Biologische Funktionsanalyse und Identifizierung neuer Substrate der Methyltransferase Dnmt2

Obwohl die DNA Methyltransferase 2 (Dnmt2) hoch konserviert ist und zu der am weitesten verbreiteten eukaryotischen MTase-Familie gehört, ist ihre biologische Funktion nach wie vor unklar. Nachdem lange Zeit keine DNA Methylierungsaktivität nachgewiesen werden konnte, wurde vor einigen Jahren über geringe Mengen an 5-Methylcytosin (5mC) in Retroelementen der “Dnmt2-only”-Organismen D. melanogaster, D. discoideum und E. histolytica berichtet (Kunert et al. 2003; Fisher et al. 2004; Kuhlmann et al. 2005; Phalke et al. 2009). Als kurze Zeit später robuste Methylierung der tRNAAsp durch humane Dnmt2 gezeigt wurde (Goll et al. 2006), wurde zunächst eine Dualspezifität des Enzyms vorgeschlagen (Jeltsch et al. 2006). Neuere Daten zum 5mC-Status verschiedener „Dnmt2-only“-Organismen bilden Anlass für kontroverse Diskussionen über Ausmaß und Bedeutung der DNA Methyltransferaseaktivität von Dnmt2 (Schaefer et al. 2010a; Krauss et al. 2011). Die vorliegende Arbeit konzentriert sich auf die Identifizierung neuer RNA Substrate des Dnmt2-Homologs DnmA aus D. discoideum sowie die biologische Bedeutung der tRNA-Methylierung durch Dnmt2. Wie in anderen Organismen beschrieben, fungiert auch DnmA als tRNAAsp(GUC) MTase in vitro und in vivo. Zusätzlich konnte in vitro tRNAGlu(UUC) als neues Substrat der Dnmt2-Homologe aus D. discoideum und dem Menschen identifiziert werden. In einem Kooperationsprojekt wurde außerdem auch tRNAAsp-Methylierungsaktivität für das Dnmt2-Homolog aus S. pombe (Pmt1) nachgewiesen. Crosslink-RNA-Immunopräzipitationen (RNA-CLIP) mit anschließender Next-Generation-Sequenzierung der mit DnmA assoziierten RNAs zeigen, dass DnmA mit tRNA Fragmenten interagiert, die sich vom Anticodonloop bis in den T-loop erstrecken. Neben der tRNAAsp(GUC) und tRNAGlu(UUC/CUC) sind Fragmente der tRNAGly(GCC) verstärkt angereichert. Inwiefern diese Fragmente eine biologische Funktion haben oder spezifische Degradationsprodukte darstellen, ist noch ungeklärt. Interessanterweise sind von einigen tRNAs wenige Sequenzen von antisense-Fragmenten in den RNA-CLIP Daten zu finden, die etwas kürzer, jedoch exakt komplementär zu den genannten sense-Fragmenten sind. Besonders stark sind diese Fragmente der tRNAGlu(UUC) vertreten. In einem weiteren RNA-CLIP Experiment wurden U-snRNAs, snoRNA und intergenische Sequenzen mit DnmA angereichert. Bei nachfolgenden in vitro Methylierungsstudien konnte ausschließlich die U2-snRNA als potentielles Nicht-tRNA-Substrat der hDnmt2 und DnmA identifiziert werden. Da tRNA Modifikationen im Anticodonloop die Codonerkennung beeinflussen können, wurde ein System etabliert um die Translationseffizienz eines GFP-Reportergens in Wildtyp- und dnmAKO-Zellen zu messen. In D. discoideum wird das Aspartat-Codon GAU ca. zehnmal häufiger genutzt als das GAC Codon, allerdings ist nur eine tRNAAsp(GUC) im Genom der Amöbe kodiert. Aus diesem Grund wurde zusätzlich die Frage adressiert, inwiefern die DnmA-abhängige Methylierung dieser tRNA das „Wobbling“ beeinflusst. Dazu wurde dem Reportergen jeweils eine (GAU)5- und (GAC)5-Leadersequenz vorgeschaltet. Entgegen der Annahme wurde der (GAC)5-Leader in beiden Stämmen etwas effizienter translatiert. Insgesamt zeigte der dnmAKO-Stamm eine leicht erhöhte Translationseffizienz der Reportergene. Vergleichende Analysen zur Aufnahme von Fremd-DNA zeigten signifikant reduzierte Transformationseffizienzen mit einem integrierenden Plasmid in dnmAKO-Zellen. Ein weiterer dnmAKO-Stamm zeigte diesen Effekt jedoch nicht, wobei bei derselben Mutante eine deutlich reduzierte Aufnahme eines extrachromosomalen Plasmids zu verzeichnen war. Untersuchungen zum Einfluss von DnmA auf die Regulation des Retroelements skipper ergaben keinen Zusammenhang zwischen der Generierung kleiner RNAs und der erhöhten Transkription des Retrotransposons in dnmAKO-Zellen (Kuhlmann et al. 2005). Durch Kompensationsversuche sowie Experimente mit einer weiteren dnmAKO-Mutante konnte die Mobilisierung des Retrotransposons nicht eindeutig als DnmA-Funktion eingeordnet werden. In einem weiteren Projekt wurden die Bindung des m5C-bindenden Proteins EhMLBP aus E. histolytica an DNA mittels Rasterkraftmikroskopie abgebildet (Lavi et al. 2006). Neben vermutlich unspezifischen Endbindungsereignissen konnte eine bevorzugte Bindungsstelle des Proteins an LINE DNA (long intersperesed nuclear element) identifiziert werden. Möglicherweise fällt diese mit einem von zwei A/T-reichen Bereichen der LINE DNA zusammen, von denen vermutet wird, dass diese für die Bindung von EhMLBP an DNA von Bedeutung sind. Insgesamt bestätigen die Ergebnisse dieser Arbeit die tRNAAsp Methylierungsaktivität als konservierte Dnmt2-Funktion. Darüber hinaus erweitern sie das Substratspektrum der Dnmt2-Methyltransferasen im Bereich der tRNA. Außerdem wird erstmals ein potentielles Nicht-tRNA Substrat vorgeschlagen. Zusätzlich geben neu entdeckte Phänotypen Hinweise auf vielfältige zelluläre Dnmt2-Funktionen.

Relativistische vier und zwei Spinor Finite Elemente Berechnungen zweiatomiger Moleküle

Der Vielelektronen Aspekt wird in einteilchenartigen Formulierungen berücksichtigt, entweder in Hartree-Fock Näherung oder unter dem Einschluß der Elektron-Elektron Korrelationen durch die Dichtefunktional Theorie. Da die Physik elektronischer Systeme (Atome, Moleküle, Cluster, Kondensierte Materie, Plasmen) relativistisch ist, habe ich von Anfang an die relativistische 4 Spinor Dirac Theorie eingesetzt, in jüngster Zeit aber, und das wird der hauptfortschritt in den relativistischen Beschreibung durch meine Promotionsarbeit werden, eine ebenfalls voll relativistische, auf dem sogenannten Minimax Prinzip beruhende 2-Spinor Theorie umgesetzt. Im folgenden ist eine kurze Beschreibung meiner Dissertation: Ein wesentlicher Effizienzgewinn in der relativistischen 4-Spinor Dirac Rechnungen konnte durch neuartige singuläre Koordinatentransformationen erreicht werden, so daß sich auch noch für das superschwere Th2 179+ hächste Lösungsgenauigkeiten mit moderatem Computer Aufwand ergaben, und zu zwei weiteren interessanten Veröffentlichungen führten (Publikationsliste). Trotz der damit bereits ermöglichten sehr viel effizienteren relativistischen Berechnung von Molekülen und Clustern blieben diese Rechnungen Größenordnungen aufwendiger als entsprechende nicht-relativistische. Diese behandeln das tatsächliche (relativitische) Verhalten elektronischer Systeme nur näherungsweise richtig, um so besser jedoch, je leichter die beteiligten Atome sind (kleine Kernladungszahl Z). Deshalb habe ich nach einem neuen Formalismus gesucht, der dem möglichst gut Rechnung trägt und trotzdem die Physik richtig relativistisch beschreibt. Dies gelingt durch ein 2-Spinor basierendes Minimax Prinzip: Systeme mit leichten Atomen sind voll relativistisch nunmehr nahezu ähnlich effizient beschrieben wie nicht-relativistisch, was natürlich große Hoffnungen für genaue (d.h. relativistische) Berechnungen weckt. Es ergab sich eine erste grundlegende Veröffentlichung (Publikationsliste). Die Genauigkeit in stark relativistischen Systemen wie Th2 179+ ist ähnlich oder leicht besser als in 4-Spinor Dirac-Formulierung. Die Vorteile der neuen Formulierung gehen aber entscheidend weiter: A. Die neue Minimax Formulierung der Dirac-Gl. ist frei von spuriosen Zuständen und hat keine positronischen Kontaminationen. B. Der Aufwand ist weit reduziert, da nur ein 1/3 der Matrix Elemente gegenüber 4-Spinor noch zu berechnen ist, und alle Matrixdimensionen Faktor 2 kleiner sind. C. Numerisch verhält sich die neue Formulierung ähnlilch gut wie die nichtrelativistische Schrödinger Gleichung (Obwohl es eine exakte Formulierung und keine Näherung der Dirac-Gl. ist), und hat damit bessere Konvergenzeigenschaften als 4-Spinor. Insbesondere die Fehlerwichtung (singulärer und glatter Anteil) ist in 2-Spinor anders, und diese zeigt die guten Extrapolationseigenschaften wie bei der nichtrelativistischen Schrödinger Gleichung. Die Ausweitung des Anwendungsbereichs von (relativistischen) 2-Spinor ist bereits in FEM Dirac-Fock-Slater, mit zwei Beispielen CO und N2, erfolgreich gemacht. Weitere Erweiterungen sind nahezu möglich. Siehe Minmax LCAO Nährung.

Nuclear organisation and epigenetic regulation of gene expression in Dictyostelium discoideum

A series of vectors for the over-expression of tagged proteins in Dictyostelium were designed, constructed and tested. These vectors allow the addition of an N- or C-terminal tag (GFP, RFP, 3xFLAG, 3xHA, 6xMYC and TAP) with an optimized polylinker sequence and no additional amino acid residues at the N or C terminus. Different selectable markers (Blasticidin and gentamicin) are available as well as an extra chromosomal version; these allow copy number and thus expression level to be controlled, as well as allowing for more options with regard to complementation, co- and super-transformation. Finally, the vectors share standardized cloning sites, allowing a gene of interest to be easily transfered between the different versions of the vectors as experimental requirements evolve. The organisation and dynamics of the Dictyostelium nucleus during the cell cycle was investigated. The centromeric histone H3 (CenH3) variant serves to target the kinetochore to the centromeres and thus ensures correct chromosome segregation during mitosis and meiosis. A number of Dictyostelium histone H3-domain containing proteins as GFP-tagged fusions were expressed and it was found that one of them functions as CenH3 in this species. Like CenH3 from some other species, Dictyostelium CenH3 has an extended N-terminal domain with no similarity to any other known proteins. The targeting domain, comprising α-helix 2 and loop 1 of the histone fold is required for targeting CenH3 to centromeres. Compared to the targeting domain of other known and putative CenH3 species, Dictyostelium CenH3 has a shorter loop 1 region. The localisation of a variety of histone modifications and histone modifying enzymes was examined. Using fluorescence in situ hybridisation (FISH) and CenH3 chromatin-immunoprecipitation (ChIP) it was shown that the six telocentric centromeres contain all of the DIRS-1 and most of the DDT-A and skipper transposons. During interphase the centromeres remain attached to the centrosome resulting in a single CenH3 cluster which also contains the putative histone H3K9 methyltransferase SuvA, H3K9me3 and HP1 (heterochromatin protein 1). Except for the centromere cluster and a number of small foci at the nuclear periphery opposite the centromeres, the rest of the nucleus is largely devoid of transposons and heterochromatin associated histone modifications. At least some of the small foci correspond to the distal telomeres, suggesting that the chromosomes are organised in a Rabl-like manner. It was found that in contrast to metazoans, loading of CenH3 onto Dictyostelium centromeres occurs in late G2 phase. Transformation of Dictyostelium with vectors carrying the G418 resistance cassette typically results in the vector integrating into the genome in one or a few tandem arrays of approximately a hundred copies. In contrast, plasmids containing a Blasticidin resistance cassette integrate as single or a few copies. The behaviour of transgenes in the nucleus was examined by FISH, and it was found that low copy transgenes show apparently random distribution within the nucleus, while transgenes with more than approximately 10 copies cluster at or immediately adjacent to the centromeres in interphase cells regardless of the actual integration site along the chromosome. During mitosis the transgenes show centromere-like behaviour, and ChIP experiments show that transgenes contain the heterochromatin marker H3K9me2 and the centromeric histone variant H3v1. This clustering, and centromere-like behaviour was not observed on extrachromosomal transgenes, nor on a line where the transgene had integrated into the extrachromosomal rDNA palindrome. This suggests that it is the repetitive nature of the transgenes that causes the centromere-like behaviour. A Dictyostelium homolog of DET1, a protein largely restricted to multicellular eukaryotes where it has a role in developmental regulation was identified. As in other species Dictyostelium DET1 is nuclear localised. In ChIP experiments DET1 was found to bind the promoters of a number of developmentally regulated loci. In contrast to other species where it is an essential protein, loss of DET1 is not lethal in Dictyostelium, although viability is greatly reduced. Loss of DET1 results in delayed and abnormal development with enlarged aggregation territories. Mutant slugs displayed apparent cell type patterning with a bias towards pre-stalk cell types.

Artificial micro RNA system in Dictyostelium discoideum

Dictyostelium discoideum is a social amoeba that serves as a model system for RNA interference and related mechanisms. Its position between plants and animals enables evolutionary snapshot of mechanisms and protein machinery involved in investigated subjects. MiRNAs are small regulatory RNAs that are evolutionary conserved and present in animals, plants, viruses and some prokaryotes. They have roles in development, cell growth and differentiation, apoptosis and their miss-regulation is associated with many diseases such as cancer, neurodegenerative disorders and diabetes. Recently, through sequencing of DNA libraries miRNAs have been discovered in D. discoideum. In this work, it has been shown that heterologues miRNA let-7 can be expressed and processed in D. discoideum. Expression of let-7 miRNA in social amoeba resulted in a strong developmental phenotype suggesting an overload of the processing/silencing system or/and endogenous targets. The various effects on prel-7 strain have been observed and characterized, serving as a background for postulation of miRNA roles. An artificial miRNA system has been established and imposed to D. discoideum, showing that miRNAs in Dictyostelium could mediate gene expression on the level of mRNA stability and on the posttranscriptional level. Furthermore, presence of translational inhibition as a type of gene control was shown for the first time in this organism. Due to it new structures representing co-localities of miRNA and target mRNA have been detected. Taken together, this work shows functional artificial miRNA system and postulates roles of endogenous small RNA in social amoeba.

Electron-Nuclear Correlation in Laser-Driven Diatomic Molecules

The interaction of short intense laser pulses with atoms/molecules produces a multitude of highly nonlinear processes requiring a non-perturbative treatment. Detailed study of these highly nonlinear processes by numerically solving the time-dependent Schrodinger equation becomes a daunting task when the number of degrees of freedom is large. Also the coupling between the electronic and nuclear degrees of freedom further aggravates the computational problems. In the present work we show that the time-dependent Hartree (TDH) approximation, which neglects the correlation effects, gives unreliable description of the system dynamics both in the absence and presence of an external field. A theoretical framework is required that treats the electrons and nuclei on equal footing and fully quantum mechanically. To address this issue we discuss two approaches, namely the multicomponent density functional theory (MCDFT) and the multiconfiguration time-dependent Hartree (MCTDH) method, that go beyond the TDH approximation and describe the correlated electron-nuclear dynamics accurately. In the MCDFT framework, where the time-dependent electronic and nuclear densities are the basic variables, we discuss an algorithm to calculate the exact Kohn-Sham (KS) potentials for small model systems. By simulating the photodissociation process in a model hydrogen molecular ion, we show that the exact KS potentials contain all the many-body effects and give an insight into the system dynamics. In the MCTDH approach, the wave function is expanded as a sum of products of single-particle functions (SPFs). The MCTDH method is able to describe the electron-nuclear correlation effects as the SPFs and the expansion coefficients evolve in time and give an accurate description of the system dynamics. We show that the MCTDH method is suitable to study a variety of processes such as the fragmentation of molecules, high-order harmonic generation, the two-center interference effect, and the lochfrass effect. We discuss these phenomena in a model hydrogen molecular ion and a model hydrogen molecule. Inclusion of absorbing boundaries in the mean-field approximation and its consequences are discussed using the model hydrogen molecular ion. To this end, two types of calculations are considered: (i) a variational approach with a complex absorbing potential included in the full many-particle Hamiltonian and (ii) an approach in the spirit of time-dependent density functional theory (TDDFT), including complex absorbing potentials in the single-particle equations. It is elucidated that for small grids the TDDFT approach is superior to the variational approach.

HelF und sein Interaktionspartner Xrn1: zwei Regulatoren der RNA-Interferenz in D. discoideum

Hauptziel dieser Arbeit ist die Identifizierung, Verifizierung und Charakterisierung von Interaktionspartnern von HelF, einem Negativregulator der RNA-Interferenz in Dictyostelium discoideum (Popova et al. 2006). Es ist gelungen, die Interaktion von HelF und der 5‘ 3‘ Exonuklease Xrn1 nachzu-weisen, aber alle anderen Versuchen, bisher unbekannte Protein-Interaktionspartner zu identifizieren, schlugen fehl. Xrn1 ist in den Organismen D. melanogaster (Orban und Izaurralde 2005), C. elegans (Newbury und Woollard 2004) und A. thaliana (Gazzani et al. 2004) bereits als Regulator der RNA-Interferenz bekannt. Mit Aufreinigungen nach der TAP-Methode und mit dem Nanotrap wurde ebenfalls versucht, RNA-Interaktionspartner von HelF zu identifizieren. Es konnten in einigen Aufreinigungen putative, für HelF spezifische RNAs identifiziert werden, doch entweder es handelte sich nachweislich nicht um RNA oder die Reproduktion der Daten schlug trotz mehrfacher Versuche fehl. Bezüglich der zellulären Lokalisation von HelF und Xrn1 konnte gezeigt werden, dass HelF zusätzlich zur bekannten Lokalisation in Foci im Nukleus (Popova et al. 2006) vermutlich auch im Cytoplasma und dort angeordnet in mehreren Granula zu finden ist. Xrn1 ist nahezu ausschließlich im Cytoplasma lokalisiert, wo es in mehreren Foci organisiert ist. Es wird vermutet, dass es sich bei diesen Foci um Processing-Bodies (P-Bodies) handelt und dass möglicherweise Xrn1 und HelF in eben diesen P-Bodies co-lokalisieren. In der Entwicklung vom Einzeller zum mehrzelligen Organismus zeigen die Xrn1KO- und die HelFKO-Mutante jeweils einen eindeutigen Phänotyp, der vom Wildtyp abweicht. Die Phänotypen der beiden Mutanten unterscheiden sich deutlich voneinander. Beim Mischen von HelF-Knockout-Zellen mit grün fluoreszierenden Wildtyp-Zellen zeigt sich, dass beide Stämme innerhalb des sich entwickelnden Organismus an definierten Stellen lokalisieren. Entgegen den Erwartungen befinden sich die Zellen der Mutante in den Stadien „Finger“ und „Slug“ nicht hauptsächlich im vorderen Teil des Organismus, sondern sind auch im hinteren Teil, der später die Sporenmasse bildet, vertreten. Dies lässt vermuten, dass HelF-Knockout-Mutanten in gleichem Maße wie Wildtypzellen als Sporen in die nächste Generation übergehen. Weitere Mix-Experimente, in denen HelFKO-Zellen und Xrn1KO-Zellen mit grün fluoreszierenden Wildtypzellen gemischt wurden, belegen eindeutig, dass beide Knockoutmutanten in Konkurrenz zum Wildtyp bei der Generierung von Sporen und somit beim Übergang in die nächste Generation benachteiligt sind. Dies steht im Gegensatz zu den Ergebnissen der vorher beschriebenen Mix-Experimente, in denen der Organismus als Ganzes betrachtet wurde. Weiterhin konnte herausgefunden werden, dass Xrn1 ebenso wie HelF (Popova et al. 2006) eine Rolle als Negativregulator in der RNA-Interferenz innehat. Fraglich ist aber, ob HelF wie bisher angenommen auch Einfluss auf den Weg der Generierung von miRNAs nimmt, da in HelFKO für keinen der beiden miRNA-Kandidaten eine Hoch- bzw. Runterregulierung der reifen miRNAs im Vergleich zum Wildtyp beobachtet werden kann. Im Xrn1KO hingegen ist die reife miRNA ddi-mir-1176 im Vergleich zum Wildtyp hochreguliert. In Bezug auf die Generierung von siRNAs konnte herausgefunden werden, dass Xrn1 und HelF im Fall der Generierung von Skipper siRNAs regulierend eingreifen, dass aber nicht alle siRNAs von der negativen Regulierung durch HelF und Xrn1betroffen sind, was am Beispiel der DIRS-1-siRNAs belegt werden kann. Das von B. Popova entwickelte Modell (Popova 2005) bezüglich der Rolle von HelF in der RNA-Interferenz wurde basierend auf den neu gewonnenen Daten weiterentwickelt und um Xrn1 ergänzt, um die Funktionen von HelF und Xrn1 als Antagonisten der RNA-Interferenz näher zu beleuchten. Literatur: Gazzani, S., T. Lawrenson, et al. (2004). "A link between mRNA turnover and RNA interference in Arabidopsis." Science 306(5698): 1046-8. Newbury, S. and A. Woollard (2004). "The 5'-3' exoribonuclease xrn-1 is essential for ventral epithelial enclosure during C. elegans embryogenesis." Rna 10(1): 59-65. Orban, T. I. and E. Izaurralde (2005). "Decay of mRNAs targeted by RISC requires XRN1, the Ski complex, and the exosome." Rna 11(4): 459-69. Popova, B. (2005). HelF, a suppressor of RNAi mediated gene silencing in Dictyostelium discoideum. Genetik. Kassel, Universität Kassel. PhD: 200. Popova, B., M. Kuhlmann, et al. (2006). "HelF, a putative RNA helicase acts as a nuclear suppressor of RNAi but not antisense mediated gene silencing." Nucleic Acids Res 34(3): 773-84.

Funktion und Biogenese kleiner RNAs in Dictyostelium discoideum

RNA mediated gene silencing pathways are highly conserved among eukaryotes and they have been well investigated in animals and in plants. Longer dsRNA molecules trigger the silencing pathways: RNase III proteins and their dsRNA binding protein (dsRBP) partners recognize those molecules as a substrate and process 21 nucleotide long microRNAs (miRNAs) or small interfering RNAs (siRNAs). Some organisms encode RNA dependent RNA polymerases (RdRPs), which are able to expand the pool of existing siRNAs. Argonaute proteins are able to bind small regulatory RNAs and are subsequently recruited to target mRNAs by base complementary. This leads in turn to transcriptional or posttranscriptional silencing of respective genes. The Dictyostelium discoideum genome encodes two Dicer homologues (DrnA and DrnB), five Argonaute proteins (AgnA to AgnE) and three RdRPs (RrpA to RrpC). In addition, the amoeba is known to express miRNAs and siRNAs, while the latter derive mainly from the DIRS-1 retrotransposon. One part of this work focused on the miRNA biogenesis pathway of D. discoideum. It was shown that the dsRNA binding protein RbdB is a necessary component for miRNA processing in the amoeba. There were no mature miRNAs detectable by Northern blot analysis in rbdB- strains, which is also true for drnB mutants. Moreover, primary miRNA-transcripts (pri-miRNAs) accumulated in rbdB- and drnB- strains. Fluorescence microscopy studies showed a nuclear localization of RbdB. RbdB accumulated in distinct perinucleolar foci. These were reminiscent of plant dicing bodies that contain essential protein components for miRNA processing. It is well known that RNase III enzymes and dsRBPs work together during miRNA processing in higher eukaryotes. This work demonstrated that the same is true for members of the amoebozoa supergroup. In Arabidopsis the nuclear zinc finger protein Serrate (SE) is also necessary for miRNA processing. The D. discoideum homologue SrtA, however, is not relevant which has been shown by the analysis of the respective knockdown strain. MiRNAs are known to be differentially expressed in several RNAi knockout strains. The accumulation of miRNAs in agnA- strains and a strong decrease in rbdB- strains were criteria that could thus be successfully used (among others) to identify and validate new miRNAs candidates by Illumina®-RNA sequencing. In another part of this study, the silencing and amplification of the DIRS-1 retrotransposons was analyzed in more detail. It was already known that DIRS-1 transcripts and extrachromosomal DIRS-1 DNA molecules accumulated in agnA- strains. This phenotype was correlated with the loss of endogenous DIRS-1 siRNAs in the knockout strain. By deep sequencing analysis of small RNAs from the AX2 wild type and the agnA- strain, the strong decrease of endogenous DIRS-1 siRNAs in the mutant strain (accounting for 70 %) could be confirmed. Further analysis of the data revealed an unequal distribution of DIRS-1 derived siRNAs along the retroelement in the wild type strain, since only very few of them matched the inverted terminal repeats (ITRs) and the 5’- half of the first open reading frame (ORF). Besides, sense and antisense siRNAs were asymmetrically distributed, as well. By using different reporter constructs it was shown indirectly that AgnA is necessary for the RrpC mediated production of secondary DIRS-1 siRNAs. These analyses also demonstrated an amplification of siRNAs in 5’- and in 3’-direction. Further analysis of the agnA- strain revealed that not only DIRS-1 sense transcripts but also ORF2 and ORF3 encoded proteins were enriched. In contrast, the ORF1 encoded protein GAG was equally expressed in the mutant and the wild type. This might reflect the unequal distribution of endogenous DIRS-1 siRNAs along the retrotransposon. Southern Blot and PCR-analyses showed that extrachromosomal DIRS-1 DNA molecules are present in the cytoplasm of angA- strains and that they are complementary to sense transcripts of intact DIRS-1 elements. Thus, the extrachromosomal DIRS-1 intermediates are likely incomplete cDNA molecules generated by the DIRS-1 encoded reverse transcriptase. One could hypothesize that virus like particles (VLPs) are the places of DIRS-1 cDNA synthesis. At least, DIRS-1 GAG proteins interact and fluorescence microscopy studies showed that they localize in distinct cytoplasmic foci which accumulate in close proximity to the nuclei.