Das RNA-bindende Protein Orb2 und seine regulatorische Funktion in der Spermatogenese von Drosophila melanogaster

Das Protein Orb2, welches zum Xenopus CPEB homolog ist, erfüllt während der Spermatogenese von Drosophila melanogaster eine wesentliche Funktion. Das teilweise Ausschalten von orb2 führt zu Störungen in der Individualisierung der Spermatiden, Veränderung in der Morphologie und Lokalisation der Spermatidenkerne und damit verbunden zu männlicher Sterilität. Der weit gestreute Phänotyp spricht für eine regulatorische Funktion des Proteins, wie es aufgrund der Homologie zu CPEB zu erwarten ist. Orb2 mutante Weibchen zeigen dagegen keinen Phänotyp. Die Sterilität konnte mit spezifischen Rettungskonstrukten rückgängig gemacht werden, wobei die beiden Proteinformen in ihrer Funktion höchstwahrscheinlich äquivalent sind, da eine größere Menge an kleinem Protein das Fehlen des größeren ausgleichen kann. Beide Proteinformen lokalisieren in fast alle Stadien der Spermatogenese, wobei nur das kleinere auch in reifen Spermien persistiert. Zur Untersuchung der regulatorischen Funktion des Proteins Orb2 wurden zunächst drei mögliche Protein-Interaktionskandidaten analysiert. Obwohl ähnliche mutante Phänotypen in Gap und Cup ausgelöst wurden, lässt sich eine Interaktion bis jetzt mit diesen Kandidaten weder ausschließen noch bestätigen. Daneben zeigte das Protein Tob eine ähnliche Lokalisierung und einen deutlich ähnlicheren mutanten Phänotyp, wie er für Orb2 beschrieben wurde. Besonders auffällig ist die Lokalisation der Tob mRNA an die Spermatidenenden und die Verringerung der Transkriptmenge in der orb2-Mutante. Ob dieser Phänotyp durch den Verlust der regulatorischen Funktion von Orb2 hervorgerufen wird oder durch den späten Zeitpunkt der Transkription bedingt ist, muß in späteren Experimenten geklärt werden. Mit Hilfe eines Co-Immunpräzipitations-Experimentes wurde nach weiteren Proteininteraktionspartnern sowie nach Ziel-mRNAs gesucht, die durch Orb2 reguliert werden könnten. Dabei ergaben die massenspektrometrischen Analysen zwar Proteine, die mit der Translation selbst in Zusammenhang stehen, sowie einige regulatorische RNA-bindende Proteine, wiesen aber auch in Gestalt eines häufig nachgewiesenen Anhangsdrüsenproteins auf deutliche systematische Probleme hin. Auf genetischem Wege war bereits der Nachweis gelungen, dass die Protamine und mst77F, die strukturelle Komponenten der kompaktierten Kern-DNA sind, durch Orb2 in ihrer Translation reprimiert werden. Dieses Ergebnis wurde zum Teil bestätigt durch den Nachweis der Protamin mRNAs in den Eluaten aus dem Co-Immunpräzipitationsexperiment. Damit konnte zum ersten Mal in der Drosophila Spermatogenese das regulatorische Protein zu einer translationskontrollierten mRNA identifiziert werden.

Das ER-lokalisierte Protein Farinelli und seine möglichen Interaktionspartner in der Spermatogenese von Drosophila melanogaster

Dem Farinelli-Protein wird eine Funktion als hodenspezifisches VAP-Protein zugesprochen (Renner, 2001). Mit Hilfe des ER-Markers PDI konnte Fan eindeutig dem ER zugeordnet werden. Fan stellt dabei ein integrales Membranprotein dar, welches nur durch Detergenz- Behandlung in Lösung zu bringen war. Durch den Einsatz zweier Fragment-Konstrukte (fan∆MSP-GFP und fanMSP-GFP) von Fan wurde die Relevanz der MSP-Domäne für die männliche Fertilität dokumentiert. Das Fusionsprotein Fan∆MSP-GFP lag aufgrund der verbliebenen Transmembrandomäne weiterhin im ER vor. Dennoch konnte der sterile Phänotyp der fanJo-Männchen, die keinerlei Fan-Protein enthalten, durch das Einbringen des Fusionskonstrukts nicht gerettet werden. MSP-GFP für sich allein konnte keine Verbindung mit dem ER eingehen und zeigte eine diffuse Fluoreszenz. Im Rahmen der Dissertation wurden mehrere, durch das yeast two hybrid-System ermittelte, mögliche Interaktionspartner von Fan analysiert. Das Protein CG5194 konnte als einziges wie Fan dem ER zugeordnet werden. Seine Expression beschränkte sich aber auf die Spermatocytenphase und ist somit kürzer als die von Farinelli. Nach Einkreuzen der GFP-Fusionskonstrukte in die fan-Nullmutante konnte CG5194 nicht mehr am ER der Spermatocyten beobachtet werden, sondern lag innerhalb des Cytoplasmas diffus verteilt vor. Auch bei der Western Blot-Analyse konnte das Protein von CG5194 nur noch in der Überstand-Fraktion mit den ungebundenen Proteinen nachgewiesen werden. Lag in der fan-Nullmutante ausschließlich das Fan∆MSP-GFP-Fusionsprotein vor, konnte die ER-Lokalisation von CG5194 ebenfalls nicht beibehalten werden. Mit Hilfe einer Fragment-Analyse konnte gezeigt werden, dass in den männlichen Gonaden das erste Exon von CG5194 für die Interaktion mit Fan entscheidend ist. Innerhalb der Ovarien dagegen ist das zweite Exon für die Lokalisation im ER notwendig. Demzufolge ist neben einem anderen Interaktionspartner als Fan auch eine andere Domäne im Protein für die ER-Lokalisation in der weiblichen Keimbahn entscheidend. Durch den Einsatz von antisense- und RNAi-Konstrukten konnte ein steriler Phänotyp bei den Männchen erzeugt werden. Überraschenderweise zeigten die Tiere erst einen Defekt während der Spermatiden-Differenzierung. Bereits während der Diplomarbeit wurde 98A im Kopfbereich der elongierten Spermatiden nachgewiesen. Mittels einer DNA-Färbung sowie durch die Colokalisation mit dem Akrosom-Protein Sneaky wurde 98A dem Bereich des Akrosoms zugeordnet. Sneaky taucht jedoch bereits früher als 98A in den Keimzellen auf. Die Erzeugung eines sterilen Phänotyps durch den Einfluss eines RNAi-Konstrukts gelang nicht. Entweder ist 98A für die Fertilität von Drosophila nicht relevant oder aber seine Funktion kann von anderen Proteinen übernommen werden.

„Alles hat seine Stunde. Für jedes Geschehen unter dem Himmel gibt es eine bestimmte Zeit“ (Koh 3,1)

Armut/Reichtum, Arbeit, Glück, Tod, Gott und Mensch sowie Zeit – Dies alles sind Themen, die als existentiell bezeichnet werden können. Mit ihnen beschäftigt sich das alttestamentliche Buch Kohelet, das ca. zwischen 250 und 190 v. Chr. entstanden ist. Trotz des Alters dieses Buches behandelt Kohelet Fragen, die hoch aktuell sind: Gibt es einen Gott? Greift dieser ein? Ist Reichtum etwas Erstrebenswertes? Warum mühen wir uns so ab, wenn wir doch sowieso sterben und all das Erarbeitete hinterlassen müssen? Und haben wir überhaupt Entscheidungs- und Handlungsfreiheit? Ist nicht vielleicht sogar alles von Gott bestimmt? Die Fragen hängen eng mit dem eigenen Selbstbild zusammen. Besonders im Jugendalter befindet sich der Mensch auf der Suche nach einer Identität, nach Erkenntnissen und einer eigenen Weltanschauung. Kohelets Fragen gewinnen in dieser Zeit an Relevanz. Das alttestamentliche Buch kann insbesondere in dieser Lebensphase fruchtbar gemacht werden und anregend sein. Es kann Heranwachsende dazu auffordern, das bisherige Selbstbild und die eigene Weltanschauung zu hinterfragen. Aus diesen Überlegungen heraus ergibt sich das Buch Kohelet als wertvoller Gesprächspartner Jugendlicher. Daneben erscheint es auch naheliegend, Jugendliche mit Kohelet ins Gespräch zu bringen, weil der Adressat des Buches nach Schmitz der junge Erwachsene sei (vgl. Schmitz, 2004, S. 325). Obwohl eine Relevanz des Buches für Jugendliche auszumachen ist, kann das Buch Kohelet bisher als „bibeldidaktisches Stiefkind“ (G. Langenhorst, 2004, S. 317) angesehen werden. Vereinzelt finden sich Umsetzungsvorschläge des Buches im Unterricht. In Lehrplänen wird es jedoch kaum aufgegriffen. Hinzu kommt, dass sich kaum Ausführungen dazu finden, wie Jugendliche die Gedanken Kohelets überhaupt verstehen. Aus diesem Grund hat die vorliegende Arbeit das Ziel, dies in Erfahrung zu bringen. Um die Ausgangsfrage zu beantworten, wurde eine empirische Untersuchung der Rezeption durchgeführt. Dabei wurde das Zeitgedicht des Koheletbuches fokussiert, das das menschliche Leben als Ganzes thematisiert und implizit ein Menschenbild entfaltet. Über die Frage der Rezeption durch OberstufenschülerInnen hinaus, möchte die Arbeit auch Rückschlüsse auf eine mögliche Beschäftigung mit Kohelet im Religionsunterricht schließen. Zunächst wird das hier grundgelegte Verständnis von Textrezeption erläutert. Daraufhin wird der Blick auf die Texteinheit gerichtet. Diese wird eingehend exegetisch untersucht, wobei auch die verschiedenen Lesarten thematisiert werden. In einem nächsten Kapitel rücken die SchülerInnen als Adoleszente ins Zentrum, woraufhin die Untersuchung des Dialogs zwischen Text und SchülerInnen und somit der Rezeption vollzogen wird. Den Schluss bildet ein Fazit mit einem Ausblick.