Anatomia macroscòpica i microscòpica de l'aparell genital femení d'Ophidion barbatum (L.) (Pisces, Ophididae)

S'ha realitzat un estudi de l'anatomia macroscòpica i microscòpica de I'ovari d'Ophidion barbatum (L.) (Pisces, Ophidiidae), utilitzant material recollit per pescadors del port de Blanes (mar català) durant el mes d'octubre de 1985. L'absència d'òrgan copulador en els mascles d'aquesta espècie i la posició de l'orifici nasal anterior, a una certa alçada respecte al llavi superior, ens permet identificar-la com una espècie ovípara, del subordre Ophidioidei, dins de l'ordre Ophidiiformes. L'ovari és únic i continuat caudalment per l'oviducte. Els nombrosos cordons intraovarics que tapien la cavitat augmenten considerablement la superfície germinal. El desenvolupament de l'ovari es correspon amb el tipus asincrònic (Marza, 1938) i la fresa repetida al llarg d'una estació reproductiva més o menys llarga és una estrategia que augmenta la fecunditat, normalment limitada pel volum corporal de la femella. Dins de l'ordre Ophidiiformes, el tipus d'ovari únic sense restes de paret mitjana sembla ser la norma entre les espècies de reproducció ovípara. Aquest fet esta en contradicció amb la teoria de Mendoza (1943) que, fora d'algunes excepcions, l'ovari únic es troba principalment en els teleostis vivípars

Estructura i ultraestructura testicular del mascle reproductor porcí (Sus domesticus)

El present treball analitza al microscopi òptic i al microscopi electrònic de transmissió el testicle de Sus domesticus (raça Landrace - varietat anglesa) a partir de mascles reproductors porcins adults i sans. L'objectiu principal de tots els centres d'Inseminació Artificial Porcina i de les Explotacions de Selecció i Multiplicació Porcina és garantir una excel·lent qualitat espermàtica al llarg de la vida reproductiva útil d'un mascle reproductor porcí. Així doncs, un millor coneixement dels patrons estructural i ultraestructural normals del testicle permetrà diagnosticar amb facilitat quina ha estat l'estructura o funció testicular afectada quan s'observa una disminució de la qualitat del semen. Les anàlisis seminals i hormonals són certament crucials en la valoració d'aquests mascles, però, no són totalment informatives de les alteracions testiculars, ja que és necessari conèixer l'organització microscòpica. Diversos estudis sobre testicle han demostrat que els marcadors més sensibles per a l'avaluació de la funció testicular són els següents: (1) la grandària testicular, (2) el gruix i l'organització de la càpsula testicular, (3) el percentatge de túbuls seminífers i de teixit intersticial en el parènquima testicular, (4) el diàmetre dels túbuls seminífers, (5) l'alçada i la composició de cèl·lules germinals de l'epiteli seminífer, (6) el gruix i l'organització de la làmina pròpia i, (7) la morfologia i la grandària de les cèl·lules de Leydig. El primer objectiu concret del present estudi ha estat, per tant, caracteritzar tots aquests paràmetres testiculars en mascles porcins sans i adults. L'organització estructural del testicle i les mesures quantitatives utilitzades com a marcadors no mostren diferències significatives ni entres els mascles porcins (P > 0,01), ni entre el testicle dret i l'esquerre (P > 0,01). Els testicles, de 330,80  16,99 g de pes, estan envoltats per una càpsula, de 2.375,13  246,68 m de gruix, la qual es divideix en tres capes: la túnica vaginalis constitueix l'1,82  0,78 % de la càpsula i està composta per una capa mesotelial externa i una capa interna de teixit conjuntiu dens; la túnica albuginea representa el 37,31  3,27 % i és de teixit conjuntiu dens i, la túnica vasculosa constitueix el 64,24 4,40 % i és de teixit conjuntiu lax. En el parènquima testicular els túbuls seminífers i el teixit intersticial representen el 72,44  2,12 % i el 27,46  2,12 %, respectivament. Els túbuls seminífers, de 226,23  18,08 m de diàmetre, es troben fortament recargolats i empaquetats, i estan compostos per la làmina pròpia i l'epiteli seminífer. La làmina pròpia, de 4-4,5 m de gruix, està formada per la làmina basal i dues capes de cèl·lules peritubulars. L'epiteli seminífer, amb una alçada mitjana de 66,11  10,62 m, és columnar i estratificat amb cèl·lules de Sertoli i diferents generacions d'espermatogònies, espermatòcits i espermàtides. El teixit intersticial és un teixit conjuntiu lax amb abundants cèl·lules de Leydig polièdriques fortament empaquetades (ca. 15 x 12 m). El segon objectiu concret d'aquest estudi ha estat estudiar des del punt de vista morfològic i morfomètric (alçada, longitud, freqüència relativa d'aparició i durada) els estadis del cicle de l'epiteli seminífer en els mascles porcins de la raça Landrace (varietat anglesa), classificats d'acord amb el mètode de la morfologia tubular. Els estadis premeiòtics ( I, II i III) ocupen el 31,9 % del cicle espermatogènic i es caracteritzen, principalment, per la presència de cèl·lules en les fase inicials de la meiosi I. Les primeres etapes de la meiosi I no afecten els paràmetres morfomètrics de l'epiteli seminífer ja que els valors obtinguts per l'alçada de l'epiteli seminífer, la freqüència relativa, la longitud i la durada d'aquests estadis són molt variables. Els estadis meiòtics (IV i V) representen el 16,4 % del cicle espermatogènic i estan constituïts, principlament, per cèl·lules en un estat avançat de la meiosi I i /o cèl·lules en meiosi II. Les últimes fases de la meiosi I i també de la meiosi II tenen lloc ràpidament, la qual cosa resulta en una baixa freqüència relativa d'aparició i, per tant, en una baixa durada dels estadis meiòtics. Els estadis postmeiòtics (VI, VII i VIII) ocupen el 50,6 % del cicle espermatogènic. L'esdeveniment més important que té lloc en aquests estadis és la fase de maduració de l'espermiogènesi. En la fase de maduració, les espermàtides experimenten diverses modificacions morfològiques i estructurals que donen lloc, finalment, als espermatozoides. La complexitat d'aquests processos fa que els estadis postmeiòtics presentin valors més grans de freqüència relativa, longitud i durada. El tercer objectiu concret d'aquest treball ha estat descriure a nivell ultraestructural el procés d'espermiogènesi, i relacionar les transformacions que experimenten les espermàtides en fase d'elongació amb els canvis ultraestructurals que tenen lloc en les diferents cèl·lules que constitueixen el testicle (cèl·lules germinals, de Sertoli i de Leydig, principalment). L'espermiogènesi del mascle porcí de la raça Landrace (varietat anglesa) s'ha dividit en 9 passos que vénen definits per 9 tipus diferents d'espermàtides. Al llarg de l'espermiogènesi no s'observen diferències ultraestructurals significatives (P > 0,01) ni entre els mascles porcins ni entre el testicle esquerre i dret en les cèl·lules que constitueixen el testicle.

Estudi d'un receptor quinasa atípic (Mark) i de les proteïnes que interaccionen amb el seu domini intracel·lular. Transducció del senyal i desenvolupament en blat de moro (Zea mays)

Aquesta tesi doctoral s'engloba dins d'un projecte general d'estudi de gens implicats en l'embriogènesi del blat de moro. L'embriogènesi del blat de moro, i en general la de totes les plantes superiors, es dóna en tres etapes: una primera etapa on es diferencien tots els diversos teixits que formaran l'embrió, una segona etapa on l'embrió acumula productes de reserva i un tercer període, la dormància, que finalitza quan les condicions ambientals són les idònies per a la germinació. En el laboratori estàvem interessats, concretament, en l'estudi de gens implicats en la primera etapa morfogenètica, on els diferents teixits i estructures embrionàries queden definides. Per tal d'estudiar gens que s'expressaven en aquest període, una de les estratègies que es va realitzar fou un crivellat diferencial entre teixit embrionari i teixit de planta adulta. D'entre els diferents clons obtinguts, un corresponia a un clon parcial que presentava similitud amb receptors quinasa i que fou objecte d'estudi. A partir d'aquest clon es va obtenir el clon complet i es va anomenar MARK (per Maize Atypical Receptor Kinase). MARK presenta una estructura típica d'un receptor quinasa amb un domini extracel.lular, que conté 6 còpies imperfectes de LRR (Leucine- Rich Repeats), un únic domini transmembrana i un domini quinasa intracel.lular. El domini quinasa de MARK presenta, però, algunes variacions en els residus aminoacídics que es consideren claus per a la funció catalítica dels dominis quinasa. En concret cinc dels aminoàcids considerats essencials per a la fosforilació es troben substituits en el domini quinasa de MARK (DK-MARK). Els experiments de fosforilació in vitro que es van realitzar al laboratori, van mostrar com MARK era incapaç de fosforilar in vitro. Aquesta característica no és, però, exclusiva de MARK. Una búsqueda en les bases de dades ens van permetre identificar altres seqüències que també presentaven els mateixos o altres canvis en aquestes posicions aminoacídiques. En les bases de dades de plantes es van identificar un conjunt de seqüències genòmiques o ESTs amb aquestes característiques i només una d'elles, la proteïna TMKL1 d'Arabidopsis, ha sigut descrita com un receptor quinasa incapaç de fosforilar in vitro. Respecte a la búsqueda de receptors similars a MARK en les bases de dades d'animals, es van identificar també un conjunt de proteïnes que, en alguns casos, s'ha descrit que no tenen activitat quinasa in vivo. Per exemple, un dels casos més ben estudiats és el del receptor erbB3 que forma part de la família de receptors del EGF (Epidermal Growth Factor). Aquesta família de receptors està formada per 4 receptors: erbB1, erbB2, erbB3 i erbB4, dels quals només l'erbB3 no presenta activitat catalítica. S'ha descrit que erbB3 és capaç, tot i no fosforilar in vivo, de participar activament en la transducció del senyal formant heterodímers amb els altres membres de la família. Així, erbB3 és fosforilat pel seu partner i pot iniciar la cascada de transducció del senyal. La participació d'erbB3 en la transducció del senyal és essencial ja que embrions de ratolí knock-out pel gen erbB3 són inviables. Així doncs, el fet que receptors quinasa catalíticament inactius participin en les cascades de transducció del senyal, suggereix l'existència de nous mecanismes d'acció per a la transducció del senyal. Per tant, l'objectiu d'aquest treball fou l'estudi del mecanisme d'acció de MARK mitjançant la caracterització les proteïnes capaces d'interaccionar amb el seu domini quinasa. Per tal d'assolir aquest objectiu, es va realitzar un crivellat de doble-híbrid amb una llibreria de cDNA d'embrions de blat de moro de 7 DAP. D'aquest crivellat es va obtenir un conjunt de possibles clons positius que foren seqüenciats i entre els quals es van escollir per un estudi més detallat aquells que s'havien obtingut més vegades com a clons independents. Aquests clons codificaven per: una SAMDC (S-Adenosil Descarboxilasa), una eIF5 (Eukaryotic translation initiation), una hypothetical protein, una unknown protein, una gamma-adaptina i una MAP4K. Amb aquests 6 clons es van fer estudis in vitro i in vivo per tal de confirmar al seva interacció amb DK-MARK. Els estudis in vivo es van realitzar amb la soca de llevat AH109, una soca més astringent que la utilitzada en el crivellat, ja que presenta tres gens marcadors: Histidina, Adenina i Lacz. Els resultats obtinguts van mostrar que els clons codificants per SAMDC i eIF5 no van créixer en un medi selectiu per His i Ade i, per tant o es tracta de falsos positius del sistema o la seva interacció amb DK-MARK és dèbil. D'altra banda, la resta dels clons analitzats (proteïna hipotètica, una proteïna de funció desconeguda, la gamma-adaptina i una MAP4K) van créixer en medis en absència de Histidina i Adenina. Els assatjos de b-galactosidasa van ser tots positius a excepció de la proteïna hipotètica suggerint que potser aquesta interacció sigui més feble. D'altra banda també es van realitzar estudis in vitro amb la tècnica del pull-down. Els resultats obtinguts amb aquesta tècnica van recolzar els obtinguts en cèl.lules de llevat, ja que tots els clons analitzats a excepció dels codificants per SAMDC i eIF5 van donar un resultat d'interacció amb KD-MARK in vitro positiu. Davant aquests resultats ens vam centrar en l'estudi de la proteïna similar a MAP4K, doncs algunes proteïnes de la seva família s'han relacionat amb receptors de membrana. Els clons que es va obtenir del crivellat codificaven per una proteïna similar amb el domini C-terminal a les proteïnes BnMAP4Ka1 i a2 de Brassica napus. Aquestes proteïnes presenten una forta similitud de seqüència amb proteïnes de la família GCK/SPS1 que formen part d'un grup particular de MAPK relacionades amb la proteïna Ste20 (sterile 20 protein) de llevat. Ste20p activa la MAP3K de llevat Ste11 directament per fosforilació, transduint d'aquesta manera el senyal del receptor de feromones de creuament de les cèl.lules de llevat i es pot, doncs, considerar com una proteïna del tipus MAP4K (mitogen-activated protein kinase kinase kinase kinase). En els darrers anys, s'han identificat un gran nombre de proteïnes similars a Ste20: fins a una trentena en mamífers, en Drosophila, en Caenorhabditis elegans i en altres organismes. Segons la seva estructura aminoacídica, la família Ste20 s'ha classificat en dues subfamílies: les proteïnes STE20/PAK (p21-activated kinases) i la subfamília GCK/SPS1 (germinal center kinases). Les dues subfamílies estan formades per proteïnes que contenen un domini quinasa i un domini regulador, però, mentre que les proteïnes PAK presenten el domini quinasa en la part C-terminal, les GCKs el presenten en la regió N terminal. Les proteïnes GCK presenten una elevada diversitat estructural en el domini regulador permetent la seva classificació en 6 subfamílies. Mitjançant la tècnica del RACE es va obtenir el clon de cDNA complet que es va anomenar MIK (MARK Interacting Kinase). Amb la tècnica del Southern blot es va poder determinar que el gen MIK és un gen de còpia única en el genoma de blat de moro. Per tal d'analitzar la possible interacció entre DK-MARK i MIK, es va estudiar tant el patró d'expressió d'ambdós gens com el seu patró d'acumulació d'ambdues proteïnes durant l'embriogènesi del blat de moro. El patró d'expressió, analitzat per Northen blot va mostrar uns patrons coincidents al llarg de l'embriogènesi des del seu inici fins als 20 DAP amb una acumulació màxima de mRNA en embrions de 15 DAP. D'altra banda per tal d'estudiar el patró d'acumulació de la proteïna MIK així com per comparar-lo amb el de MARK, es van realitzar estudis de Westerns blot. Els resultats també van mostrar una coincidència en el temps de l'acumulació de les proteïnes MARK i MIK durant l'embriogènesi de blat de moro amb una major acumulació en embrions de 15 i 20 DAP. Es van dur a terme també estudis d'immunolocalitzacions sobre embrions de blat de moro de 15 DAP per tal d'estudiar en quins teixits s'acumulaven ambdues proteïnes. Les immunolocalitzacions van mostrar una major acumulació tant de MARK com de MIK en les zones meristemàtiques i en el teixit vascular sobretot del coleòptil on s'aprecia una forta co-localització de MARK i MIK. Totes aquestes dades són compatibles, doncs, amb una possible interacció de les proteïnes MARK i MIK, tot i que no la demostren. Per tal de demostrar la interacció es van realitzar experiments d'immunoprecipitació in vivo a partir d'extractes d'embrions. Malauradament, els resultats no són clars i en aquests moments en el laboratori s'estan posant a punt aquests experiments. També es van realitzar estudis comparatius de seqüència amb diferents proteïnes de la família GCK, mostrant una major similitud amb les proteïnes de la subfamília GCK-III. La subfamília GCK-III ha estat molt poc estudiada i en formen part un conjunt de proteïnes amb funcions molt diverses des de l'apoptosi, la citoquinesi o l'anòxia cel.lular. Per tant, la similitud de seqüència possiblement fa referència a una conservació en el mecanisme d'acció més que no pas a una conservació funcional. La possible interacció de MARK amb el domini C-terminal de MIK (el domini regulador) podria activar aquesta última iniciant una cascada de transducció del senyal en un model en el que una proteïna del tipus GCK-III faria de lligam directa entre un receptor de membrana i una cascada de senyalització intracel.lular. Aquest tipus de lligam entre un recepctor de membrana i mòduls intracel.lulars de senyalització s'ha descrit per a altres proteïnes GCK, si bé no directament sinó a través de proteïnes adaptadores. D'altra banda, la interacció directa de MARK, un receptor quinasa atípic que no té activitat catalítica, amb MIK suggereix un mecanisme on receptors atípics podrien interaccionar en la transducció del senyal activant la via de les MAPK.

L'oviparisme en la família Scorpaenidae (Pisces: Scorpaeniformes)

En aquest treball de tesi doctoral es descriu l'estructura gonadal, gametogènesi i cicle anual de Scorpaena porcus, S. scrofa i S. elongata per tal d'aprofundir en el coneixement dels diferents graus d'especialització dins l'oviparisme en peixos. Es pretén fer èmfasi en aquells trets inusuals que difereixen del què s'ha descrit fins ara per la majoria de les espècies ovípares de teleostis, i relacionar-los amb l'estratègia reproductiva de les espècies que els presenten El mostreig s'ha dut a terme de forma intensiva entre l'any 2000 i 2002, tot i que s'ha continuat recol·lectant mostres fins a l'agost de 2004, amb més o menys freqüència segons la necessitat. En total s'han obtingut 258 exemplars de S. porcus, 119 de S. scrofa i 46 de S. elongata. S'ha pogut veure com S. porcus, S. scrofa i S. elongata són espècies ovípares ovulípares especialitzades, ja que la seva estructura ovàrica presenta tot una sèrie de trets molt particulars i poc comuns a la resta de peixos ovípars estudiats fins ara: posició central del raquis musculo-connectiu que es troba envoltat completament pel lumen i la paret ovàrica; presència de peduncles en oòcits en fase de creixement secundari; escassetat i mida petita dels alvèols corticals; poc gruix de la zona radiata; i secreció d'una massa gelatinosa que engloba els ous en el moment de la posta. Totes aquestes característiques també s'han observat en Scorpaena notata, suggerint que l'especialització de l'oviparisme ovulípar es dóna en tot el gènere Scorpaena. L'estructura testicular i l'espermatogènesi d'aquestes espècies també és força particular. Per una banda els testicles són del tipus lobular no-restringit, tot i que presenten algunes característiques com la ordenació parcial dels cists segons l'estadi de maduració de les cèl·lules germinals que contenen i l'absència de lumen central, que actualment només s'ha observat en testicles del tipus lobular restringit de les espècies de la sèrie Aterinomorpha. Per l'altre banda, l'espermatogènesi és del tipus semicística, és a dir, els cists s'obren abans d'acabar tot el procés i les cèl·lules germinals s'acaben de desenvolupar a la llum del lòbul fins a espermatozoides. La posta d'aquestes espècies és múltipla i constisteix en una massa gelatinosa d'ous pelàgica, que en el cas de S. porcus s'alliberen entre els mesos de juny i agost, i en S. scrofa, a partir del mes de juliol. S'ha relacionat la presència d'aquesta massa amb un aparellament mascle-femella, de manera que el mascle alliberaria l'esperma directament sobre la massa d'ous, assegurant així la fartilització total dels mateixos.