Studies of cap-independent mRNA translation in Drosophila melanogaster

Control of protein synthesis is a key step in the regulation of gene expression during apoptosis and the heat shock response. Under such conditions, cap-dependent translation is impaired and Internal Ribosome Entry Site (IRES)-dependent translation plays a major role in mammalian cells. Although the role of IRES-dependent translation during apoptosis has been mainly studied in mammals, its role in the translation of Drosophila apoptotic genes has not been yet studied. The observation that the Drosophila mutant embryos for the cap-binding protein, the eukaryotic initiation factor eIF4E, exhibits increased apoptosis in correlation with up-regulated proapoptotic gene reaper (rpr) transcription constitutes the first evidence for the existence of a cap-independent mechanism for the translation of Drosophila proapoptotic genes. The mechanism of translation of rpr and other proapoptotic genes was investigated in this work. We found that the 5 UTR of rpr mRNA drives translation in an IRES-dependent manner. It promotes the translation of reporter RNAs in vitro either in the absence of cap, in the presence of cap competitors, or in extracts derived from heat shocked and eIF4E mutant embryos and in vivo in cells transfected with reporters bearing a non functional cap structure, indicating that cap recognition is not required in rpr mRNA for translation. We also show that rpr mRNA 5 UTR exhibits a high degree of similarity with that of Drosophila heat shock protein 70 mRNA (hsp70), an antagonist of apoptosis, and that both are able to conduct IRES-mediated translation. The proapoptotic genes head involution defective (hid) and grim, but not sickle, also display IRES activity. Studies of mRNA association to polysomes in embryos indicate that both rpr, hsp70, hid and grim endogenous mRNAs are recruited to polysomes in embryos in which apoptosis or thermal stress was induced. We conclude that hsp70 and, on the other hand, rpr, hid and grim which are antagonizing factors during apoptosis, use a similar mechanism for protein synthesis. The outcome for the cell would thus depend on which protein is translated under a given stress condition. Factors involved in the differential translation driven by these IRES could play an important role. For this purpose, we undertook the identification of the ribonucleoprotein (RNP) complexes assembled onto the 5 UTR of rpr mRNA. We established a tobramycin-affinity-selection protocol that allows the purification of specific RNP that can be further analyzed by mass spectrometry. Several RNA binding proteins were identified as part of the rpr 5 UTR RNP complex, some of which have been related to IRES activity. The involvement of one of them, the La antigen, in the translation of rpr mRNA, was established by RNA-crosslinking experiments using recombinant protein and rpr 5 UTR and by the analysis of the translation efficiency of reporter mRNAs in Drosophila cells after knock down of the endogenous La by RNAi experiments. Several uncharacterized proteins were also identified, suggesting that they might play a role during translation, during the assembly of the translational machinery or in the priming of the mRNA before ribosome recognition. Our data provide evidence for the involvement of La antigen in the translation of rpr mRNA and set a protocol for purification of tagged-RNA-protein complexes from cytoplasmic extracts. To further understand the mechanisms of translation initiation in Drosophila, we analyzed the role of eIF4B on cap-dependent and cap-independent translation. We showed that eIF4B is mostly involved in cap-, but not IRES-dependent translation as it happens in mammals.

Posttranslationale Modifikationen und Interaktionspartner der Heterochromatin Protein 1-Homologe HcpA und HcpB in Dictyostelium discoideum

Die Epigenetik repräsentiert einen Teilbereich der Genetik, der sich mit Regulationsmechanismen befasst, welche Einfluss auf die Genexpression nehmen und dabei nicht auf Veränderungen in der DNA-Sequenz beruhen. Ein verbreiteter Mechanismus beruht auf der Kontrolle des Kondensationsgrades der DNA durch posttranslationale Modifizierung von Proteinen. Die Proteine können ein struktureller Bestandteil des Chromatins oder aber an dessen Etablierung und Aufrechterhaltung beteiligt sein. Heterochromatin Protein 1 (HP1) ist ein Schlüsselprotein bei der Bildung und Aufrechterhaltung heterochromatischer Strukturen. Zudem erfüllt es eine Reihe weiterer Funktionen und interagiert mit einer Vielzahl von Proteinen. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass die HP1-Homologe aus Dictyostelium discoideum umfangreich mit posttranslationalen Modifikationen versehen sind. Eine in der als Interaktionsdomäne bezeichneten Chromo-Shadow-Domäne gelegene Acetylierung steht zumindest in HcpB im Zusammenhang mit der Bildung von Heterochromatin. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass HcpB physisch mit der Histonmethyltransferase SuvA interagiert. Der Einfluss der oben genannten Acetylierung auf die Bildung von Heterochromatin könnte dabei sowohl auf der Kontrolle der Homo- bzw. Heterodimerisierung als auch auf der Kontrolle der Interaktion mit SuvA beruhen. Die hohe Konservierung von HP1-Proteinen führt zu der Frage, ob das humane Homolog HP1α die endogenen HP1-Homologe in Dictyostelium discoideum kompensieren kann. Während humanes HP1α in der Lage ist im Einzel-Knockout mit heterochromatischen Strukturen zu assoziieren scheint der Knockout des zweiten Homologes letal zu sein. Dies legt nahe, dass HP1α nur einen Teil der Funktionen übernehmen kann. Um Interaktionspartner von HcpA und HcpB zu bestimmen wurden mit bioinformatischen Methoden drei Proteine aus Dictyostelium als potentielle Komponenten des Chromatin Assembly Factor 1 (CAF1) identifiziert und untersucht. Vorhergehende Experimente aus anderen Arbeiten stützen die Annahme, dass es sich hierbei um Komponenten des Chromatin Assembly Factor 1 handelt.