna. Entre els diferents aminoàcids alifàtics que pertanyen al CFIS C-terminal, la Val108 és el residu més important per tal de preservar la integritat estructural de l'estat natiu. Els reemplaçaments en aquesta posició causen petites alteracions conformacionals i una gran desestabilització de la proteïna (per exemple, el punt mig de la transició de desnaturalització per pressió i per temperatura de la variant V108G disminueix uns 592 MPa i 25ºC, respectivament, respecte a la proteïna salvatge). D'acord amb els resultats obtinguts, la variant Y115W ofereix una sonda útil per tal de seguir la cinètica de plegament/desplegament de l'RNasa A.

Les sHsps en surera: Estudis de funcionalitat

Aquesta tesi es centra en la caracterització funcional d'una proteïna de xoc de calor de baix pes molecular (Small Heat Shock Protein - sHSP) de classe I de surera pel que fa a la seva capacitat per protegir les cèl·lules de l'estrès i per estabilitzar les membranes. Les sHsps són proteïnes que s'expressen en condicions d'estrès cel·lular. Encara que certs aspectes funcionals de les sHsps són ben coneguts, el nostre treball aporta informacions noves sobre el paper de les diferents regions de la proteïna, especialment de la regió N-terminal. L'objectiu concret d'aquest treball és determinar la funció termoprotectora de QsHsp17.4-CI, una sHsp de classe I oobtinguda a partir de les cèl·lules de fel·lema d'alzina surera, en un model bacterià i analitzar la importància de les diferents regions de la proteïna en aquesta funció. Amb aquesta finalitat s'han dissenyat dues proteïnes parcials derivades de QsHsp17.4-CI: una a la que li falta la regió N-terminal (C105) i una altra amb pràcticament tot el domini -cristal·lí deleccionat (N61), i una tercera, derivada de QsHs10-CI, a la que li falta la meitat del domini -cristal·lí (Hsp10). També s'estudia la possible capacitat estabilitzadora de membranes i la capacitat de modificar l'expressió d'altres Hsps quan s'expressa de forma heteròloga. Els nostres resultats demostren que l'expressió de QsHsp17.4-CI protegeix a les cèl·lules d'E.coli de l'estrès tèrmic alhora que la regió N-terminal i la regió consens II del domini -cristal·lí són imprescindibles per aquesta funció de protecció. En relació a un possible paper en les membranes, els estudis de localització subcel·lular mostren que QsHsp17.4-CI colocalitza amb la fracció membranes i que la regió N-terminal de la proteïna és responsable d'aquesta colocalització. No s'ha pogut demostrar, però, que la localització amb la membrana estigui associada a un efecte protector d'aquesta: en cap cas la sobrexpressió de les proteïnes modifica la composició d'àcids grassos i només N61, que no té acció termoprotectora, altera l'estat fisico-químic de la membrana. En estudis d'expressió de novo en E.coli s'ha observat que, a diferència de les altres proteïnes heteròlogues, N61 activa l'expressió de la majoria de Hsps d'E.coli fent pensar en una possible relació entre l'estat físic de la membrana i l'activació de la resposta a l'estrès. En resum, en aquest treball hem provat la capacitat protectora de QsHsp17.4 i aportem noves dades sobre la importància de la regió N-terminal i la regió consens II del domini -cristal·lí en aquesta funció. Per altra banda, es suggereix que QsHsp17.4 podria interaccionar amb la membrana d'E.coli i que la regió N-terminal seria imprescindible per aquesta interacció. Finalment hem determinat que les proteïnes que provoquen variacions en l'estat de fluïdesa de la membrana poden activar la resposta al xoc de calor per part de la cèl·lula bacteriana.

Noves aproximacions a la síntesi i caracterització de poliglicols al·lílics, polihidrosiloxans i surfactants copolimèrics. Avaluació d'aquests surfactants en formulacions de poliuretà

Els polímers són una sèrie de compostos que troben un ampli ventall d'aplicacions en la indústria actual. Un exemple són les espumes de poliuretà, estructures de tipus cel·lular obtingudes mitjançant la reacció química entre compostos de tipus isocianat i compostos de tipus poliol (polièters amb diferent nombre de grups hidroxil). És imprescindible l'ús d'additius d'estructura tensioactiva (surfactants de silicona) per estabilitzar el procés d'espumació i per proporcionar una estructura cel·lular ordenada i homogènia en mida i distribució. La síntesis i caracterització de les molècules precursores (polihidrosiloxans i polièters al·lílics), l'estudi de la reacció d'hidrosililació com a via d'obtenció dels diferents surfactants per reacció d'addició entre els polihidrosiloxans i els polièters al·lílics i la caracterització i avaluació en formulacions comercials de poliuretà dels surfactants sintetitzats han constituït els objectius del present treball. MEMÒRIA La Tesi Doctoral ha estat presentada seguint el següent esquema: CAPÍTOL I. INTRODUCCIÓ A LA QUÍMICA DEL POLIURETÀ. Es presenten els principis de la química del poliuretà, fent esment dels recents avenços en la síntesis i caracterització d'aquests compostos polimèrics, així com un apartat concret centrat en els surfactants de silicona. Es presenten les estructures habituals d'aquests compostos comercials i es detallen les reaccions de síntesi i les característiques físiques que aquests compostos proporcionen a les espumes de poliuretà. CAPÍTOL II. OBJECTIUS. 1.- Síntesis y caracterització d'una àmplia gamma de poliglicols al·lílics i de polihidrosiloxans amb grups hidrur reactius, ambdós precursors d'estructures polimèriques de tipus surfactant. 2.- Estudi de la reacció d'hidrosililació com a via de formació d'enllaços Si-C no hidrolitzables, mitjançant la reacció d'addició entre els substrats al·lílics insaturats i els polisiloxans amb grups hidrur reactius. 3.- Caracterització de les estructures polimèriques de tipus surfactant sintetitzades i avaluació d'aquestes en formulacions de poliuretà, a fi de relacionar l'estructura química d'aquests oligómers amb els efectes físics que originen en l'espuma de poliuretà. CAPÍTOL III. SÍNTESI I CARACTERITZACIÓ DE SUBSTRATS AL·LÍLICS INSATURATS DE TIPUS POLIGLICOL. S'han caracteritzat per HPLC-UV una sèrie de polietilenglicols comercials. S'ha estudiat la reacció de derivatització al·lílica sobre els grups hidroxil dels polièters comercials (PEG, PPG i copolímers PEG-PPG) i s'han caracteritzat exhaustivament els productes sintetitzats (1H,13C-RMN, GC, GC-MS, FTIR, ESI-MS, HPLC-UV). S'ha iniciat un estudi de polimerització aniònica sobre nous epòxids amb un punt de diversitat molecular, sintetitzant-se i caracteritzant-se els corresponents nous polièters obtinguts. CAPÍTOL IV. SÍNTESI I CARACTERITZACIÓ DE POLIHIDROSILOXANS REACTIUS. S'estudia la síntesis de polihidrosiloxans amb grups hidrur reactius, mitjançant la reacció de polimerització aniònica d'obertura d'anell ("AROP, anionic ring opening polimerization") i mitjançant la reacció de polimerització per equilibració catiònica. Es presenta una caracterització exhaustiva dels productes sintetitzats i es descriu la naturalesa de la microestructura polimèrica a partir de la distribució bivariant dels copolímers PDMS-co-PHMS (poli(dimetilsiloxà)-co-poli(hidrometilsiloxà)). CAPÍTOL V. ESTUDI SISTEMÀTIC DE LA REACCIÓ D'HIDROSILILACIÓ. S'ha estudiat la reacció d'hidrosililació amb la finalitat de sintetitzar estructures copolimèriques poliglicol-polisiloxà a partir de la reacció de polisiloxans hidrur reactius i polièters al·lílics. S'han provat diferents catalitzadors (Pt/C 5%, cat. de Speier i cat. de Karstedt), s'han sintetitzat diferents estructures tensoactives (lineals i ramificades) i s'ha modelitzat les diferents reaccions secundàries observades, per presentar un estudi mecanístic de la reacció d'hidrosililació aplicada a la síntesis de molècules d'elevat PM a partir de la reacció entre substrats al·lílics insaturats i polihidrosiloxans. CAPÍTOL VI. AVALUACIÓ DELS SURFACTANTS EN FORMULACIONS DE POLIURETÀ. S'ha estudiat la idoneïtat dels surfactants de silicona sintetitzats en diferents formulacions de poliuretà comercials. S'ha relacionat el comportament físic d'aquests surfactants en les espumes de poliuretà amb la seva estructura química a partir de l'anàlisi per microscòpia electrònica de rastreig. CAPÍTOL VII. CONCLUSIONS. S'han esposat les conclusions extretes de cada capítol.