Vergleichende Untersuchungen Methicillin-resistenter Staphylococcus aureus des Klinikums Kassel der Jahre 1999 bis 2004

Die vorliegende Arbeit liefert erstmals einen umfassenden Überblick über die molekulare Epidemiologie von Methicillin resistenten Staphylococcus aureus (MRSA) eines nordhessischen Krankenhauses inklusive seines Umfeldes und deren Entwicklung in einem Zeitraum von fünf Jahren. Von besonderer Bedeutung ist, dass die MRSA-Stämme hierfür nicht nur anhand ihrer SCCmec-Region (staphylococcal cassette chromosome) typisiert wurden, sondern eine weitergehende Charakterisierung auf Grund der Bestimmung des Vorkommens von Antibiotikaresistenz- und Toxingenen, sowie Plasmiden erfolgte. Dabei wurde ein neuer SCCmec-Typ entdeckt und charakterisiert und weitere noch unbekannte SCCmec-Elemente beschrieben. Bei der Charakterisierung der MRSA-Kollektive konnten bzgl. aller untersuchten Eigenschaften im Laufe der Zeit signifikante Veränderungen beobachtet werden. Am deutlichsten waren diese Unterschiede zwischen dem ältesten Kollektiv aus 1999 und allen nachfolgenden Kollektiven. Die Kollektive aus 2001, 2002, 2003 und 2004 zeigten untereinander größere Ähnlichkeiten, aber dennoch gleichzeitig eine tendenziell divergente Entwicklung einzelner Eigenschaften. Besonders auffallend war das dominante Auftreten von SCCmecIV mit 63-87% der Isolate eines Kollektivs ab 2001, gegenüber 16% in 1999. Weiterhin erfolgte eine markante Veränderung im Vorkommen einzelner Antibiotikaresistenzgene von 1999 bis 2004. So waren aacA-aphD und ermA bei MRSA aus 1999 mit 84% bzw. 90% deutlich häufiger als in allen Kollektiven der folgenden Jahre (aacA-aphD: max. 32%, ermA: max. 40%). Wohingegen ermC ein stets zunehmendes Vorkommen von 3% auf 67% über den Untersuchungszeitraum zeigte. Unkontinuierliches aber statistisch relevant vermehrtes Auftreten von tetM konnte bei Isolaten aus 1999 (40%) und 2004 (74%) nachgewiesen werden. Auch bei Toxingenen zeigten sich deutliche Unterschiede in der zeitlichen Verteilung. Ab 2001 zeigten alle Isolate wesentlich höhere Anteile an sec, seg und sei verglichen mit den MRSA aus 1999. So konnte sec im Kollektiv aus 1999 gar nicht nachgewiesen werden, in denen der Folgejahre mit 54-77%. Die Werte für seg und sei stiegen von 48% bzw. 41% in 1999 kontinuierlich auf über 90% in 2004. Die Häufigkeit von MRSA sowohl mit mehreren Resistenzgenen als auch die mit mehreren Toxingenen nahm im Laufe der Zeit zu und korrelierte mit dem Vorkommen von Plasmiden. Bezüglich seiner Korrelation mit den vorkommenden Plasmiden zeigte SCCmecIV im Erhebungszeitraum besonders deutlich eine Veränderung. So nahm über den Zeitraum der Beobachtung die Anzahl der Stämme die zusätzlich zu einem großen Plasmid ein weiteres kleines Plasmid besaßen signifikant zu. Auch beim Vergleich der SCCmec-Typen der MRSA-Isolate konnten Unterschiede bzgl. aller weiteren untersuchten Eigenschaften dargestellt werden. So zeigten z.B. alle SCCmecIIIA das sea-Gen, während dies bei allen anderen in der vorliegenden Arbeit untersuchten SCCmec-Typen nur vereinzelt vorkam. SCCmecII-Stämme wiesen sowohl die meisten Antibiotikaresistenz- als auch Toxingene auf. Es wurde ferner gezeigt, dass Stämme mit vielen Resistenzgenen auch eine hohe Anzahl Toxingene besaßen und dies im Zusammenhang mit einem erhöhten Plasmidgehalt stehen könnte. Aus den MRSA-Kollektiven isolierte Plasmide konnten aufgrund von Restriktionsanalysen als verwandt zu β-Laktamase-Plasmiden des Grundtyps pI524 und pI258 beschrieben werden. Der in vorliegender Arbeit gezeigte Zusammenhang zwischen der Anzahl von direct repeat units (dru) in der Hypervariablen Region (HVR) und dem SCCmec-Typ half den Unterschied zwischen SCCmecIV und SCCmecIVA, sowie die Sonderstellung des in vorliegender Arbeit erstmalig beschriebenen SCCmecIA/II darzustellen. Nicht alle Isolate konnten einem bekannten SCCmec-Typ zugeordnet werden, es handelt sich bei diesen Ausnahmen um weitere noch unbekannte und hier erstmalig beschriebene SCCmec-Typen. Aufgrund der vorliegenden Arbeit konnte ein neuer SCCmec-Typ definiert werden, namentlich der Typ SCCmecIA/II, der seit 1999 in der Region gehäuft vorkommt Die vorliegenden Untersuchungen zeigten somit, dass die Epidemiologie von MRSA der Region Nordhessen trotz bestehender Gemeinsamkeiten zur MRSA-Situation in ganz Deutschland auch Besonderheiten aufweist. Diese nun zu kennen kann einen Beitrag zur gezielten Verbesserung bisheriger Maßnahmen zur Ausbreitungskontrolle von MRSA in der nordhessischen Region leisten.

Nuclear organisation and epigenetic regulation of gene expression in Dictyostelium discoideum

A series of vectors for the over-expression of tagged proteins in Dictyostelium were designed, constructed and tested. These vectors allow the addition of an N- or C-terminal tag (GFP, RFP, 3xFLAG, 3xHA, 6xMYC and TAP) with an optimized polylinker sequence and no additional amino acid residues at the N or C terminus. Different selectable markers (Blasticidin and gentamicin) are available as well as an extra chromosomal version; these allow copy number and thus expression level to be controlled, as well as allowing for more options with regard to complementation, co- and super-transformation. Finally, the vectors share standardized cloning sites, allowing a gene of interest to be easily transfered between the different versions of the vectors as experimental requirements evolve. The organisation and dynamics of the Dictyostelium nucleus during the cell cycle was investigated. The centromeric histone H3 (CenH3) variant serves to target the kinetochore to the centromeres and thus ensures correct chromosome segregation during mitosis and meiosis. A number of Dictyostelium histone H3-domain containing proteins as GFP-tagged fusions were expressed and it was found that one of them functions as CenH3 in this species. Like CenH3 from some other species, Dictyostelium CenH3 has an extended N-terminal domain with no similarity to any other known proteins. The targeting domain, comprising α-helix 2 and loop 1 of the histone fold is required for targeting CenH3 to centromeres. Compared to the targeting domain of other known and putative CenH3 species, Dictyostelium CenH3 has a shorter loop 1 region. The localisation of a variety of histone modifications and histone modifying enzymes was examined. Using fluorescence in situ hybridisation (FISH) and CenH3 chromatin-immunoprecipitation (ChIP) it was shown that the six telocentric centromeres contain all of the DIRS-1 and most of the DDT-A and skipper transposons. During interphase the centromeres remain attached to the centrosome resulting in a single CenH3 cluster which also contains the putative histone H3K9 methyltransferase SuvA, H3K9me3 and HP1 (heterochromatin protein 1). Except for the centromere cluster and a number of small foci at the nuclear periphery opposite the centromeres, the rest of the nucleus is largely devoid of transposons and heterochromatin associated histone modifications. At least some of the small foci correspond to the distal telomeres, suggesting that the chromosomes are organised in a Rabl-like manner. It was found that in contrast to metazoans, loading of CenH3 onto Dictyostelium centromeres occurs in late G2 phase. Transformation of Dictyostelium with vectors carrying the G418 resistance cassette typically results in the vector integrating into the genome in one or a few tandem arrays of approximately a hundred copies. In contrast, plasmids containing a Blasticidin resistance cassette integrate as single or a few copies. The behaviour of transgenes in the nucleus was examined by FISH, and it was found that low copy transgenes show apparently random distribution within the nucleus, while transgenes with more than approximately 10 copies cluster at or immediately adjacent to the centromeres in interphase cells regardless of the actual integration site along the chromosome. During mitosis the transgenes show centromere-like behaviour, and ChIP experiments show that transgenes contain the heterochromatin marker H3K9me2 and the centromeric histone variant H3v1. This clustering, and centromere-like behaviour was not observed on extrachromosomal transgenes, nor on a line where the transgene had integrated into the extrachromosomal rDNA palindrome. This suggests that it is the repetitive nature of the transgenes that causes the centromere-like behaviour. A Dictyostelium homolog of DET1, a protein largely restricted to multicellular eukaryotes where it has a role in developmental regulation was identified. As in other species Dictyostelium DET1 is nuclear localised. In ChIP experiments DET1 was found to bind the promoters of a number of developmentally regulated loci. In contrast to other species where it is an essential protein, loss of DET1 is not lethal in Dictyostelium, although viability is greatly reduced. Loss of DET1 results in delayed and abnormal development with enlarged aggregation territories. Mutant slugs displayed apparent cell type patterning with a bias towards pre-stalk cell types.

A simple retroelement based knock-down system in Dictyostelium

Characteristics of DIRS-1 Mediated Knock-Downs __ We have previously shown that the most abundant Dictyostelium discoideum retroelement DIRS-1 is suppressed by RNAi mechanisms. Here we provide evidence that both inverted terminal repeats have strong promoter activity and that bidirectional expression apparently generates a substrate for Dicer. A cassette containing the inverted terminal repeats and a fragment of a gene of interest was sufficient to activate the RNAi response, resulting in the generation of ~21 nt siRNAs, a reduction of mRNA and protein expression of the respective endogene. Surprisingly, no transitivity was observed on the endogene. This was in contrast to previous observations, where endogenous siRNAs caused spreading on an artificial transgene. Knock-down was successful on seven target genes that we examined. In three cases a phenotypic analysis proved the efficiency of the approach. One of the target genes was apparently essential because no knock-out could be obtained; the RNAi mediated knock-down, however, resulted in a very slow growing culture indicating a still viable reduction of gene expression.

Das Spiel von Grundschulkindern in der großen Pause

Wer schon einmal für kurze Zeit spielenden Kindern zugeschaut hat, mag es als faszinierend empfunden haben, dass das gemeinsame Spiel manchmal „wie von selbst“ abzulaufen scheint. Durch eine intensive Auseinandersetzung mit dessen Theorie und gezielten Beobachtungen ist allerdings festzustellen, dass Spiel eigentlich gar kein „Kinderspiel“, sondern vielmehr eine komplexe Tätigkeit ist. Jedes Spiel weist eine in sich abgeschlossene eigene Wirklichkeit auf, welche sich von der äußeren allgemeingültigen Wirklichkeit abhebt (vgl. Bateson 2007, S. 198f; Oerter 1997, S. 117). Ein Spielrahmen ist vorhanden, der die Situation als Spiel definiert und dessen Grenzen festlegt (vgl. Goffman 1973, S. 74). Im gemeinsamen Spiel ist es deshalb notwendig, dass sich die Teilnehmer das situative Vorhandensein des spezifischen Rahmens und dessen Inhalt mit bestimmten Signalen anzeigen und ihre Auffassungen aufeinander abstimmen (vgl. Oerter 1997, S. 117). Die dafür verwendeten Mitteilungen sind metakommunikativ, d. h. sie geben Auskunft darüber, wie die Kommunikation selbst im Folgenden zu verstehen ist, nämlich immer vor dem Hintergrund, dass „nur gespielt wird“. Erst dadurch können die Mitspieler das Verhalten der anderen als gespielt oder echt einordnen, sodass Missverständnisse vermieden werden (vgl. Bateson 2007, S. 193ff, 206; Oerter 1997, S. 117). Es ist erstaunlich, wie dies Kindern teilweise nur mit wenigen Worten, Gesten oder Handlungen gelingt. Der obige Ausschnitt aus einem Beobachtungsprotokoll zum Spiel von zwei Grundschülern in der großen Pause zeigt, dass nicht nur für Außenstehende, sondern mitunter auch für die Kinder selbst, nicht immer eindeutig oder bewusst ist, wie dieser Vorgang vonstattengeht. Justus und Raphael stimmen zwar darin überein, dass sie gemeinsam ein Spiel gespielt haben, können dieses aber weder benennen, noch beschreiben. Trotzdem scheinen sie beide die gleiche Vorstellung vom Spielablauf und dessen Inhalt gehabt bzw. das Spiel gleichermaßen gerahmt zu haben und zu einer Übereinkunft diesbezüglich gekommen zu sein. Ebenso wie die große Pause zur Schule gehört, gehört zur großen Pause wiederum - zumindest in der Grundschule - das Spiel. Damit ist das Pausenspiel i. d. R. ein fester Bestandteil des Schulalltags eines Grundschülers. Wie bereits angedeutet, leisten die Kinder sogar dabei etwas, nämlich die gemeinsame Bildung und Erhaltung eines gemeinsamen Spielrahmens durch Interaktion. In dieser Arbeit wird deshalb der folgenden Frage nachgegangen: Wie stellen Grundschulkinder in der großen Pause einen gemeinsamen Spielrahmen her und wie erhalten sie diesen aufrecht? Die Beschäftigung mit dieser Frage ist insbesondere für (zukünftige) Lehrpersonen lohnenswert, denn sie kann den Blick auf das Pausenspiel ggf. insofern verändern, dass es mehr wertgeschätzt wird. Ziel dieser Arbeit ist es, Aussagen zu der den Spielrahmen betreffenden Praxis von Grundschulkindern in der großen Pause herauszubilden. Dazu werden zunächst das Spiel und dessen Rahmen theoretisch abgehandelt. Vor diesem Hintergrund soll die Frage weiterführend mit Hilfe von Szenen zur praktischen Umsetzung gemeinsamer Spiele, die im Rahmen einer empirischen Untersuchung im Feld tatsächlich beobachtet und dokumentiert wurden, beantwortet werden. Es wird also nicht das Ziel verfolgt, eine eigenständige Theorie aus den Daten abzuleiten, vielmehr soll die bestehende Theorie mit realen, authentischen Beispielen aus dem Pausenalltag von Grundschülern unterlegt und ergänzt werden.

Untersuchungen zu Qualität und Verträglichkeit ökologischer Milch

In der Literatur findet sich eine kontroverse Debatte um eine Differenzierbarkeit ökologischer und konventioneller Produktqualität von Lebensmitteln. Zugleich greifen zahlreiche subjektiv überzeugte Verbraucher zunehmend zu ökologischen Lebensmitteln. Als eines der Kaufmotive wird in vielen Umfragen die Annahme eines höheren Gesundheitswertes und allgemein einer höheren Qualität ökologischer Produkte genannt. Bisher besteht hinsichtlich der Definitionen, Methoden sowie der Einordnung ökologischer Produktqualität keine Einigkeit. Hinsichtlich von Milch zeigen erste Untersuchungen Unterschiede in der inhaltsstofflichen Zusammensetzung. Differenzierungsmarkern aus der Gruppe der Fettsäuren u.a. n-3, CLA sowie spezifischen TFA werden ernährungsphysiologische Wirksamkeit zugesprochen. Wie aber wirkt sich die Produktion in unterschiedlichen Intensitäten sowohl in der konventionellen als auch in der ökologischen Milchviehhaltung auf die Produktqualität aus? Und lässt sich ökologische bzw. biologisch-dynamische von konventioneller Milch differenzieren? Die Arbeit geht der Qualität ökologischer, speziell biologisch-dynamischer Milch nach und prüft in einem ersten Schritt die Verträglichkeit biologisch-dynamischer Vorzugsmilch bei Kindern mit Nahrungsmittelunverträglichkeiten auf Milch. Dabei gliedert sich die Arbeit in drei aufeinander aufbauende Teilbereiche. Das Kapitel 2 „Ökologische Lebensmittel und Produktqualität“ enthält eine Literaturauswertung zur Verwendung des Begriffes „Struktur“ in der Diskussion um die Beurteilung ökologischer Lebensmittel. Die Beschäftigung mit der Begriffsbildung im Zusammenhang mit der Bestimmung ökologischer Produktqualität und den zugrundeliegenden Konzepten sowie der gegenwärtige Entwicklungsstand werden in den folgenden beiden Kapiteln fortgeführt und vertieft. Zudem wird anhand der Arbeitsergebnisse aus Workshops der internationalen Assoziation wissenschaftlicher Institute „Organic Food Quality and Health“ (FQH) und den in diesem Zusammenhang geführten Arbeits- und Abstimmungsprozessen zur weiteren Vorgehensweise bei der Beurteilung ökologischer Lebensmittel dargestellt. Die entwickelten Kriterien dienten zugleich als eine Art Blaupause für die wissenschaftliche Vorgehensweise in diesem Promotionsprojekt und die konkrete Durchführung dieser Studie. In Kapitel 3 „Systemvergleich und Differenzierbarkeit biologisch-dynamischer und konventioneller Milch auf Betriebsebene“ stehen die Ergebnisse und Auswertungen des Systemvergleiches der Milchqualität von konventionellen und ökologischen bzw. biologisch-dynamischen Betrieben in low- bis high-input Orientierung an zentraler Stelle. Der Wissensstand hinsichtlich der Differenzierbarkeit von Milch wird aus der Literatur referiert. Auf Grundlage von u.a. Fettsäuren- und Antioxidantienanalytik wird die Differenzierbarkeit von ökologischer Milch im Sommer wie auch im Winter einer Einordnung und Bewertung unterzogen. Es werden die Möglichkeiten der Differenzier- und Authentifizierbarkeit anhand verschiedener Inhaltsstoffmarker (Fettsäuren, Antioxidantien und Phytansäure) von Milch aus ökologischen und anderen Produktionssystemen dargestellt. Abschließend werden Implikationen für die landwirtschaftliche Praxis in der ökologischen Milchviehhaltung dargestellt. Das Kapitel 4 „Ökologische Milch und Gesundheit“ stellt erste Ergebnisse zur Auswirkung der Produktqualität von Milch auf die Gesundheit des Menschen vor, die in der Zusammenarbeit mit Dr. med. T. Roos entstanden sind. Er führte die Verträglichkeitstestungen im Rahmen unserer Pilotstudie mit Milch unterschiedlicher Herkunft bei Kindern mit Nahrungsmittelallergien durch und konnte eine erstaunlich hohe Toleranz der biologisch-dynamischen Vorzugsmilch im Vergleich zu konventioneller Standardmilch (pasteurisiert, homogenisiert) feststellen. Mit welchen Faktoren in der Produktion und bei der Weiterverarbeitung der Milch dies zu erklären ist, muss in weiteren Untersuchungen zu den qualitativen Zwischenschritten erfolgen. Die Ergebnisse dieser und anderer Studien weisen darauf hin, dass nur gering intensivierte ökologische Milchviehbetriebe, die regelmäßigen Weidegang und möglichst geringe Kraftfutter- und Mais-Fütterung praktizieren, Milch mit einer deutlich differenzierbaren Produktqualität gegenüber durchschnittlicher konventioneller Milch erzeugen. Vor dem Hintergrund wirtschaftlicher Zwänge zu stärkerer Intensivierung geben die vorgelegten Ergebnisse Anlass, die Kriterien der Ausrichtung ökologischer Milchproduktion so zu bestimmen, dass eine „authentische“ ökologische Produktqualität realisiert werden kann. Auch über die ökologische Milchwirtschaft hinaus sind die Ergebnisse dieser Studie von Interesse. Sie hat am Beispiel von Milch in exemplarischer Weise die für eine Qualifikationsbestimmung auch von gesundheitlicher Relevanz erforderliche Kette von Schritten bis hin zum Menschen vollzogen. Die in dieser Studie insbesondere in Bezug auf die Fettsäuren Zusammensetzung gezeigten Qualitätsmerkmale ökologischer und biologisch-dynamischer Milch weisen auf ein auch ernährungsphysiologisch interessantes Alleinstellungsmerkmal der Produktqualität hin, welches die Annahmen gesundheitsbewusster Verbraucher zu bestätigen vermag und dazu verhelfen mag für ökologische Milch und Milchprodukte höhere Preise zu generieren. Im Blick auf die immer wieder neu geführte Diskussion um die Geltung und Konkretisierung der Grundprinzipien des Ökologischen Landbaus kommt dieser Studie besondere Bedeutung zu.