Development of molecular-based techniques for the detection, identification and quantification of food-borne pathogens

La presencia de microorganismos patógenos en alimentos es uno de los problemas esenciales en salud pública, y las enfermedades producidas por los mismos es una de las causas más importantes de enfermedad. Por tanto, la aplicación de controles microbiológicos dentro de los programas de aseguramiento de la calidad es una premisa para minimizar el riesgo de infección de los consumidores. Los métodos microbiológicos clásicos requieren, en general, el uso de pre-enriquecimientos no-selectivos, enriquecimientos selectivos, aislamiento en medios selectivos y la confirmación posterior usando pruebas basadas en la morfología, bioquímica y serología propias de cada uno de los microorganismos objeto de estudio. Por lo tanto, estos métodos son laboriosos, requieren un largo proceso para obtener resultados definitivos y, además, no siempre pueden realizarse. Para solucionar estos inconvenientes se han desarrollado diversas metodologías alternativas para la detección identificación y cuantificación de microorganismos patógenos de origen alimentario, entre las que destacan los métodos inmunológicos y moleculares. En esta última categoría, la técnica basada en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se ha convertido en la técnica diagnóstica más popular en microbiología, y recientemente, la introducción de una mejora de ésta, la PCR a tiempo real, ha producido una segunda revolución en la metodología diagnóstica molecular, como pude observarse por el número creciente de publicaciones científicas y la aparición continua de nuevos kits comerciales. La PCR a tiempo real es una técnica altamente sensible -detección de hasta una molécula- que permite la cuantificación exacta de secuencias de ADN específicas de microorganismos patógenos de origen alimentario. Además, otras ventajas que favorecen su implantación potencial en laboratorios de análisis de alimentos son su rapidez, sencillez y el formato en tubo cerrado que puede evitar contaminaciones post-PCR y favorece la automatización y un alto rendimiento. En este trabajo se han desarrollado técnicas moleculares (PCR y NASBA) sensibles y fiables para la detección, identificación y cuantificación de bacterias patogénicas de origen alimentario (Listeria spp., Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis y Salmonella spp.). En concreto, se han diseñado y optimizado métodos basados en la técnica de PCR a tiempo real para cada uno de estos agentes: L. monocytogenes, L. innocua, Listeria spp. M. avium subsp. paratuberculosis, y también se ha optimizado y evaluado en diferentes centros un método previamente desarrollado para Salmonella spp. Además, se ha diseñado y optimizado un método basado en la técnica NASBA para la detección específica de M. avium subsp. paratuberculosis. También se evaluó la aplicación potencial de la técnica NASBA para la detección específica de formas viables de este microorganismo. Todos los métodos presentaron una especificidad del 100 % con una sensibilidad adecuada para su aplicación potencial a muestras reales de alimentos. Además, se han desarrollado y evaluado procedimientos de preparación de las muestras en productos cárnicos, productos pesqueros, leche y agua. De esta manera se han desarrollado métodos basados en la PCR a tiempo real totalmente específicos y altamente sensibles para la determinación cuantitativa de L. monocytogenes en productos cárnicos y en salmón y productos derivados como el salmón ahumado y de M. avium subsp. paratuberculosis en muestras de agua y leche. Además este último método ha sido también aplicado para evaluar la presencia de este microorganismo en el intestino de pacientes con la enfermedad de Crohn's, a partir de biopsias obtenidas de colonoscopia de voluntarios afectados. En conclusión, este estudio presenta ensayos moleculares selectivos y sensibles para la detección de patógenos en alimentos (Listeria spp., Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis) y para una rápida e inambigua identificación de Salmonella spp. La exactitud relativa de los ensayos ha sido excelente, si se comparan con los métodos microbiológicos de referencia y pueden serusados para la cuantificación de tanto ADN genómico como de suspensiones celulares. Por otro lado, la combinación con tratamientos de preamplificación ha resultado ser de gran eficiencia para el análisis de las bacterias objeto de estudio. Por tanto, pueden constituir una estrategia útil para la detección rápida y sensible de patógenos en alimentos y deberían ser una herramienta adicional al rango de herramientas diagnósticas disponibles para el estudio de patógenos de origen alimentario.

Estudio de las comunidades microbianas de embutidos fermentados ligeramente acidificados mediante técnicas moleculares. Estandarización, seguridad y mejora tecnológica.

Los embutidos fermentados ligeramente acidificados son un grupo de productos tradicionales mediterráneos, caracterizados por un pH superior a 5,3. Para un control eficiente de la seguridad microbiológica de los embutidos se necesitan técnicas rápidas para la identificación y recuento de los microorganismos patógenos a estudiar. En el presente trabajo, se desarrolló una técnica para la enumeración de L. monocytogenes que combinó el método del número más probable y la identificación mediante PCR específica. Para la detección de Salmonella spp. y L. monocytogenes se desarrolló un sistema de PCR-multiplex que permitió la identificación de ambos patógenos de forma simultánea en una sola reacción. El estudio de la calidad microbiológica de los embutidos fermentados ligeramente acidificados se completó con la caracterización de las comunidades microbianas más importantes en estos productos. Se identificaron a nivel de especie los aislados de bacterias del ácido láctico (BAL), de enterococos y de cocos gram-positivos catalasa-positivos (CGC+). Posteriormente se realizó una tipificación molecular de los mismos mediante RAPD y análisis del perfil plasmídico y se estudiaron las principales características de interés higiénico-sanitario y tecnológico de las cepas. Mediante PCR se identificó Lactobacillus sakei como la especie predominante (74%), seguida por Lactobacillus curvatus (21,2%). La actividad aminoácido-descarboxilasa se asoció a la especie L. curvatus (el 66% de los aislados presentaron esta actividad). La identificación de los enterococos se realizó mediante PCR-multiplex y por secuenciación del gen sodA. Enterococcus faecium fue la especie de enterococos predominante (51,9%) seguida por Enterococcus faecalis (14,2%). Todas las cepas de E. faecalis presentaron genes asociados a factores de virulencia. E. faecalis presentó mayor resistencia a antibióticos que el resto de las especies de enterococos estudiadas. Tan sólo una cepa de E. faecium presentó el genotipo vanA (que confiere resistencia de alto nivel a la vancomicina). La identificación de los aislados de CGC+ (mediante PCR específica y amplificación de la región intergénica 16S-23S ARNr) demostró que Staphylococcus xylosus es la especie predominante en los embutidos fermentados ligeramente acidificados (80,8%). La amina biógena más común en los CGC+ fue la feniletilamina, producida por un 10,8% de aislados. Un pequeño porcentaje de aislados fueron mecA+ (4,6%), presentando además resistencia a múltiples antibióticos. El potencial enterotoxigénico de las cepas de CGC+ fue muy reducido (3,3% de los aislados), detectándose únicamente el gen entC. El estudio pormenorizado de las comunidades bacterianas de interés permitió la selección de 2 cepas de L. sakei y 2 cepas de S. xylosus con características tecnológicas e higiénico-sanitarias óptimas. Para evaluar su efectividad como cultivos iniciadores se elaboraron dos tipos de embutidos ligeramente ácidos, chorizo y fuet, inoculados con microorganismos patógenos (Salmonella spp., L. monocytogenes y S. aureus). El uso de cultivos iniciadores permitió el control de L. monocytogenes, Enterobacteriaceae y Enterococcus así como del contenido en aminas biógenas. Los recuentos de Salmonella spp. disminuyeron de forma significante durante la maduración de los embutidos, independientemente del uso de cultivos iniciadores. El uso del tratamiento de alta presión (400 MPa) en los embutidos madurados consiguió la ausencia de Salmonella spp. en los lotes tratados.