Zelluläre und biochemische Charakterisierung der bifunktionalen Methyltransferase Dnmt2

Seit der Entdeckung der Methyltransferase 2 als hoch konserviertes und weit verbreitetes Enzym sind zahlreiche Versuche zur vollständigen Charakterisierung erfolgt. Dabei ist die biologische Funktion des Proteins ein permanent umstrittener Punkt. In dieser Arbeit wird dnmA als sensitiver Oszillator bezüglich des Zellzyklus und weiterer Einflüsse gezeigt. Insgesamt liegt der Hauptfokus auf der Untersuchung der in vivo Charakterisierung des Gens, der endogenen subzellulären Verteilung, sowie der physiologischen Aufgaben des Proteins in vivo in D. discoideum. Um Hinweise auf Signalwege in vivo zu erhalten, in denen DnmA beteiligt ist, war es zunächst notwendig, eine detaillierte Analyse des Gens anzufertigen. Mit molekularbiologisch äußerst sensitiven Methoden, wie beispielsweise Chromatin‐IP oder qRT‐PCR, konnte ein vollständiges Expressionsprofil über den Zell‐ und Lebenszyklus von D. discoideum angelegt werden. Besonders interessant sind dabei die Ergebnisse eines ursprünglichen Wildtypstammes (NC4), dessen dnmA‐Expressionsprofil quantitativ von anderen Wildtypstämmen abweicht. Auch auf Proteinebene konnten Zellzyklus‐abhängige Effekte von DnmA bestimmt werden. Durch mikroskopische Untersuchungen von verschiedenen DnmA‐GFP‐Stämmen wurden Lokalisationsänderungen während der Mitose gezeigt. Weiterhin wurde ein DnmA‐GFP‐Konstrukt unter der Kontrolle des endogenen Promotors generiert, wodurch das Protein in der Entwicklung eindeutig als Zelltypus spezifisches Protein, nämlich als Präsporen‐ bzw. Sporenspezifisches Protein, identifiziert werden konnte. Für die in vivo Analyse der katalytischen Aktivität des Enzyms konnten nun die Erkenntnisse aus der Charakterisierung des Gens bzw. Proteins berücksichtigt werden, um in vivo Substratkandidaten zu testen. Es zeigte sich, dass von allen bisherigen Substrat Kandidaten lediglich die tRNA^Asp als in vivo Substrat bestätigt werden konnte. Als besondere Erkenntnis konnte hierbei ein quantitativer Unterschied des Methylierungslevels zwischen verschiedenen Wildtypstämmen detektiert werden. Weiterhin wurde die Methylierung sowie Bindung an einen DNA‐Substratkandidaten ermittelt. Es konnte gezeigt werden, dass DnmA äußerst sequenzspezifisch mit Abschnitten des Retrotransposons DIRS‐1 in vivo eine Bindung eingeht. Auch für den Substrakandidaten snRNA‐U2 konnte eine stabile in vitro Komplexbildung zwischen U2 und hDnmt2 gezeigt werden. Insgesamt erfolgte auf Basis der ermittelten Expressionsdaten eine erneute Charakterisierung der Aktivität des Enzyms und der Substrate in vivo und in vitro.

Mechanismen kleiner regulatorischer RNAs in Dictyostelium discoideum: Charakterisierung und Anwendung

Die RNA-Interferenz (RNAi) ist ein in Eukaryoten weit verbreiteter Mechanismus, der die transkriptionelle oder posttranskriptionelle Stilllegung von Genen beschreibt. Die Spezifität wird dabei durch die Sequenz einer kleinen, nicht-kodierenden RNA gewährleistet. Diese RNA leitet einen Effektorkomplex, dessen Zentrum immer von einem Argonautenprotein gebildet wird, üblicherweise zu einer komplementären mRNA. In der Folge kommt es zum Abbau des Transkripts oder zur Inhibierung der Translation. Aktuelle Veröffentlichungen konnten zudem das Aktivitätsprofil der Argonautenproteine beträchtlich erweitern: Im Zellkern vorkommende Argonautenproteine wurden beispielsweise mit Spleißvorgängen, der Promotorkontrolle von Genen und der DNA-Reparatur in Verbindung gebracht. In den letzten Jahren konnten weitreichende Kenntnisse bezüglich der Kontrolle einiger transposabler Elemente durch RNAi sowie der Biogenese kleiner regulatorischer RNAs in Dictyostelium discoideum und anderen Organismen gewonnen werden. Ein Fokus dieser Arbeit lag zunächst auf der Charakterisierung des Argonautenproteins AgnB und der Identifikation von Interaktionspartnern. Es konnte gezeigt werden, dass AgnB zumindest partiell im Zellkern der Amöbe lokalisiert und dort vermutlich regulatorische Aufgaben wahrnimmt. Gestützt wurde diese Annahme durch die massenspektrometrische und Western Blot basierte Detektion nukleärer Bindungspartner. Weiterführende Analysen konnten AgnB zudem als positiven Regulator für drei entwicklungsregulierte Gene beschreiben und so die Verbindung zum Prozess der RNA activation in der Amöbe herstellen. Identifizierte posttranslationale Modifikationen könnten diesbezüglich die Aktivität des Argonauten steuern. Mit Hilfe von Crosslink-RNA-Immunopräzipitation und anschließender Hochdurchsatz-sequenzierung oder der Northern Blot basierten Auswertung konnte eine Assoziation von AgnB und der Class I RNAs gezeigt werden. Diese Klasse umfasst nicht-kodierende RNAs mit einer Länge von etwa 42 bis 65 Nukleotiden und wurde bisher nicht als Substrat für die RNAi-Maschinerie in D. discoideum angesehen. Ein weiterer Teil dieser Arbeit beschäftigte sich mit dem Einfluss von AgnA und AgnB auf die Promotorbereiche des D. discoideum Retrotransposons DIRS-1. Im Verlauf der Untersuchungen konnte beobachtet werden, dass die Anordnung entgegengesetzt operierender DIRS-1 Promotor-sequenzen für die Stilllegung eines Reportergens ausreichend war. Darauf aufbauend konnte ein DIRS-1 basiertes knockdown System etabliert werden. Mit Hilfe dieses Systems konnten die Proteinmengen ausgewählter Zielgene so effektiv reduziert werden, dass die entsprechenden Stämme den Phänotyp des korrespondierenden knockout Stammes zeigten. Darüber hinaus war es möglich die Proteinreduktion zu modulieren, um so beispielsweise dosisabhängige Effekte zu registrieren. Vorangegangene Arbeiten zur Biogenese von micro (mi)RNAs konnten das RNA-bindende Protein RbdB als eine Hauptkomponente für die Prozessierung maturer miRNAs identifizieren. Der miRNA defiziente RbdB- Stamm wurde in dieser Arbeit zur Identifikation putativer miRNA Ziele genutzt. Dazu wurde sowohl das Transkriptom des D. discoideum Wildtyps als auch des rbdB knockout Stammes in hohem Durchsatz sequenziert, um so differentiell exprimierte Gene zu detektieren. Vielversprechende Kandidaten wurden mittels qRT-PCR verifiziert. Dabei wurde unter anderem ein putativer Transkriptionsfaktor als miRNA target identifiziert, der eine Vielzahl weiterer Gene regulieren könnte. Abschließend konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass RbdB ebenfalls für die Generierung von small interfering (si)RNAs aus strukturierten Loci von Bedeutung ist. Dies weist auf mindestens zwei unterschiedliche Mechanismen zur siRNA Prozessierung in D. discoideum hin.