Untersuchungen zur Rolle von Isoformen katalytischer Untereinheiten der PKA

ZUSAMMENFASSUNG: Proteinkinasen übernehmen zentrale Aufgaben in der Signaltransduktion höherer Zellen. Dabei ist die cAMP-abhängige Proteinkinase (PKA) bezüglich ihrer Struktur und Funktion eine der am besten charakterisierten Proteinkinasen. Trotzdem ist wenig über direkte Interaktionspartner der katalytischen Untereinheiten (PKA-C) bekannt. In einem Split-Ubiquitin basiertem Yeast Two Hybrid- (Y2H-)System wurden potenzielle Interaktionspartner der PKA-C identifiziert. Als Bait wurden sowohl die humane Hauptisoform Cα (hCα) als auch die Proteinkinase X (PrKX) eingesetzt. Nach der Bestätigung der Funktionalität der PKA-C-Baitproteine, dem Nachweis der Expression und der Interaktion mit dem bekannten Interaktionspartner PKI wurde ein Y2H-Screen gegen eine Mausembryo-cDNA-Expressionsbibliothek durchgeführt. Von 2*10^6 Klonen wurden 76 Kolonien isoliert, die ein mit PrKX interagierendes Preyprotein exprimierten. Über die Sequenzierung der enthaltenen Prey-Vektoren wurden 25 unterschiedliche, potenzielle Interaktionspartner identifiziert. Für hCα wurden über 2*10^6 S. cerevisiae-Kolonien untersucht, von denen 1.959 positiv waren (1.663 unter erhöhter Stringenz). Über die Sequenzierung von ca. 10% der Klone (168) konnten Sequenzen für 67 verschiedene, potenzielle Interaktionspartner der hCα identifiziert werden. 15 der Preyproteine wurden in beiden Screens identifiziert. Die PKA-C-spezifische Wechselwirkung der insgesamt 77 Preyproteine wurde im Bait Dependency Test gegen largeT, ein Protein ohne Bezug zum PKA-System, untersucht. Aus den PKA-C-spezifischen Bindern wurden die löslichen Preyproteine AMY-1, Bax72-192, Fabp3, Gng11, MiF, Nm23-M1, Nm23-M2, Sssca1 und VASP256-375 für die weitere in vitro-Validierung ausgewählt. Die Interaktion von FLAG-Strep-Strep-hCα (FSS-hCα) mit den über Strep-Tactin aus der rekombinanten Expression in E. coli gereinigten One-STrEP-HA-Proteinen (SSHA-Proteine) wurde über Koimmunpräzipitation für SSHA-Fabp3, -Nm23-M1, -Nm23-M2, -Sssca1 und -VASP256-375 bestätigt. In SPR-Untersuchungen, für die hCα kovalent an die Oberfläche eines CM5-Sensorchips gekoppelt wurde, wurden die ATP/Mg2+-Abhängigkeit der Bindungen sowie differentielle Effekte der ATP-kompetitiven Inhibitoren H89 und HA-1077 untersucht. Freie hCα, die vor der Injektion zu den SSHA-Proteinen gegeben wurde, kompetierte im Gegensatz zu FSS-PrKX die Bindung an die hCα-Oberfläche. Erste kinetische Analysen lieferten Gleichgewichtsdissoziationskonstanten im µM- (SSHA-Fabp3, -Sssca1), nM- (SSHA-Nm23-M1, –M2) bzw. pM- (SSHA-VASP256-375) Bereich. In funktionellen Analysen konnte eine Phosphorylierung von SSHA-Sssca1 und VASP256-375 durch hCα und FSS-PrKX im Autoradiogramm nachgewiesen werden. SSHA-VASP256-375 zeigte zudem eine starke Inhibition von hCα im Mobility Shift-Assay. Dieser inhibitorische Effekt sowie die hohe Affinität konnten jedoch auf eine Kombination aus der Linkersequenz des Vektors und dem N-Terminus von VASP256-375 zurückgeführt werden. Über die Wechselwirkungen der hier identifizierten Interaktionspartner Fabp3, Nm23-M1 und Nm23-M2 mit hCα können in Folgeuntersuchungen neue PKA-Funktionen insbesondere im Herzen sowie während der Zellmigration aufgedeckt werden. Sssca1 stellt dagegen ein neues, näher zu charakterisierendes PKA-Substrat dar.

Translationskontrolle in der Spermatogenese von Drosophila: Charakterisierung eines regulatorischen mRNP-Komplexes

Während der Spermatogenese von Drosophila werden viele mRNAs zwar vor der Meiose transkribiert, dann aber durch Komplexbildung mit Proteinen stillgelegt und erst am Ende der Spermienentwicklung durch Veränderung desselben für die Translation freigegeben. Ein Beispiel hierfür ist die Mst87F mRNA. Während das cis-agierende Sequenzelement in der RNA seit langem bekannt ist, gestaltete sich die Suche nach den trans-agierenden RNA-bindenden Proteinen schwierig. In meiner Diplomarbeit (Stinski, 2007) waren mithilfe von präparativen Shift-Experimenten (Auftrennung von RNP-Komplexen im elektrischen Feld) zwei vielversprechende Kandidaten identifiziert worden, die Proteine Exuperantia (Exu) und Purity of Essence (Poe). Ziel der vorliegenden Dissertation war zum einen die Aufklärung der Funktion dieser Kandidatenproteine und zum anderen die Identifizierung weiterer Kandidaten, die an der Komplexbildung und damit an der Regulation beteiligt sind. Dabei war die Hoffnung, sowohl Proteine zu finden, die die Repression vermitteln, als auch solche, die am Ende die Aktivierung ermöglichen. Durch eine Affinitätsreinigung, in der Mst87F-RNA mit einem ms2-Tag versehen über das MS2-Maltose binding protein an eine Amylose-Matrix gebunden und schließlich die Komplexe mit Maltose wieder eluiert wurden, ließen sich erneut das Exu-Protein und drei neue Kandidaten identifizieren: CG3213, CG12470 und CG1898. Das Protein Exu hat eindeutig eine Funktion bei der Translationskontrolle: seine Abwesenheit führt zum Abbau der kontrollierten mRNAs. Die Inkubation mit exu-defizientem Protein-Extrakt (aus Hoden) unterstützt keine RNP-Komplexbildung und aufgereinigtes Exu-His Fusionsprotein kann auch nicht direkt an die Mst87F mRNA binden. Ein exu-defizienter Proteinextrakt lässt sich aber durch die Zugabe von rekombinantem Exu-His komplettieren und es entsteht wieder ein starker mRNP-Komplex. Dies beweist, dass das Experiment im Prinzip korrekt verläuft und dass Exu für die Komplexbildung entscheidend ist. Darüber hinaus konnten durch eine Co-Immunpräzipitation mit dem Exu-GFP Fusionsprotein sowohl interagierende Proteine als auch in die RNP-Komplexe einbezogene mRNAs nachgewiesen werden. Vielversprechende Kandidatenproteine stammen von den Genen CG3213, dfmr1 und CG12470. Die durch cDNA-Synthese in den Komplexen nachgewiesenen mRNAs sind in aller Regel solche, die der Translationskontrolle unterworfen sind. Damit ist gezeigt, dass Exu Teil eines großen Proteinkomplexes ist oder zumindest mit ihm assoziiert ist, der auf viele translationskontrollierte Transkripte Einfluss nimmt. Die Mst87F mRNA wird zum Zeitpunkt der Translationsaktivierung sekundär polyadenyliert, das heißt ihre Länge wird größer und heterogen. In einer Mutante für das Kandidatengen poe wurde diese sekundäre Polyadenylierung plötzlich nicht mehr beobachtet und die RNA blieb auch bei Translationsaktivierung so groß wie in den frühen Stadien. So ergab sich die Möglichkeit, endlich zu prüfen, ob die sekundäre Polyadenylierung für die Translationsaktivierung von essentieller Bedeutung ist. Eine Serie von Fusionskonstrukten mit funktionstüchtigem TCE verhielten sich alle gleich. Die sekundäre Polyadenylierung fand nicht statt, aber das Transkript des Fusionsgens wurde zum richtigen Zeitpunkt translatiert. Somit ist dieser Prozess zumindest nicht generell für eine Translation zu diesem späten Zeitpunkt in der Spermiogenese notwendig. Ein quantitativer Effekt kann allerdings nicht ausgeschlossen werden. Des Weiteren konnten mit antisense Konstrukten mutante Phänotypen erzeugt werden. Solche Männchen waren ausnahmslos steril, was die Wichtigkeit des Proteins Poe für den Prozess der Spermienreifung belegt. Die Defekte zeigen sich spät während der Individualisierung, was mit der vermuteten Funktion übereinstimmen würde. Das Kandidatenprotein dFMR1 bindet allein an die Mst87F RNA und trägt zur Stärke des beobachtbaren Komplexes bei. Die Komplexbildung zeigt Salzabhängigkeit, wie sie für dFMR1 in anderen Zusammenhängen dokumentiert wurde. Dies unterstützt die obige Aussage und suggeriert, dass dFMR1 die Basis für den Komplexaufbau bildet. Das CPEB-homologe Kandidatenprotein Orb2 bindet ebenfalls allein an die Mst87F mRNA, hat aber keinen Einfluss auf die Repression oder die sekundäre Polyadenylierung. Eine Beteiligung an der Regulation wäre demnach eindeutig unterschiedlich zu der in anderen Fällen dokumentierten Rolle. Die Expression der Kandidatengene CG1898, CG3213 und CG12470 ist konform mit einer unterschiedlichen Beteiligung an der Translationskontrolle. Das erste Protein ist nur in prämeiotischen Stadien, das zweite durchgängig und das dritte nur in postmeiotischen Stadien nachzuweisen, was einer Funktion bei der Stillegung, während der gesamten inaktiven Phase bzw. bei der Aktivierung entsprechen könnte. Die verschiedenen Experimente identifizieren in mehreren Fällen die gleichen Kandidatenproteine und untermauern damit deren Bedeutung. Sie lassen vielfach konkrete Schlüsse auf die Art der Interaktionen zu, welche in einem Schema zusammengefasst werden.

Begleitpersonen in der stationären Kinderrehabilitation: Bedarf für psychologische Interventionen und Evaluation eines Betreuungsmodells (am Beispiel "Triple-P-Programm")

Begleitpersonen in der stationären Kinderrehabilitation: Bedarf für psychologische Interventionen und Evaluation eines Betreuungsmodells (am Beispiel „Triple-P-Programm”) Chronisch erkrankte Kinder im Vorschulalter, die eine stationäre Reha-Maßnahme absolvieren, werden üblicherweise von einer Bezugsperson (Elternteil oder nahe Verwandte) begleitet. Da diese sog. Begleitpersonen normalerweise nicht krank sind, sind psychologische Interventionen nicht vorgesehen. Dennoch hebt der VDR in seinem Rahmenkonzept hervor, dass Eltern sowohl über die Behandlung der Erkrankung ihres Kindes als auch über konsequente Erziehung informiert werden sollten. Diese Studie untersucht, ob psychologische Interventionen für Begleitpersonen sinnvoll und effektiv sind. Sie wurde in der Fachklinik Satteldüne der DRV Nord durchgeführt. Die Kinder, die in dieser Einrichtung behandelt werden, leiden an chronischen Erkrankungen wie Asthma, atopischer Dermatitis, Allergien und Infektanfälligkeit. 134 Begleitpersonen (127 Mütter und 7 Väter) nahmen an einer quasiexperimentellen Feldstudie teil. Zu Beginn der Reha-Maßnahme (t1) füllten sie Fragebögen zu ihrer psychischen Belastung und ihrem Erziehungsverhalten sowie zu Problemverhalten ihrer Kinder aus. Vier Wochen später zum Ende der Reha-Maßnahme (t2) beurteilten die Begleitpersonen und das Reha-Team den Reha-Erfolg der Kinder. Zu t1 zeigte diese Stichprobe ein überdurchschnittliches Ausmaß an psychischer Belastung, welches bei einem Drittel der Befragten ein klinisch relevantes Ausmaß erreichte. Die psychische Belastung zu t1 korrelierte negativ mit dem Reha-Erfolg der Kinder zum Ende der Behandlung (in der Einschätzung durch Begleitpersonen und Stationsärzte). Dysfunktionales Erziehungsverhalten zeigten 20 % der Begleitpersonen. Dieses korrelierte negativ mit dem Reha-Erfolg der Kinder (in der Einschätzung durch das Pflegepersonal). Es wurden positive Korrelationen zwischen dysfunktionalem Erziehungsverhalten sowie psychischer Belastung der Begleitpersonen und Verhaltensauffälligkeiten der Kinder gefunden. Das Ausmaß der Verhaltensauffälligkeiten lag bei Kleinkindern (bis drei Jahre, n=29) im durchschnittlichen – und bei Vorschulkindern (4-7 Jahre, n=94) im überdurchschnittlichen Bereich. Es zeigte sich ein starkes Interesse der Befragten, während der Reha-Maßnahme an psychologischen Interventionen teilzunehmen. Für das Entspannungstraining interessierte sich jede zweite Begleitperson und ein Drittel der Befragten hatte Interesse die Erziehungsberatung wahrzunehmen. Dennoch nahm nur ein geringer Anteil der anfänglich Interessierten tatsächlich an diesen Interventionen teil (Entspannungstraining: 23 %, Erziehungsberatung: 16 %, psychologische Einzelgespräche: 11,4 %). Es fanden sich signifikante positive Korrelationen zwischen der Zufriedenheit der Begleitpersonen mit der Reha-Maßnahme und a) dem Ausmaß der Erfüllung der Erwartungen der Begleitperson an die Reha-Maßnahme und b) dem Reha-Erfolg des Kindes (eingeschätzt durch die Begleitperson). Zudem zeigten Begleitpersonen, deren psychische Belastung während der Reha-Maßnahme anstieg, eine geringere Zufriedenheit mit der Reha-Maßnahme als diejenigen, deren psychische Belastung sich verringerte. Darüber hinaus wurden die Effekte von verschiedenen psychologischen Betreuungsmodellen für Begleitpersonen untersucht. In einer quasiexperimentellen Studie wurden 64 Begleitpersonen (63 Mütter, 1 Vater) auf zwei Gruppen aufgeteilt. Beide Gruppen konnten auf freiwilliger Basis am Psychologischen Standardprogramm für Begleitpersonen teilnehmen (Erziehungsberatung, psychologische Einzelgespräche, Entspannungstraining). Die 32 Begleitpersonen der EG nahmen zusätzlich an einer Triple-P-Gruppenintervention teil. Zu Beginn (t1) und zum Ende der vierwöchigen Behandlung (t2) sowie sechs Monate nach der Reha-Maßnahme (t3) wurden die Merkmale psychische Belastung und Erziehungsverhalten der Begleitpersonen sowie Problemverhalten der Kinder erhoben. An der Intervention Triple-P nahmen 64 % der Begleitpersonen teil; am Psychologischen Standardprogramm nur 22,7 %. Die Ergebnisse zu t2 zeigen positive Effekte der Behandlung: beide Gruppen verbesserten ihr Erziehungsverhalten, die psychische Belastung der Begleitpersonen und Verhaltensauffälligkeiten der Kinder verringerten sich. Die Verbesserung des Erziehungsverhaltens fiel zu t2 bei der EG signifikant stärker aus als bei der KG. Die Effekte auf das Erziehungsverhalten der Eltern und auf Verhaltensauffälligkeiten der Kinder hielten ein halbes Jahr an, da sie zu t3 erneut vorgefunden wurden. Ein nachhaltiger Effekt auf die psychische Belastung der Begleitpersonen lag nicht vor. Zu t3 wurden keine signifikanten Unterschiede zwischen EG und KG gefunden. Zusammenfassend betrachtet zeigt diese Studie, dass der Bedarf für psychologische Interventionen für Begleitpersonen in der stationären Kinderrehabilitation gerechtfertigt ist und eine Reduktion von psychischer Belastung und dysfunktionalem Erziehungsverhalten der Begleitperson den Reha-Erfolg des Kindes erhöhen kann. In Zukunft sind weitere Anstrengungen nötig, um die psychische Belastung von Begleitpersonen zu verringern, z.B. über eine stärkere Verpflichtung zur Teilnahme an den psychologischen Interventionen, eine bessere Verzahnung von ambulanten und stationären Interventionen und die kontinuierliche Evaluation von neuen psychologischen Interventionen.

Der Momentum-Effekt und Momentum-Handelsstrategien

Diese Arbeit weist Momentum-Renditen für europäische Aktien im Zeitraum von 1991 bis 2010 nach, die – je nach Top/Flop-Prozentsatz – vor Kosten zwischen 6 und 19% p.a. liegen. Gleichzeitig liegen mit hohen Standardabweichungen, negativen Schiefe-Werten und hohen Drawdowns drei wesentliche Risikofaktoren vor. Für die Kernuntersuchungen des Top/Flop-Wertes von 5% treten die höchsten Momentum-Renditen von mehr als 10% p.a. für Ranking-Perioden von 80 bis 100 und Holding-Perioden von 60 bis 90 Handelstagen auf. Grundsätzlich sind die extremsten Aktien der Ranking-Periode entscheidend für die Ausprägung des Momentum-Effekts. Gleichzeitig steigen mit zunehmender Eingrenzung des Top/Flop-Wertes die Risiken, was eine Erklärung hoher Momentum-Renditen aus Sicht der Risikoaversions-Theorie nahelegt. Auch die Berücksichtigung zusätzlicher Filterbedingungen (Gleitende Durchschnitte, Handelsvolumen, Low Volatility) ermöglicht leicht höhere Momentum-Renditen bei entsprechend höheren Risiken. Zwischen dem Momentum-Effekt und dem Auftreten von Kurslücken besteht dagegen kein klarer Zusammenhang. Für die praktische Anwendung sind Momentum-Strategien mit dynamischer Positionsverwaltung während der Haltedauer interessant. Untersucht wurden Strategien anhand der eigens programmierten Simulationsverfahren Stopout und Castout sowie eines kombinierten Verfahrens. Im Ergebnis sind – je nach Präferenz des Investors – das Castout- und das kombinierte Verfahren optimal. Für das Rebalancing der Portfolios empfiehlt es sich, zu den entsprechenden Terminen jeweils nur die Short-Seite auf den Startwert zurückzusetzen. Weiterhin zeigen die Untersuchungen, dass deutliche Long-Übergewichtungen bei Momentum-Strategien grundsätzlich von Vorteil sind. Potenzielle Verbesserungen der Ergebnisse können durch weitere Stopp-Abstände, eine Verringerung des Top/Flop-Wertes oder eine längere Ranking-Periode erzielt werden. Weiterhin sind für die Praxis Long-only-Strategien auf Basis von Doppelranking-Verfahren attraktiv, bei denen das Zweitranking nach Standardabweichung oder Rendite/Standardabweichungs-Ratio erfolgt.