Molekularbiologische Charakterisierung der Argonauten Proteine AgnA und AgnB innerhalb der RNA vermittelten Genregulation in D. discoideum

Argonauten Proteine übernehmen vielfältige Funktionen in RNA vermittelten Signalwegen zur Genregulation und sind in eukaryotischen Organismen hoch konserviert. Obwohl das Repertoire an kleinen regulatorischen RNAs in D. discoideum schon früh untersucht wurde und dabei sowohl siRNAs als auch miRNAs identifiziert werden konnten, war die Funktion der fünf kodierten Argonauten Proteine zu Beginn meiner Arbeit noch völlig unbekannt. Im Fokus meiner Untersuchung standen die zwei Homologe AgnA und AgnB. Die molekularbiologische Charakterisierung von AgnA hat gezeigt, dass das Protein eine essentielle Funktion bei der posttranskriptionellen Regulation des Retrotransposons DIRS-1 hat. AgnA wird für die Generierung von über 90 % der DIRS-1 siRNAs benötigt, wobei unklar ist, ob die Slicer-Aktivität des Proteins relevant ist oder ob AgnA andere Proteine zur Generierung der kleinen RNAs rekrutiert. Mit Hilfe der Deep Sequencing Analyse kleiner RNAs im AgnA KO konnte die Abreicherung der DIRS-1 siRNAs bestätigt werden. Die Anreicherung von DIRS-1 sense und antisense Transkripten weist deutlich auf eine Deregulation des Retrotransposons bei Abwesenheit von AgnA hin. Der Verlust der AgnA abhängigen Regulationsebene ist nicht nur auf RNA- sondern auch auf DNA-Ebene nachweisbar, da im AgnA Knockout einzelsträngige extrachromosomale DIRS-1 Intermediate nachweisbar sind. Die Analyse dieser Strukturen mit Hilfe von Rasterkraftmikroskopie zeigt, dass die extrachromosomale DNA mit Proteinen assoziiert ist. Das Erscheinungsbild legt die Vermutung nahe, dass es sich um Virus ähnliche Partikel handeln könnte. Die Transposition der DIRS-1 Elemente konnte nicht nachgewiesen werden. Sie schlägt vermutlich fehl, da der zur Integration notwendige DNA-Doppelstrang nicht gebildet wird. Auch wenn der genaue Mechanismus der AgnA abhängigen DIRS-1 Regulation nicht vollständig aufgeklärt werden konnte, weisen die Ergebnisse darauf hin, dass AgnA nicht nur an der Biogenese der kleinen DIRS-1 siRNAs beteiligt ist, sondern auch weiter downstream, vermutlich innerhalb von Effektorkomplexen, als Regulator aktiv ist. AgnB ist nicht an der negativen Regulation des DIRS-1 Retrotransposons beteiligt. Im Gegenteil haben Experimente gezeigt, dass das Protein die Transkription des Elementes und die Bildung von DNA-Intermediaten eher positiv beeinflusst. Im Fall des Retrotransposons Skipper ist unklar, ob die wenigen siRNAs, die identifiziert worden sind, tatsächlich für die Regulation dieses Elementes genutzt werden. Der Knockout von AgnA hat eine Anreicherung der Skipper siRNAs zur Folge, wobei diese sehr variabel ist. Es konnten Skipper Transkripte nachgewiesen werden (Hinas et al., 2007), die wahrscheinlich die Vorläufermoleküle der siRNAs darstellen. Die Menge dieser Transkripte unterscheidet sich allerdings im Wildtyp und den untersuchten Knockout-Stämmen nicht. Bei der Untersuchung der miRNAs zeigte sich eine signifikante Anreicherung dieser regulatorischen RNAs im AgnA Knockout. Die Akkumulation kann durch die Expression von rekombinantem AgnA wieder auf Wildtyp Niveau gebracht werden. Die genaue Funktion von AgnA im miRNA Signalweg konnte aber nicht näher spezifiziert werden. Im Fall der beiden miRNAs konnte im Rahmen dieser Arbeit nachgewiesen werden, dass sie keine 2‘-O Methylierung besitzen und fast ausschließlich im Cytoplasma der Zelle vorliegen. Letzteres weist darauf hin, dass die untersuchten miRNAs ihre Zielgene vermutlich posttranskriptionell regulieren. Die Akkumulation von miRNAs im AgnA KO konnte ebenfalls durch Deep Sequencing Analysen verifiziert werden. Weiterhin wurden tRNA Fragmente gefunden, die im AgnA KO wesentlich stärker vertreten sind. Northern Blot Analysen haben gezeigt, dass ein zusätzliches Fragment der tRNA Asp akkumuliert, wenn AgnA nicht exprimiert wird. Möglicherweise ist AgnA am Umsatz der tRNA beteiligt. Die biologische Funktion der tRNA Fragmente in D. discoideum ist jedoch bisher ungeklärt. Bei der Suche nach putativen Interaktionspartnern konnte im Fall von AgnA das Protein DDB_G0268914 mittels Massenspektrometrie als putativer Interaktionspartner identifiziert werden. Dieses Protein zeigt Homologien zu MOV10 aus H. sapiens, das ebenfalls mit Argonauten Proteinen interagiert (Hock et al., 2007) und die Replikation von Retroviren unterdrückt (Burdick et al., 2010). Die Interaktion zwischen AgnA und dem MOV10 Homolog konnte bisher nicht mit anderen Ansätzen bestätigt werden. Darüber hinaus bleibt zu klären, ob der putative Interaktionsparter ebenfalls an der Regulation des Retrotransposons DIRS-1 beteiligt ist.

Loss of wobble uridine modification in tRNA anticodons interferes with TOR pathway signaling

Previous work in yeast has suggested that modification of tRNAs, in particular uridine bases in the anticodon wobble position (U34), is linked to TOR (target of rapamycin) signaling. Hence, U34 modification mutants were found to be hypersensitive to TOR inhibition by rapamycin. To study whether this involves inappropriate TOR signaling, we examined interaction between mutations in TOR pathway genes (tip41Δ, sap190Δ, ppm1Δ, rrd1Δ) and U34 modification defects (elp3Δ, kti12Δ, urm1Δ, ncs2Δ) and found the rapamycin hypersensitivity in the latter is epistatic to drug resistance of the former. Epistasis, however, is abolished in tandem with a gln3Δ deletion, which inactivates transcription factor Gln3 required for TOR-sensitive activation of NCR (nitrogen catabolite repression) genes. In line with nuclear import of Gln3 being under control of TOR and dephosphorylation by the Sit4 phosphatase, we identify novel TOR-sensitive sit4 mutations that confer rapamycin resistance and importantly, mislocalise Gln3 when TOR is inhibited. This is similar to gln3Δ cells, which abolish the rapamycin hypersensitivity of U34 modification mutants, and suggests TOR deregulation due to tRNA undermodification operates through Gln3. In line with this, loss of U34 modifications (elp3Δ, urm1Δ) enhances nuclear import of and NCR gene activation (MEP2, GAP1) by Gln3 when TOR activity is low. Strikingly, this stimulatory effect onto Gln3 is suppressed by overexpression of tRNAs that usually carry the U34 modifications. Collectively, our data suggest that proper TOR signaling requires intact tRNA modifications and that loss of U34 modifications impinges on the TORsensitive NCR branch via Gln3 misregulation.

Genregulation in der Drosophila Spermatogenese am Beispiel der Mst(3)CGP-Genfamilie

In dieser Dissertation wird die Rolle des zentralen Kontrollelementes TCE auf unterschiedlichen Ebenen der Genexpression untersucht. Das TCE verhindert die Translation prämeiotisch gebildeter mRNAs in der Spermatogenese von Drosophila bis zu einem späten postmeiotischen Stadium. Gleichzeitig provoziert es Transkriptionsaktivität. Das TCE wurde zunächst in einer kleinen Genfamilie identifiziert und am Beispiel des Gens Mst87F detaillierter untersucht. In EMSA-Experimenten wurde die Komplexbildung mit regulatorischen Proteinen aus Proteinextrakten des Hodengewebes am TCE der Mst87F mRNA nachgewiesen. Massenspektrometrische Analysen ergaben u.a. die Kandidatenproteine Exuperantia (Exu), dFmr1 und CG3213. Die Komplexbildung an einem zweiten Mitglied der Genfamilie - Mst98Ca -, welches sich in der Genstruktur und dem Proteinaufbau von Mst87F unterscheidet, belegt die Allgemeingültigkeit dieser Interaktion. Beim Einsatz von veränderten TCE-Sequenzen ergibt sich ein abweichendes Erscheinungsbild der Komplexe, was mit dem Verlust der Funktion korreliert. Auch die Komplexbildung mit den rekombinanten Proteinen von exuperantia und dfmr1 erfolgt an beiden RNAs in gleicher Weise. In Kombination wird ein stärkerer Shift erzeugt. In einer Exu-defizienten Mutante beobachtet man drastische Veränderungen in der Lokalisation von einem Mst87F-GFP- bzw. CG3213-GFP-Fusionsprotein. Analysen mittels der qPCR zeigen eine drastische Verringerung der Mst87F mRNA Menge. Beides lässt vermuten, dass das Fehlen von Exu bereits in frühen Stadien zu molekularen Defekten führt. Um die Translationskontrolle zu umgehen, wurden Transgene mit einer IRES (aus dem Gen reaper) an verschiedenen Positionen des 5'UTRs erzeugt. Die erwartete Translationsinitiation durch die IRES blieb aus. Northern- und qPCR-Analysen zeigen eine starke Reduktion des mRNA-Niveaus. Somit kann aufgrund der drastischen Deregulation auf Transkriptionsebene der Effekt auf die Translationskontrolle nicht mehr analysiert werden. Überraschenderweise wurden durch die Verwendung einer anderen IRES (aus der Genkassette CG31311) die Expressionscharakteristika des Ursprungsgens auf Mst87F übertragen. Das Fusionsprotein lässt sich plötzlich in den Ommatidien der Komplexaugen nachweisen. Da aus früheren Arbeiten bereits eine Rolle des TCE auf Transkriptionsebene nachgewiesen ist, wurde die Komplexbildung auf Mst87F-DNA-Fragmente mit TCE ausgedehnt. Analysen unter Verwendung der rekombinanten Proteine Exu und dFmr1 verliefen negativ. Daraufhin sollten massenspektrometrische Experimente neue Kandidaten für regulatorische Proteine auf DNA-Ebene identifizieren. Von vier weiteren Kandidaten zeigen zwei unter RNAi-Einfluß komplette Sterilität und starke Defekte in der Spermienentwicklung.