Lipid Droplets in Dictyostelium discoideum

Lipid Droplets dienen zur Speicherung von Neutrallipiden wie z. B. Triglyceriden und Sterolestern. Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit wurde die Bildung dieser zellulären Fettspeicher in D. discoideum untersucht. Es konnte herausgefunden werden, dass Lipid Droplets entstehen, wenn die Zellen entweder in einer Suspension von Bakterien oder in Gegenwart von Palmitinsäure kultiviert werden. Die Bildung der Lipidtröpfchen wird dabei von einem schnelleren Zellwachstum, einem Anstieg des Triglyceridgehalts, einer Reduktion der Phagozytoserate und einer Abnahme des Zellvolumens begleitet. Wurde die Lipid Droplet-Bildung durch Kultivierung der Zellen mit Palmitinsäure angeregt, entsteht neben Triglyceriden noch eine weitere Verbindung, bei der es sich entweder um Fettsäureethylester oder Wachsester handelt. Eine weitere Eigenschaft von Zellen, die in Gegenwart der Palmitinsäure inkubiert wurden, ist die Fähigkeit exogene Fettsäuren schneller aufzunehmen, als normal kultivierte Zellen. Aus der vorliegenden Arbeit wurde gefolgert, dass dies durch eine zusätzliche Aufnahme der Fettsäuren über die Plasmamembran hervorgerufen wird. In Zellen, die ohne Fettsäuren inkubiert wurden, findet hingegen der Fettsäureimport über die Endosomen statt. Ein Protein, das nicht direkt am Prozess der Fettsäureaufnahme beteiligt ist, aber importierte Fettsäuren mit CoA aktiviert, ist die LC-FACS1. Aus Versuchen mit der Knockout-Mutante ging hervor, dass die aktivierten Fettsäuren, in Zellen, die zuvor mit Palmitinsäure oder Bakterien inkubiert wurden, in Triglyceride eingebaut werden. Der reduzierte Triglyceridgehalt im Knockout rief eine Erhöhung der Phagozytoserate hervor. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurden die Lipidtröpfchen mit einem Saccharosegradienten aufgereinigt. Mit Hilfe der Massenspektrometrie konnten 281 Proteine in der Lipid Droplet-Fraktion identifiziert werden. Ein Teil dieser Proteine könnte durch die Interaktion der Lipidtröpfchen mit anderen Organellen in die Lipid Droplet-Fraktion gelangt sein und ist ebenso wenig Teil des Lipid Droplet-Proteoms wie die zytoplasmatischen Proteine, die eine Verunreinigung darstellen. Vier der zehn Proteine aus der Lipid Droplet-Fraktion, die in der vorliegenden Arbeit untersucht wurden, konnten nach Kultivierung in palmitinsäurehaltigem Medium tatsächlich auf der Oberfläche der Lipidtröpfchen beobachtet werden. Eines dieser Proteine ist LSD1. Es stellt das einzige PAT-Protein in D. discoideum dar und gehört der Kategorie der CPATs an. Analog zu Perilipin/PLIN1 und Adipophilin/PLIN2 könnte LSD1 eine Schutzfunktion der Lipid Droplets vor zytoplasmatischen Lipasen haben. Neben DdLSD1 konnten auch die Proteine ADH und ALI auf den Lipidtröpfchen lokalisiert werden. Bei beiden handelt es sich um 17beta-Hydroxysteroid-Dehydrogenasen - Proteine, die eine Funktion im Lipid- oder Fettsäuremetabolismus besitzen können. Das Protein SMT katalysiert die C24-Methylierung des Sterolgerüsts in D. discoideum und war nach Inkubation der Zellen mit exogenen Fettsäuren ebenfalls auf den Lipid Droplets zu beobachten.

Characterization of Lipid Droplets and Functional Analysis of Lipid Droplet-Associated Proteins in Dictyostelium discoideum

Lipid droplets (LDs) are the universal storage form of fat as a reservoir of metabolic energy in animals, plants, bacteria and single celled eukaryotes. Dictyostelium LD formation was investigated in response to the addition of different nutrients to the growth medium. LDs were induced by adding exogenous cholesterol, palmitic acid (PA) as well as growth in bacterial suspension, while glucose addition fails to form LDs. Among these nutrients, PA addition is most effective to stimulate LD formation, and depletion of PA from the medium caused LD degradation. The neutral lipids incorporated into the LD-core are composed of triacylglycerol (TAG), steryl esters, and an unknown neutral lipid (UKL) species when the cells were loaded simultaneously with cholesterol and PA. In order to avoid the contamination with other cellular organelles, the LD-purification method was modified. The isolated LD fraction was analysed by mass spectrometry and 100 proteins were identified. Nineteen of these appear to be directly involved in lipid metabolism or function in regulating LD morphology. Together with a previous study, a total of 13 proteins from the LD-proteome were confirmed to localize to LDs after the induction with PA. Among the identified LD-proteins, the localization of Ldp (lipid droplet membrane protein), GPAT3 (glycerol-3-phosphate acyltransferase 3) and AGPAT3 (1-acylglycerol-3-phosphate-acyltransferase 3) were further verified by GFP-tagging at the N-termini or C-termini of the respective proteins. Fluorescence microscopy demonstrated that PA-treatment stimulated the translocation of the three proteins from the ER to LDs. In order to clarify DGAT (diacylglycerol acyltransferase) function in Dictyostelium, the localization of DGAT1, that is not present in LD-proteome, was also investigated. GFP-tagged DGAT1 localized to the ER both, in the presence and absence of PA, which is different from the previously observed localization of GFP-tagged DGAT2, which almost exclusively binds to LDs. The investigation of the cellular neutral lipid level helps to elucidate the mechanism responsible for LD-formation in Dictyostelium cells. Ldp and two short-chain dehydrogenases, ADH (alcohol dehydrogenase) and Ali (ADH-like protein), are not involved in neutral lipid biosynthesis. GPAT, AGPAT and DGAT are three transferases responsible for the three acylation steps of de novo TAG synthesis. Knock-out (KO) of AGPAT3 and DGAT2 did not affect storage-fat formation significantly, whereas cells lacking GPAT3 or DGAT1 decreased TAG and LD accumulation dramatically. Furthermore, DGAT1 is responsible for the accumulation of the unknown lipid UKL. Overexpression of DGAT2 can rescue the reduced TAG content of the DGAT1-KO mutant, but fails to restore UKL content in these cells, indicating that of DGAT1 and DGAT2 have overlapping functions in TAG synthesis, but the role in UKL formation is unique to DGAT1. Both GPAT3 and DGAT1 affect phagocytic activity. Mutation of GPAT3 increases it but a DGAT1-KO decreases phagocytosis. The double knockout of DGAT1 and 2 also impairs the ability to grow on a bacterial lawn, which again can be rescued by overexpression of DGAT2. These and other results are incorporated into a new model, which proposes that up-regulation of phagocytosis serves to replenish precursor molecules of membrane lipid synthesis, whereas phagocytosis is down-regulated when excess fatty acids are used for storage-fat formation.