Biologische Funktionsanalyse und Identifizierung neuer Substrate der Methyltransferase Dnmt2

Obwohl die DNA Methyltransferase 2 (Dnmt2) hoch konserviert ist und zu der am weitesten verbreiteten eukaryotischen MTase-Familie gehört, ist ihre biologische Funktion nach wie vor unklar. Nachdem lange Zeit keine DNA Methylierungsaktivität nachgewiesen werden konnte, wurde vor einigen Jahren über geringe Mengen an 5-Methylcytosin (5mC) in Retroelementen der “Dnmt2-only”-Organismen D. melanogaster, D. discoideum und E. histolytica berichtet (Kunert et al. 2003; Fisher et al. 2004; Kuhlmann et al. 2005; Phalke et al. 2009). Als kurze Zeit später robuste Methylierung der tRNAAsp durch humane Dnmt2 gezeigt wurde (Goll et al. 2006), wurde zunächst eine Dualspezifität des Enzyms vorgeschlagen (Jeltsch et al. 2006). Neuere Daten zum 5mC-Status verschiedener „Dnmt2-only“-Organismen bilden Anlass für kontroverse Diskussionen über Ausmaß und Bedeutung der DNA Methyltransferaseaktivität von Dnmt2 (Schaefer et al. 2010a; Krauss et al. 2011). Die vorliegende Arbeit konzentriert sich auf die Identifizierung neuer RNA Substrate des Dnmt2-Homologs DnmA aus D. discoideum sowie die biologische Bedeutung der tRNA-Methylierung durch Dnmt2. Wie in anderen Organismen beschrieben, fungiert auch DnmA als tRNAAsp(GUC) MTase in vitro und in vivo. Zusätzlich konnte in vitro tRNAGlu(UUC) als neues Substrat der Dnmt2-Homologe aus D. discoideum und dem Menschen identifiziert werden. In einem Kooperationsprojekt wurde außerdem auch tRNAAsp-Methylierungsaktivität für das Dnmt2-Homolog aus S. pombe (Pmt1) nachgewiesen. Crosslink-RNA-Immunopräzipitationen (RNA-CLIP) mit anschließender Next-Generation-Sequenzierung der mit DnmA assoziierten RNAs zeigen, dass DnmA mit tRNA Fragmenten interagiert, die sich vom Anticodonloop bis in den T-loop erstrecken. Neben der tRNAAsp(GUC) und tRNAGlu(UUC/CUC) sind Fragmente der tRNAGly(GCC) verstärkt angereichert. Inwiefern diese Fragmente eine biologische Funktion haben oder spezifische Degradationsprodukte darstellen, ist noch ungeklärt. Interessanterweise sind von einigen tRNAs wenige Sequenzen von antisense-Fragmenten in den RNA-CLIP Daten zu finden, die etwas kürzer, jedoch exakt komplementär zu den genannten sense-Fragmenten sind. Besonders stark sind diese Fragmente der tRNAGlu(UUC) vertreten. In einem weiteren RNA-CLIP Experiment wurden U-snRNAs, snoRNA und intergenische Sequenzen mit DnmA angereichert. Bei nachfolgenden in vitro Methylierungsstudien konnte ausschließlich die U2-snRNA als potentielles Nicht-tRNA-Substrat der hDnmt2 und DnmA identifiziert werden. Da tRNA Modifikationen im Anticodonloop die Codonerkennung beeinflussen können, wurde ein System etabliert um die Translationseffizienz eines GFP-Reportergens in Wildtyp- und dnmAKO-Zellen zu messen. In D. discoideum wird das Aspartat-Codon GAU ca. zehnmal häufiger genutzt als das GAC Codon, allerdings ist nur eine tRNAAsp(GUC) im Genom der Amöbe kodiert. Aus diesem Grund wurde zusätzlich die Frage adressiert, inwiefern die DnmA-abhängige Methylierung dieser tRNA das „Wobbling“ beeinflusst. Dazu wurde dem Reportergen jeweils eine (GAU)5- und (GAC)5-Leadersequenz vorgeschaltet. Entgegen der Annahme wurde der (GAC)5-Leader in beiden Stämmen etwas effizienter translatiert. Insgesamt zeigte der dnmAKO-Stamm eine leicht erhöhte Translationseffizienz der Reportergene. Vergleichende Analysen zur Aufnahme von Fremd-DNA zeigten signifikant reduzierte Transformationseffizienzen mit einem integrierenden Plasmid in dnmAKO-Zellen. Ein weiterer dnmAKO-Stamm zeigte diesen Effekt jedoch nicht, wobei bei derselben Mutante eine deutlich reduzierte Aufnahme eines extrachromosomalen Plasmids zu verzeichnen war. Untersuchungen zum Einfluss von DnmA auf die Regulation des Retroelements skipper ergaben keinen Zusammenhang zwischen der Generierung kleiner RNAs und der erhöhten Transkription des Retrotransposons in dnmAKO-Zellen (Kuhlmann et al. 2005). Durch Kompensationsversuche sowie Experimente mit einer weiteren dnmAKO-Mutante konnte die Mobilisierung des Retrotransposons nicht eindeutig als DnmA-Funktion eingeordnet werden. In einem weiteren Projekt wurden die Bindung des m5C-bindenden Proteins EhMLBP aus E. histolytica an DNA mittels Rasterkraftmikroskopie abgebildet (Lavi et al. 2006). Neben vermutlich unspezifischen Endbindungsereignissen konnte eine bevorzugte Bindungsstelle des Proteins an LINE DNA (long intersperesed nuclear element) identifiziert werden. Möglicherweise fällt diese mit einem von zwei A/T-reichen Bereichen der LINE DNA zusammen, von denen vermutet wird, dass diese für die Bindung von EhMLBP an DNA von Bedeutung sind. Insgesamt bestätigen die Ergebnisse dieser Arbeit die tRNAAsp Methylierungsaktivität als konservierte Dnmt2-Funktion. Darüber hinaus erweitern sie das Substratspektrum der Dnmt2-Methyltransferasen im Bereich der tRNA. Außerdem wird erstmals ein potentielles Nicht-tRNA Substrat vorgeschlagen. Zusätzlich geben neu entdeckte Phänotypen Hinweise auf vielfältige zelluläre Dnmt2-Funktionen.

HelF, a suppressor of RNAi mediated gene silencing in Dictyostelium discoideum

RNA interference (RNAi) is a recently discovered process, in which double stranded RNA (dsRNA) triggers the homology-dependant degradation of cognate messenger RNA (mRNA). In a search for new components of the RNAi machinery in Dictyostelium, a new gene was identified, which was called helF. HelF is a putative RNA helicase, which shows a high homology to the helicase domain of Dicer, to the helicase domain of Dictyostelium RdRP and to the C. elegans gene drh-1, that codes for a dicer related DExH-box RNA helicase, which is required for RNAi. The aim of the present Ph.D. work was to investigate the role of HelF in PTGS, either induced by RNAi or asRNA. A genomic disruption of the helF gene was performed, which resulted in a distinct mutant morphology in late development. The cellular localization of the protein was elucidated by creating a HelF-GFP fusion protein, which was found to be localized in speckles in the nucleus. The involvement of HelF in the RNAi mechanism was studied. For this purpose, RNAi was induced by transformation of RNAi hairpin constructs against four endogenous genes in wild type and HelF- cells. The silencing efficiency was strongly enhanced in the HelF K.O. strain in comparison with the wild type. One gene, which could not be silenced in the wild type background, was successfully silenced in HelF-. When the helF gene was disrupted in a secondary transformation in a non-silenced strain, the silencing efficiency was strongly improved, a phenomenon named here “retrosilencing”. Transcriptional run-on experiments revealed that the enhanced gene silencing in HelF- was a posttranscriptional event, and that the silencing efficiency depended on the transcription levels of hairpin RNAs. In HelF-, the threshold level of hairpin transcription required for efficient silencing was dramatically lowered. The RNAi-mediated silencing was accompanied by the production of siRNAs; however, their amount did not depend on the level of hairpin transcription. These results indicated that HelF is a natural suppressor of RNAi in Dictyostelium. In contrast, asRNA mediated gene silencing was not enhanced in the HelF K.O, as shown for three tested genes. These results confirmed previous observations (H. Martens and W. Nellen, unpublished) that although similar, RNAi and asRNA mediated gene silencing mechanisms differ in their requirements for specific proteins. In order to characterize the function of the HelF protein on a molecular level and to study its interactions with other RNAi components, in vitro experiments were performed. Besides the DEAH-helicase domain, HelF contains a double-stranded RNA binding domain (dsRBD) at its N-terminus, which showed high similarity to the dsRBD domain of Dicer A from Dictyostelium. The ability of the recombinant dsRBDs from HelF and Dicer A to bind dsRNA was examined and compared. It was shown by gel-shift assays that both HelF-dsRBD and Dicer-dsRBD could bind directly to long dsRNAs. However, HelF-dsRBD bound more efficiently to dsRNA with imperfect matches than to perfect dsRNA. Both dsRBDs bound specifically to a pre-miRNA substrate (pre-let-7). The results suggested that most probably there were two binding sites for the proteins on the pre-miRNA substrate. Moreover, it was shown that HelF-dsRBD and Dicer-dsRBD have siRNA-binding activity. The affinities of the two dsRBDs to the pre-let-7 substrate were also examined by plasmon surface resonance analyses, which revealed a 9-fold higher binding affinity of the Dicer-dsRBD to pre-let-7 compared to that of the HelF-dsRBD. The binding of HelF-dsRBD to the pre-let-7 was impaired in the presence of Mg2+, while the Dicer-dsRBD interaction with pre-let-7 was not influenced by the presence of Mg2+. The results obtained in this thesis can be used to postulate a model for HelF function. In this, HelF acts as a nuclear suppressor of RNAi in wild type cells by recognition and binding of dsRNA substrates. The protein might act as a surveillance system to avoid RNAi initiation by fortuitous dsRNA formation or low abundance of dsRNA trigger. If the protein acts as an RNA helicase, it could unwind fold-back structures in the nucleus and thus lead to decreased RNAi efficiency. A knock-out of HelF would result in initiation of the RNAi pathway even by low levels of dsRNA. The exact molecular function of the protein in the RNAi mechanism still has to be elucidated. RNA interferenz (RNAi) ist ein in jüngster Zeit entdeckter Mechanismus, bei dem doppelsträngige RNA Moleküle (dsRNA) eine Homologie-abhängige Degradation einer verwandten messenger-RNA (mRNA) auslösen. Auf der Suche nach neuen Komponenten der RNAi-Maschinerie in Dictyostelium konnte ein neues Gen (helF) identifiziert werden. HelF ist eine putative RNA-Helikase mit einer hohen Homologie zur Helikasedomäne der bekannten Dicerproteine, der Helikasedomäne der Dictyostelium RdRP und zu dem C. elegans Gen drh-1, welches für eine Dicer-bezogene DExH-box RNA Helikase codiert, die am RNAi-Mechanismus beteiligt ist. Das Ziel dieser Arbeit war es, die Funktion von HelF im Zusammenhang des RNAi oder asRNA induzierten PTGS zu untersuchen. Es wurde eine Unterbrechung des helF-Gens auf genomischer Ebene (K.O.) vorgenommen, was bei den Mutanten zu einer veränderten Morphologie in der späten Entwicklung führte. Die Lokalisation des Proteins in der Zelle konnte mit Hilfe einer GFP-Fusion analysiert werden und kleinen Bereichen innerhalb des Nukleus zugewiesen werden. Im Weiteren wurde der Einfluss von HelF auf den RNAi-Mechanismus untersucht. Zu diesem Zweck wurde RNAi durch Einbringen von RNAi Hairpin-Konstrukten gegen vier endogene Gene im Wiltypstamm und der HelF--Mutante induziert. Im Vergleich zum Wildtypstamm konnte im HelF--Mutantenstamm eine stark erhöhte „Silencing“-Effizienz nachgewiesen werden. Ein Gen, welches nach RNAi Initiation im Wildtypstamm unverändert blieb, konnte im HelF--Mutantenstamm erfolgreich stillgelegt werden. Durch sekundäres Einführen einer Gendisruption im helF-Locus in einen Stamm, in welchem ein Gen nicht stillgelegt werden konnte, wurde die Effizienz des Stilllegens deutlich erhöht. Dieses Phänomen wurde hier erstmals als „Retrosilencing“ beschrieben. Mit Hilfe von transkriptionellen run-on Experimenten konnte belegt werden, dass es sich bei dieser erhöhten Stilllegungseffizienz um ein posttranskriptionelles Ereignis handelte, wobei die Stillegungseffizienz von der Transkriptionsstärke der Hairpin RNAs abhängt. Für die HelF--Mutanten konnte gezeigt werden, dass der Schwellenwert zum Auslösen eines effizienten Stillegens dramatisch abgesenkt war. Obwohl die RNAi-vermittelte Genstilllegung immer mit der Produktion von siRNAs einhergeht, war die Menge der siRNAs nicht abhängig von dem Expressionsniveau des Hairpin-Konstruktes. Diese Ergebnisse legen nahe, dass es sich bei der HelF um einen natürlichen Suppressor des RNAi-Mechanismus in Dictyostelium handelt. Im Gegensatz hierzu war die as-vermittelte Stilllegung von drei untersuchten Genen im HelF-K.O. im Vergleich zum Wildyp unverändert. Diese Ergebnisse bestätigten frühere Beobachtungen (H. Martens und W. Nellen, unveröffentlicht), wonach die Mechanismen für RNAi und asRNA-vermittelte Genstilllegung unterschiedliche spezifische Proteine benötigen. Um die Funktion des HelF-Proteins auf der molekularen Ebene genauer zu charakterisieren und die Interaktion mit anderen RNAi-Komponenten zu untersuchen, wurden in vitro Versuche durchgeführt. Das HelF-Protein enthält, neben der DEAH-Helikase-Domäne eine N-terminale Doppelstrang RNA bindende Domäne (dsRBD) mit einer hohen Ähnlichkeit zu der dsRBD des Dicer A aus Dictyostelium. Die dsRNA-Bindungsaktivität der beiden dsRBDs aus HelF und Dicer A wurde analysiert und verglichen. Es konnte mithilfe von Gel-Retardationsanalysen gezeigt werden, dass sowohl HelF-dsRBD als auch Dicer-dsRBD direkt an lange dsRNAs binden können. Hierbei zeigte sich, dass die HelF-dsRBD eine höhere Affinität zu einem imperfekten RNA-Doppelstrang besitzt, als zu einer perfekt gepaarten dsRNA. Für beide dsRBDs konnte eine spezifische Bindung an ein pre-miRNA Substrat nachgewiesen werden (pre-let-7). Dieses Ergebnis legt nah, dass es zwei Bindestellen für die Proteine auf dem pre-miRNA Substrat gibt. Überdies hinaus konnte gezeigt werden, dass die dsRBDs beider Proteine eine siRNA bindende Aktivität besitzen. Die Affinität beider dsRBDs an das pre-let-7 Substrat wurde weiterhin mit Hilfe der Plasmon Oberflächen Resonanz untersucht. Hierbei konnte eine 9-fach höhere Bindeaffinität der Dicer-dsRBD im Vergleich zur HelF-dsRBD nachgewiesen werden. Während die Bindung der HelF-dsRBD an das pre-let-7 durch die Anwesenheit von Mg2+ beeinträchtigt war, zeigte sich kein Einfluß von Mg2+ auf das Bindeverhalten der Dicer-dsRBD. Mit Hilfe der in dieser Arbeit gewonnen Ergebnisse lässt sich ein Model für die Funktion von HelF postulieren. In diesem Model wirkt HelF durch Erkennen und Binden von dsRNA Substraten als Suppressor von der RNAi im Kern. Das Protein kann als Überwachungsystem gegen eine irrtümliche Auslösung von RNAi wirken, die durch zufällige dsRNA Faltungen oder eine zu geringe Häufigkeit der siRNAs hervorgerufen sein könnte. Falls das Protein eine Helikase-Aktivität besitzt, könnte es rückgefaltete RNA Strukturen im Kern auflösen, was sich in einer verringerten RNAi-Effizienz wiederspiegelt. Durch Ausschalten des helF-Gens würde nach diesem Modell eine erfolgreiche Auslösung von RNAi schon bei sehr geringer Mengen an dsRNA möglich werden. Das Modell erlaubt, die exakte molekulare Funktion des HelF-Proteins im RNAi-Mechanismus weiter zu untersuchen.

Wechselwirkung von im NANOJET erzeugten Teilchen mit Polymeren und biologischen Objekten

Am Institut für Mikrostrukturtechnologie und Analytik wurde eine neue Technik entwickelt, die neue Anwendungen und Methoden der Mikro- und Nanostrukturierung auf Basis eines neuen Verfahrens erschlossen hat. NANOJET führt über die passive Rastersondenmikroskopie hinaus zu einem vielseitigen, aktiven Bearbeitungswerkzeug auf der Mikro- und Nanometerskala. NANOJET (NANOstructuring Downstream PlasmaJET) ist eine aktive Rasterkraft-Mikroskopie-Sonde. Radikale (chemisch aktive Teilchen, die ein ungepaartes Valenzelektron besitzen) strömen aus dem Ende einer ultradünnen, hohlen Rasterkraftmikroskop-Spitze. Dadurch wird es möglich, über die übliche passive Abtastung einer Probenoberfläche hinausgehend, diese simultan und in-situ durch chemische Reaktionen zu verändern. Die Abtragung von Material wird durch eine chemische Ätzreaktion erreicht. In dieser Arbeit wurde zum größten Teil Photoresist als Substrat für die Ätzexperimente verwendet. Für das Ätzen des Resists wurden die Atome des Fluors und des Sauerstoffs im Grundzustand als verantwortlich identifiziert. Durch Experimente und durch Ergänzung von Literaturdaten wurde die Annahme bestätigt, dass Sauerstoffradikale mit Unterstützung von Fluorradikalen für die hohen erzielten Ätzraten verantwortlich sind. Die Beimischung von Fluor in einem Sauerstoffplasma führt zu einer Verringerung der Aktivierungsenergie für die Ätzreaktion gegenüber Verwendung reinen Sauerstoffs. In weiterer Folge wurde ein Strukturierungsverfahren dargestellt. Hierbei wurden "geformte Kapillaren" (mikrostrukturierte Aperturen) eingesetzt. Die Herstellung der Aperturen erfolgte durch einen elektrochemischen Ätzstop-Prozess. Die typische Größe der unter Verwendung der "geformten Kapillaren" geätzten Strukturen entsprach den Kapillarenöffnungen. Es wurde ein Monte-Carlo Simulationsprogramm entwickelt, welches den Transport der reaktiven Teilchen in der langen Transportröhre simulierte. Es wurde sowohl die Transmission der Teilchen in der Transportröhre und der Kapillare als auch ihre Winkelverteilung nach dem Verlassen der Kapillare berechnet. Das Aspektverhältnis der Röhren hat dabei einen sehr starken Einfluss. Mit einem steigenden Aspektverhältnis nahm die Transmission exponentiell ab. Die geschaffene experimentelle Infrastruktur wurde genutzt, um auch biologische Objekte zu behandeln und zu untersuchen. Hierfür wurde eine neue Methodik entwickelt, die eine dreidimensionale Darstellung des Zellinneren erlaubt. Dies wurde durch die kontrollierte Abtragung von Material aus der Zellmembran durchgeführt. Die Abtragung der Zellmembran erfolgte mittels Sauerstoffradikalen, die durch eine hohle Spitze lokalisiert zum Ort der Reaktion transportiert wurden. Ein piezoresistiver Cantilever diente als Sensor in dem zur Bildgebung eingesetzten RKM. Das entwickelte Verfahren ermöglicht es nun erstmals, schonend Zellen zu öffnen und die innen liegenden Organellen weiter zu untersuchen. Als Nachweis für weitere Verwendungsmöglichkeiten des NANOJET-Verfahrens wurde auch Knochenmaterial behandelt. Die Ergebnisse dieser Experimente zeigen klar, dass das Verfahren für vielfältige biologische Materialien verwendbar ist und somit nun ein weiter Anwendungskreis in der Biologie und Medizin offen steht.

Characterization of DnmA, the Dnmt2 homolog in Dictyostelium discoideum

Eukaryotic DNA m5C methyltransferases (MTases) play a major role in many epigenetic regulatory processes like genomic imprinting, X-chromosome inactivation, silencing of transposons and gene expression. Members of the two DNA m5C MTase families, Dnmt1 and Dnmt3, are relatively well studied and many details of their biological functions, biochemical properties as well as interaction partners are known. In contrast, the biological functions of the highly conserved Dnmt2 family, which appear to have non-canonical dual substrate specificity, remain enigmatic despite the efforts of many researchers. The genome of the social amoeba Dictyostelium encodes Dnmt2-homolog, the DnmA, as the only DNA m5C MTase which allowed us to study Dnmt2 function in this organism without interference by the other enzymes. The dnmA gene can be easily disrupted but the knock-out clones did not show obvious phenotypes under normal lab conditions, suggesting that the function of DnmA is not vital for the organism. It appears that the dnmA gene has a low expression profile during vegetative growth and is only 5-fold upregulated during development. Fluorescence microscopy indicated that DnmA-GFP fusions were distributed between both the nucleus and cytoplasm with some enrichment in nuclei. Interestingly, the experiments showed specific dynamics of DnmA-GFP distribution during the cell cycle. The proteins colocalized with DNA in the interphase and were mainly removed from nuclei during mitosis. DnmA functions as an active DNA m5C MTase in vivo and is responsible for weak but detectable DNA methylation of several regions in the Dictyostelium genome. Nevertheless, gel retardation assays showed only slightly higher affinity of the enzyme to dsDNA compared to ssDNA and no specificity towards various sequence contexts, although weak but detectable specificity towards AT-rich sequences was observed. This could be due to intrinsic curvature of such sequences. Furthermore, DnmA did not show denaturant-resistant covalent complexes with dsDNA in vitro, although it could form covalent adducts with ssDNA. Low binding and methyltransfer activity in vitro suggest the necessity of additional factor in DnmA function. Nevertheless, no candidates could be identified in affinity purification experiments with different tagged DnmA fusions. In this respect, it should be noted that tagged DnmA fusion preparations from Dictyostelium showed somewhat higher activity in both covalent adduct formation and methylation assays than DnmA expressed in E.coli. Thus, the presence of co-purified factors cannot be excluded. The low efficiency of complex formation by the recombinant enzyme and the failure to define interacting proteins that could be required for DNA methylation in vivo, brought up the assumption that post-translational modifications could influence target recognition and enzymatic activity. Indeed, sites of phosphorylation, methylation and acetylation were identified within the target recognition domain (TRD) of DnmA by mass spectrometry. For phosphorylation, the combination of MS data and bioinformatic analysis revealed that some of the sites could well be targets for specific kinases in vivo. Preliminary 3D modeling of DnmA protein based on homology with hDNMT2 allowed us to show that several identified phosphorylation sites located on the surface of the molecule, where they would be available for kinases. The presence of modifications almost solely within the TRD domain of DnmA could potentially modulate the mode of its interaction with the target nucleic acids. DnmA was able to form denaturant-resistant covalent intermediates with several Dictyostelium tRNAs, using as a target C38 in the anticodon loop. The formation of complexes not always correlated with the data from methylation assays, and seemed to be dependent on both sequence and structure of the tRNA substrate. The pattern, previously suggested by the Helm group for optimal methyltransferase activity of hDNMT2, appeared to contribute significantly in the formation of covalent adducts but was not the only feature of the substrate required for DnmA and hDNMT2 functions. Both enzymes required Mg2+ to form covalent complexes, which indicated that the specific structure of the target tRNA was indispensable. The dynamics of covalent adduct accumulation was different for DnmA and different tRNAs. Interestingly, the profiles of covalent adduct accumulation for different tRNAs were somewhat similar for DnmA and hDNMT2 enzymes. According to the proposed catalytic mechanism for DNA m5C MTases, the observed denaturant-resistant complexes corresponded to covalent enamine intermediates. The apparent discrepancies in the data from covalent complex formation and methylation assays may be interpreted by the possibility of alternative pathways of the catalytic mechanism, leading not to methylation but to exchange or demethylation reactions. The reversibility of enamine intermediate formation should also be considered. Curiously, native gel retardation assays showed no or little difference in binding affinities of DnmA to different RNA substrates and thus the absence of specificity in the initial enzyme binding. The meaning of the tRNA methylation as well as identification of novel RNA substrates in vivo should be the aim of further experiments.

Untersuchungen zur Rolle von Isoformen katalytischer Untereinheiten der PKA

ZUSAMMENFASSUNG: Proteinkinasen übernehmen zentrale Aufgaben in der Signaltransduktion höherer Zellen. Dabei ist die cAMP-abhängige Proteinkinase (PKA) bezüglich ihrer Struktur und Funktion eine der am besten charakterisierten Proteinkinasen. Trotzdem ist wenig über direkte Interaktionspartner der katalytischen Untereinheiten (PKA-C) bekannt. In einem Split-Ubiquitin basiertem Yeast Two Hybrid- (Y2H-)System wurden potenzielle Interaktionspartner der PKA-C identifiziert. Als Bait wurden sowohl die humane Hauptisoform Cα (hCα) als auch die Proteinkinase X (PrKX) eingesetzt. Nach der Bestätigung der Funktionalität der PKA-C-Baitproteine, dem Nachweis der Expression und der Interaktion mit dem bekannten Interaktionspartner PKI wurde ein Y2H-Screen gegen eine Mausembryo-cDNA-Expressionsbibliothek durchgeführt. Von 2*10^6 Klonen wurden 76 Kolonien isoliert, die ein mit PrKX interagierendes Preyprotein exprimierten. Über die Sequenzierung der enthaltenen Prey-Vektoren wurden 25 unterschiedliche, potenzielle Interaktionspartner identifiziert. Für hCα wurden über 2*10^6 S. cerevisiae-Kolonien untersucht, von denen 1.959 positiv waren (1.663 unter erhöhter Stringenz). Über die Sequenzierung von ca. 10% der Klone (168) konnten Sequenzen für 67 verschiedene, potenzielle Interaktionspartner der hCα identifiziert werden. 15 der Preyproteine wurden in beiden Screens identifiziert. Die PKA-C-spezifische Wechselwirkung der insgesamt 77 Preyproteine wurde im Bait Dependency Test gegen largeT, ein Protein ohne Bezug zum PKA-System, untersucht. Aus den PKA-C-spezifischen Bindern wurden die löslichen Preyproteine AMY-1, Bax72-192, Fabp3, Gng11, MiF, Nm23-M1, Nm23-M2, Sssca1 und VASP256-375 für die weitere in vitro-Validierung ausgewählt. Die Interaktion von FLAG-Strep-Strep-hCα (FSS-hCα) mit den über Strep-Tactin aus der rekombinanten Expression in E. coli gereinigten One-STrEP-HA-Proteinen (SSHA-Proteine) wurde über Koimmunpräzipitation für SSHA-Fabp3, -Nm23-M1, -Nm23-M2, -Sssca1 und -VASP256-375 bestätigt. In SPR-Untersuchungen, für die hCα kovalent an die Oberfläche eines CM5-Sensorchips gekoppelt wurde, wurden die ATP/Mg2+-Abhängigkeit der Bindungen sowie differentielle Effekte der ATP-kompetitiven Inhibitoren H89 und HA-1077 untersucht. Freie hCα, die vor der Injektion zu den SSHA-Proteinen gegeben wurde, kompetierte im Gegensatz zu FSS-PrKX die Bindung an die hCα-Oberfläche. Erste kinetische Analysen lieferten Gleichgewichtsdissoziationskonstanten im µM- (SSHA-Fabp3, -Sssca1), nM- (SSHA-Nm23-M1, –M2) bzw. pM- (SSHA-VASP256-375) Bereich. In funktionellen Analysen konnte eine Phosphorylierung von SSHA-Sssca1 und VASP256-375 durch hCα und FSS-PrKX im Autoradiogramm nachgewiesen werden. SSHA-VASP256-375 zeigte zudem eine starke Inhibition von hCα im Mobility Shift-Assay. Dieser inhibitorische Effekt sowie die hohe Affinität konnten jedoch auf eine Kombination aus der Linkersequenz des Vektors und dem N-Terminus von VASP256-375 zurückgeführt werden. Über die Wechselwirkungen der hier identifizierten Interaktionspartner Fabp3, Nm23-M1 und Nm23-M2 mit hCα können in Folgeuntersuchungen neue PKA-Funktionen insbesondere im Herzen sowie während der Zellmigration aufgedeckt werden. Sssca1 stellt dagegen ein neues, näher zu charakterisierendes PKA-Substrat dar.

Substrate Conformal Imprint Lithography als innovatives Verfahren zur Herstellung von Nanospektrometern im sichtbaren Spektralbereich

Selbstbestimmung und -gestaltung des eigenen Alltages gewinnen immer mehr an Bedeutung, insbesondere für ältere Mitmenschen in ländlichen Regionen, die auf ärztliche Versorgung angewiesen sind. Die Schaffung sogenannter smart personal environments mittels einer Vielzahl von, nahezu unsichtbar installierten Sensoren im gewohnten Lebensraum liefert dem Anwender (lebens-) notwendige Informationen über seine Umgebung oder seinen eigenen Körper. Dabei gilt es nicht den Anwender mit technischen Daten, wie Spektren, zu überfordern. Vielmehr sollte die Handhabung so einfach wie möglich gestaltet werden und die ausgewertete Information als Indikationsmittel zum weiteren Handeln dienen. Die Anforderungen an moderne Technologien sind folglich eine starke Miniaturisierung, zur optimalen Integration und Mobilität, bei gleichzeitig hoher Auflösung und Stabilität. Die Zielsetzung der vorliegenden Arbeit ist die Miniaturisierung eines spektroskopischen Systems bei gleichzeitig hohem Auflösungsvermögen für die Detektion im sichtbaren Spektralbereich. Eine Möglichkeit für die Herstellung eines konkurrenzfähigen „Mini-„ oder „Mikrospektrometers“ basiert auf Fabry-Pérot (FP) Filtersystemen, da hierbei die Miniaturisierung nicht wie üblich auf Gittersysteme limitiert ist. Der maßgebliche Faktor für das spektrale Auflösungsvermögen des Spektrometers ist die vertikale Präzision und Homogenität der einzelnen 3D Filterkavitäten, die die unterschiedlichen Transmissionswellenlängen der einzelnen Filter festlegen. Die wirtschaftliche Konkurrenzfähigkeit des am INA entwickelten Nanospektremeters wurde durch die maximale Reduzierung der Prozessschritte, nämlich auf einen einzigen Schritt, erreicht. Erstmalig wird eine neuartige Nanoimprint Technologie, die sog. Substrate Conformal Imprint Lithography, für die Herstellung von wellenlängen-selektierenden Filterkavitäten von stark miniaturisierten Spektrometern eingesetzt. Im Zuge dieser Arbeit wird das Design des FP Filtersystems entwickelt und technologisch mittels Dünnschichtdeposition und der Nanoimprinttechnologie realisiert. Ein besonderer Schwerpunkt liegt hierbei in der Untersuchung des Prägematerials, dessen optische Eigenschaften maßgeblich über die Performance des Filtersystems entscheiden. Mit Hilfe eines speziell gefertigten Mikroskopspektrometers werden die gefertigten Filterfelder hinsichtlich ihrer Transmissionseigenschaften und ihres Auflösungsvermögens hin untersucht. Im Hinblick auf publizierte Arbeiten konkurrierender Arbeitsgruppen konnte eine deutliche Verbesserung des miniaturisierten Spektrometers erreicht werden. Die Minimierung der Prozessschritte auf einen einzigen Prägeschritt sorgt gleichzeitig für eine schnelle und zuverlässige Replikation der wellenlängenselektierenden Filterkavitäten. Im Rahmen dieser Arbeit wurde aufgezeigt, dass das angestrebte Nanospektrometer, trotz der sehr geringen Größe, eine hohe Auflösung liefern kann und gerade wegen der starken Miniaturisierung mit kommerziellen Mini- und Mikro-spektrometern konkurrenzfähig ist.