Nuclear organisation and epigenetic regulation of gene expression in Dictyostelium discoideum

A series of vectors for the over-expression of tagged proteins in Dictyostelium were designed, constructed and tested. These vectors allow the addition of an N- or C-terminal tag (GFP, RFP, 3xFLAG, 3xHA, 6xMYC and TAP) with an optimized polylinker sequence and no additional amino acid residues at the N or C terminus. Different selectable markers (Blasticidin and gentamicin) are available as well as an extra chromosomal version; these allow copy number and thus expression level to be controlled, as well as allowing for more options with regard to complementation, co- and super-transformation. Finally, the vectors share standardized cloning sites, allowing a gene of interest to be easily transfered between the different versions of the vectors as experimental requirements evolve. The organisation and dynamics of the Dictyostelium nucleus during the cell cycle was investigated. The centromeric histone H3 (CenH3) variant serves to target the kinetochore to the centromeres and thus ensures correct chromosome segregation during mitosis and meiosis. A number of Dictyostelium histone H3-domain containing proteins as GFP-tagged fusions were expressed and it was found that one of them functions as CenH3 in this species. Like CenH3 from some other species, Dictyostelium CenH3 has an extended N-terminal domain with no similarity to any other known proteins. The targeting domain, comprising α-helix 2 and loop 1 of the histone fold is required for targeting CenH3 to centromeres. Compared to the targeting domain of other known and putative CenH3 species, Dictyostelium CenH3 has a shorter loop 1 region. The localisation of a variety of histone modifications and histone modifying enzymes was examined. Using fluorescence in situ hybridisation (FISH) and CenH3 chromatin-immunoprecipitation (ChIP) it was shown that the six telocentric centromeres contain all of the DIRS-1 and most of the DDT-A and skipper transposons. During interphase the centromeres remain attached to the centrosome resulting in a single CenH3 cluster which also contains the putative histone H3K9 methyltransferase SuvA, H3K9me3 and HP1 (heterochromatin protein 1). Except for the centromere cluster and a number of small foci at the nuclear periphery opposite the centromeres, the rest of the nucleus is largely devoid of transposons and heterochromatin associated histone modifications. At least some of the small foci correspond to the distal telomeres, suggesting that the chromosomes are organised in a Rabl-like manner. It was found that in contrast to metazoans, loading of CenH3 onto Dictyostelium centromeres occurs in late G2 phase. Transformation of Dictyostelium with vectors carrying the G418 resistance cassette typically results in the vector integrating into the genome in one or a few tandem arrays of approximately a hundred copies. In contrast, plasmids containing a Blasticidin resistance cassette integrate as single or a few copies. The behaviour of transgenes in the nucleus was examined by FISH, and it was found that low copy transgenes show apparently random distribution within the nucleus, while transgenes with more than approximately 10 copies cluster at or immediately adjacent to the centromeres in interphase cells regardless of the actual integration site along the chromosome. During mitosis the transgenes show centromere-like behaviour, and ChIP experiments show that transgenes contain the heterochromatin marker H3K9me2 and the centromeric histone variant H3v1. This clustering, and centromere-like behaviour was not observed on extrachromosomal transgenes, nor on a line where the transgene had integrated into the extrachromosomal rDNA palindrome. This suggests that it is the repetitive nature of the transgenes that causes the centromere-like behaviour. A Dictyostelium homolog of DET1, a protein largely restricted to multicellular eukaryotes where it has a role in developmental regulation was identified. As in other species Dictyostelium DET1 is nuclear localised. In ChIP experiments DET1 was found to bind the promoters of a number of developmentally regulated loci. In contrast to other species where it is an essential protein, loss of DET1 is not lethal in Dictyostelium, although viability is greatly reduced. Loss of DET1 results in delayed and abnormal development with enlarged aggregation territories. Mutant slugs displayed apparent cell type patterning with a bias towards pre-stalk cell types.

HelF und sein Interaktionspartner Xrn1: zwei Regulatoren der RNA-Interferenz in D. discoideum

Hauptziel dieser Arbeit ist die Identifizierung, Verifizierung und Charakterisierung von Interaktionspartnern von HelF, einem Negativregulator der RNA-Interferenz in Dictyostelium discoideum (Popova et al. 2006). Es ist gelungen, die Interaktion von HelF und der 5‘ 3‘ Exonuklease Xrn1 nachzu-weisen, aber alle anderen Versuchen, bisher unbekannte Protein-Interaktionspartner zu identifizieren, schlugen fehl. Xrn1 ist in den Organismen D. melanogaster (Orban und Izaurralde 2005), C. elegans (Newbury und Woollard 2004) und A. thaliana (Gazzani et al. 2004) bereits als Regulator der RNA-Interferenz bekannt. Mit Aufreinigungen nach der TAP-Methode und mit dem Nanotrap wurde ebenfalls versucht, RNA-Interaktionspartner von HelF zu identifizieren. Es konnten in einigen Aufreinigungen putative, für HelF spezifische RNAs identifiziert werden, doch entweder es handelte sich nachweislich nicht um RNA oder die Reproduktion der Daten schlug trotz mehrfacher Versuche fehl. Bezüglich der zellulären Lokalisation von HelF und Xrn1 konnte gezeigt werden, dass HelF zusätzlich zur bekannten Lokalisation in Foci im Nukleus (Popova et al. 2006) vermutlich auch im Cytoplasma und dort angeordnet in mehreren Granula zu finden ist. Xrn1 ist nahezu ausschließlich im Cytoplasma lokalisiert, wo es in mehreren Foci organisiert ist. Es wird vermutet, dass es sich bei diesen Foci um Processing-Bodies (P-Bodies) handelt und dass möglicherweise Xrn1 und HelF in eben diesen P-Bodies co-lokalisieren. In der Entwicklung vom Einzeller zum mehrzelligen Organismus zeigen die Xrn1KO- und die HelFKO-Mutante jeweils einen eindeutigen Phänotyp, der vom Wildtyp abweicht. Die Phänotypen der beiden Mutanten unterscheiden sich deutlich voneinander. Beim Mischen von HelF-Knockout-Zellen mit grün fluoreszierenden Wildtyp-Zellen zeigt sich, dass beide Stämme innerhalb des sich entwickelnden Organismus an definierten Stellen lokalisieren. Entgegen den Erwartungen befinden sich die Zellen der Mutante in den Stadien „Finger“ und „Slug“ nicht hauptsächlich im vorderen Teil des Organismus, sondern sind auch im hinteren Teil, der später die Sporenmasse bildet, vertreten. Dies lässt vermuten, dass HelF-Knockout-Mutanten in gleichem Maße wie Wildtypzellen als Sporen in die nächste Generation übergehen. Weitere Mix-Experimente, in denen HelFKO-Zellen und Xrn1KO-Zellen mit grün fluoreszierenden Wildtypzellen gemischt wurden, belegen eindeutig, dass beide Knockoutmutanten in Konkurrenz zum Wildtyp bei der Generierung von Sporen und somit beim Übergang in die nächste Generation benachteiligt sind. Dies steht im Gegensatz zu den Ergebnissen der vorher beschriebenen Mix-Experimente, in denen der Organismus als Ganzes betrachtet wurde. Weiterhin konnte herausgefunden werden, dass Xrn1 ebenso wie HelF (Popova et al. 2006) eine Rolle als Negativregulator in der RNA-Interferenz innehat. Fraglich ist aber, ob HelF wie bisher angenommen auch Einfluss auf den Weg der Generierung von miRNAs nimmt, da in HelFKO für keinen der beiden miRNA-Kandidaten eine Hoch- bzw. Runterregulierung der reifen miRNAs im Vergleich zum Wildtyp beobachtet werden kann. Im Xrn1KO hingegen ist die reife miRNA ddi-mir-1176 im Vergleich zum Wildtyp hochreguliert. In Bezug auf die Generierung von siRNAs konnte herausgefunden werden, dass Xrn1 und HelF im Fall der Generierung von Skipper siRNAs regulierend eingreifen, dass aber nicht alle siRNAs von der negativen Regulierung durch HelF und Xrn1betroffen sind, was am Beispiel der DIRS-1-siRNAs belegt werden kann. Das von B. Popova entwickelte Modell (Popova 2005) bezüglich der Rolle von HelF in der RNA-Interferenz wurde basierend auf den neu gewonnenen Daten weiterentwickelt und um Xrn1 ergänzt, um die Funktionen von HelF und Xrn1 als Antagonisten der RNA-Interferenz näher zu beleuchten. Literatur: Gazzani, S., T. Lawrenson, et al. (2004). "A link between mRNA turnover and RNA interference in Arabidopsis." Science 306(5698): 1046-8. Newbury, S. and A. Woollard (2004). "The 5'-3' exoribonuclease xrn-1 is essential for ventral epithelial enclosure during C. elegans embryogenesis." Rna 10(1): 59-65. Orban, T. I. and E. Izaurralde (2005). "Decay of mRNAs targeted by RISC requires XRN1, the Ski complex, and the exosome." Rna 11(4): 459-69. Popova, B. (2005). HelF, a suppressor of RNAi mediated gene silencing in Dictyostelium discoideum. Genetik. Kassel, Universität Kassel. PhD: 200. Popova, B., M. Kuhlmann, et al. (2006). "HelF, a putative RNA helicase acts as a nuclear suppressor of RNAi but not antisense mediated gene silencing." Nucleic Acids Res 34(3): 773-84.

Water loss management strategies for developing countries

Diese Arbeit beschäftigt sich mit nicht in Rechnung stellbaren Wasserverlusten in städtischen Versorgungsnetzen in Entwicklungsländern. Es soll das Wissen über diese Verluste erweitert und aufgezeigt werden, ob diese auf ein ökonomisch vertretbares Maß reduziert werden können. Die vorliegende Doktorarbeit untersucht solche unberechneten Wasserverluste und versucht, neben der Quantifizierung von Leckagen auch Entscheidungswerkzeuge für ein verbessertes Management der Versorgungsnetze in Entwicklungsländern zu erarbeiten. Als Fallstudie dient Harare, die Hauptstadt von Simbabwe. Wasserverluste in Verteilungsnetzen sind unvermeidbar, sollten aber auf ein ökonomisch tragbares Niveau reduziert werden, wenn ein nachhaltiger Betrieb erreicht werden soll. Wasserverluste können sowohl durch illegale und ungenehmigte Anschlüsse oder durch Undichtigkeiten im Verteilnetz, als auch durch mangelhafte Mess- und Berechnungssysteme entstehen. Es sind bereits viele Ansätze zur Verringerung von Verlusten in Wasserverteilsystemen bekannt geworden, entsprechend existieren dazu auch zahlreiche Methoden und Werkzeuge. Diese reichen von computergestützten Verfahren über gesetzliche und politische Vorgaben sowie ökonomische Berechnungen bis hin zu Maßnahmen der Modernisierung der Infrastruktur. Der Erfolg dieser Anstrengungen ist abhängig von der Umsetzbarkeit und dem Umfeld, in dem diese Maßnahmen durchgeführt werden. Die Bewertung der Arbeitsgüte einer jeden Wasserversorgungseinheit basiert auf der Effektivität des jeweiligen Verteilungssystems. Leistungs- und Bewertungszahlen sind die meist genutzten Ansätze, um Wasserverteilsysteme und ihre Effizienz einzustufen. Weltweit haben sich zur Bewertung als Indikatoren die finanzielle und die technische Leistungsfähigkeit durchgesetzt. Die eigene Untersuchung zeigt, dass diese Indikatoren in vielen Wasserversorgungssystemen der Entwicklungsländer nicht zur Einführung von Verlust reduzierenden Managementstrategien geführt haben. Viele durchgeführte Studien über die Einführung von Maßnahmen zur Verlustreduzierung beachten nur das gesamte nicht in Rechnung stellbare Wasser, ohne aber den Anteil der Leckagen an der Gesamthöhe zu bestimmen. Damit ist keine Aussage über die tatsächliche Zuordnung der Verluste möglich. Aus diesem Grund ist ein Bewertungsinstrument notwendig, mit dem die Verluste den verschiedenen Ursachen zugeordnet werden können. Ein solches Rechenwerkzeug ist das South African Night Flow Analysis Model (SANFLOW) der südafrikanischen Wasser-Forschungskommission, das Untersuchungen von Wasserdurchfluss und Anlagendruck in einzelnen Verteilbezirken ermöglicht. In der vorliegenden Arbeit konnte nachgewiesen werden, dass das SANFLOW-Modell gut zur Bestimmung des Leckageanteiles verwendet werden kann. Daraus kann gefolgert werden, dass dieses Modell ein geeignetes und gut anpassbares Analysewerkzeug für Entwicklungsländer ist. Solche computergestützte Berechnungsansätze können zur Bestimmung von Leckagen in Wasserverteilungsnetzen eingesetzt werden. Eine weitere Möglichkeit ist der Einsatz von Künstlichen Neuronalen Netzen (Artificial Neural Network – ANN), die trainiert und dann zur Vorhersage der dynamischen Verhältnisse in Wasserversorgungssystemen genutzt werden können. Diese Werte können mit der Wassernachfrage eines definierten Bezirks verglichen werden. Zur Untersuchung wurde ein Mehrschichtiges Künstliches Neuronales Netz mit Fehlerrückführung zur Modellierung des Wasserflusses in einem überwachten Abschnitt eingesetzt. Zur Bestimmung des Wasserbedarfes wurde ein MATLAB Algorithmus entwickelt. Aus der Differenz der aktuellen und des simulierten Wassernachfrage konnte die Leckagerate des Wasserversorgungssystems ermittelt werden. Es konnte gezeigt werden, dass mit dem angelernten Neuronalen Netzwerk eine Vorhersage des Wasserflusses mit einer Genauigkeit von 99% möglich ist. Daraus lässt sich die Eignung von ANNs als flexibler und wirkungsvoller Ansatz zur Leckagedetektion in der Wasserversorgung ableiten. Die Untersuchung zeigte weiterhin, dass im Versorgungsnetz von Harare 36 % des eingespeisten Wassers verloren geht. Davon wiederum sind 33 % auf Leckagen zurückzuführen. Umgerechnet bedeutet dies einen finanziellen Verlust von monatlich 1 Millionen Dollar, was 20 % der Gesamteinnahmen der Stadt entspricht. Der Stadtverwaltung von Harare wird daher empfohlen, aktiv an der Beseitigung der Leckagen zu arbeiten, da diese hohen Verluste den Versorgungsbetrieb negativ beeinflussen. Abschließend wird in der Arbeit ein integriertes Leckage-Managementsystem vorgeschlagen, das den Wasserversorgern eine Entscheidungshilfe bei zu ergreifenden Maßnahmen zur Instandhaltung des Verteilnetzes geben soll.