Biofilmbildung bei Pflanzen-assoziierten Bakterien der Gattung Methylobacterium und molekulargenetisch-physiologische Charakterisierung eines neuen Marchantia-Isolats (Mtb. sp. JT1)

Bakterien existieren bevorzugt in Biofilmen. Das Zusammenleben in diesen Gemeinschaften bietet den einzelnen Mikroben einen wirksamen Schutz und ermöglicht die Ausbildung langfristiger, synergistischer Wechselwirkungen, die mit multizellulären Systemen verglichen werden können. Biofilme bestehen aus Mikrooganismen-Populationen, die sich an Grenzflächen ansammeln und typischerweise von einer Matrix aus extrazellulären polymeren Substanzen umgeben sind. Auch auf Pflanzen-Oberflächen bilden viele Bakterien Biofilme, um ihre Überlebenswahrscheinlichkeit zu erhöhen. In dieser Arbeit wurde die Biofilmbildung bei Pflanzen-assoziierten Bakterien der Gattung Methylobacterium (Mtb.) untersucht, wobei molekular- und mikrobiologische sowie mikroskopische Techniken eingesetzt wurden. Es zeigte sich, dass alle untersuchten Vertreter der Gattung Methylobacterium in unterschiedlichem Ausmaß Biofilme bilden. Die Ausprägung ist dabei Taxon (bzw. Isolat)-spezifisch und vor allem von der Stickstoff-Verfügbarkeit abhängig. Jedoch spielen auch andere Umweltfaktoren, wie die Versorgung der Zellen mit Phosphat und die Zelldichte, bei der Ausbildung der überzellulären Einheiten eine wichtige Rolle. Die Matrix der Biofilme wird meist durch ein fibrilläres Netzwerk gebildet. Dabei handelt es sich um Heteropolysaccharide, die von den Bakterien synthetisiert und sezerniert werden. Einige Isolate bilden zusätzlich zahlreiche Fimbrien (Auswüchse), durch die sie an andere Zellen oder Oberflächen binden können. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurden mehrere neue Methylobacterium-Isolate physiologisch und molekulargenetisch charakterisiert (Nährstoffverwertung, DNA-Sequenzen verschiedener Gene, phylogenetische Analysen usw.). Im Vordergrund stand hierbei der von einer urtümlichen Landpflanze, dem Lebermoos (Marchantia polymorpha), isolierte Stamm Mtb. sp. JT1. Dabei zeigten sich deutliche Unterschiede in der Morphologie und Physiologie des Bakterienstamms JT1 und dem nahe verwandten Stamm 5b.2.20 zu den bereits beschriebenen Taxa der Gattung, so dass eine Spezies-Neubeschreibung erforderlich war. Als Artname wurde aufgrund der außergewöhnlichen Oberflächenstrukturen Mtb. fimbriae sp. nov. eingeführt. Auch andere Methylobakterien (unter anderem Isolat Mtb. sp. F3.2, isoliert vom Laubmoos Funaria hygrometrica) stellen wahrscheinlich Vertreter einer neue Spezies dar (Artname Mtb. funariae sp. nov.). Jedoch zeigen Mtb. fimbriae und Mtb. funariae nur geringe physiologische und morphologische Unterschiede und konnten auf Grundlage umfassender DNA-DNA-Hybridisierungs-Studien nicht eindeutig voneinander abgegrenzt werden.

Untersuchungen zur Biofilmbildung bei dem klinischen Isolat Enterococcus faecalis 1.10

In der vorliegenden Arbeit wurde die Biofilmbildung bei einem klinischen Isolat von Enterococcus faecalis untersucht. Der Prozess der Biofilmbildung ist in mehrere Abschnitte unterteilt und beinhaltet zu Beginn eine Anhaftung von Zellen an Oberflächen. Dieser adhäsive Schritt wird unter anderem durch Pili vermittelt. Pili bei Grampositiven Mikroorganismen sind kovalent mit der Zellwand verknüpfte Proteinstrukturen, die eine Anheftung an biotische und abiotische Oberflächen sowie den Zell-Zell-Kontakt vermitteln. Bei den Analysen dieser Doktorarbeit lag ein besonderes Interesse bei eben diesen Pili, die für Enterococcus faecalis die Namen Ebp (endocarditis and biofilm associated pili) und Bee (biofilm enhancer in enterococci) tragen. Codiert werden sie durch die entsprechenden ebp-/bee-Loci, deren Aufbau unter den Grampositiven Mikroorganismen hochkonserviert ist. Die Loci bestehen aus Pilusuntereinheiten-codierenden Genen und colokalisierten Pilus-spezifischen Sortase Genen. Während in der Regel drei verschiedene Pilusuntereinheiten vorliegen, kann die Anzahl der Sortasen zwischen einer und zwei variieren. Bei den Experimenten wurde neben einer Komplementationsstudie zu einer Bee-Pilus Defekt-Mutante (1.10.16) das Hauptaugenmerk auf die Analyse des zweiten Pilus (Ebp) gelegt, um die Pilisituation bei Isolat 1.10 im Detail darzustellen Zusätzlich sollten weitere Oberflächenassoziierte Proteinstrukturen bei Isolat 1.10 detektiert werden, die gegebenenfalls an der Biofilmbildung beteiligt sind. Weitere Versuche zur Charakterisierung des Bee-Pilus wurden im Laufe dieser Arbeit durchgeführt, blieben jedoch bisher erfolglos. Die Biofilm-/Pilus-Defekt-Mutante 1.10.16 zeigte aufgrund einer Punktmutation (Pm) in der Pilus-spezifischen Sortase 1 des bee-Locus eine geschwächte Fähigkeit zur Anheftung an abiotische Oberflächen, sowie das Fehlen der Bee2 Untereinheit im Pilus. Nach Komplementation der Mutante (1.10.16K) mit dem Wildtyp-srt1 Gen, wurde die starke Biofilmbildungsfähigkeit zurück erlangt. Die Experimente zeigten, dass der Pilus-Defekt auf die Pm im srt1 Gen zurückzuführen war und der Bee-Pilus in Stamm 1.10.16K wieder korrekt gebildet wurde. Zu sehen war dies in Rasterelektronenmikroskopischen Aufnahmen und ebenfalls im massenspektrometrischen Nachweis aller 3 Pilusuntereinheiten im Bee-Pilus charakteristischen High-Molecular-Weight Komplex (~ 250 kDa). Durch Sequenzierungen konnte gezeigt werden, dass zwei Gene des ebp-Locus (ebpR und ebpC) bei Isolat 1.10 durch die Insertion von IS-Elementen IS1062 und IS6770 inaktiviert wurden. Der proteinbiochemische Nachweis über Pilusspezifische Antikörper gegen die Untereinheiten des Ebp-Pilus verlief negativ. Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass die mRNA der beiden inaktivierten Gene nicht gebildet wurde. Dies führte folglich zum vollständigen Verlust des Ebp-Pilus bei Isolat 1.10. Zusammen mit den Ergebnissen der Komplementation konnte somit der große Einfluss mindestens eines intakten Pilus auf die Biofilmbildung gezeigt werden. Sind beide Pili durch Insertionen bzw. Mutationen inaktiviert, kommt es zu einer deutlichen Abnahme der Biofilmbildungsstärke. Dass trotzdem noch ein Biofilm gebildet wurde, zeigt den multifaktoriellen Zusammenhang bzw. Einfluss im Biofilmbildungsprozess. Über das gezielte Markieren von Oberflächenproteinen intakter Zellen mittels der Oberflächenbiotinylierung, konnten in der SDS-PAGE Unterschiede im Bandenmuster im Vergleich zur unbehandelten Probe erkannt werden. Die massenspektrometrische Identifikation dieser Proteine erfolgte bisher nicht, jedoch sind diese vorläufigen Ergebnisse vielversprechender Natur für die Identifikation und Aufklärung der Oberflächenproteinsituation bei Isolat 1.10.

Mikroanalytische Verfahren zur Untersuchung verschiedener Aspekte der Rissinitiierung und Rissausbreitung

Im Rahmen der vorliegenden Arbeit werden mikroanalytische Verfahren zur Untersuchung der verschiedenen Aspekte der Rissinitiierung und –Ausbreitung unter zyklischer Belastung angewendet und gekoppelt, um somit die Informationstiefe durch Korrelation der Ergebnisse zu vergrößern. Die eingesetzten mikroanalytischen Verfahren werden auf verschiedene polykristalline Werkstoffe mit kubisch-raumzentrierter und kubisch-flächenzentierter Gitterstruktur angewendet. Dabei steht der Einfluss der Mikrostruktur auf die Ausbreitung von Ermüdungsrissen in diesen Werkstoffen im Vordergrund. Die im Rahmen dieser Arbeit untersuchten mikrostrukturellen Größen hinsichtlich der Rissinitiierung und -ausbreitung sind die Phasenverteilung, die Korngröße und –Orientierung, die plastische Verformung infolge von Versetzungsbewegungen und die lokale Beanspruchung. Die Methode der Beugung rückgestreuter Elektronen (EBSD) im Rasterelektronenmikroskop steht dabei im Vordergrund der Untersuchungen der mikrostrukturellen Größen. Zu dieser Methode werden Bildkorrelationsverfahren in ihrer Anwendung untersucht, um lokale Verformungen im Bereich der Rissspitze mikrostrukturell kurzer Risse zu erfassen. Die Kopplung der Verfahren liefert ein vertieftes Verständnis der Schädigungsprozesse bei Ermüdungsbelastung an der Oberfläche. Neben der Untersuchung oberflächenbasierter Aspekte bei der Initiierung und Ausbreitung mikro-strukturell kurzer Risse werden volumenbasierte Methoden in Form mikrocomputertomographischer Verfahren eingesetzt, um das Ausbreitungsverhalten nicht nur an der Oberfläche zu untersuchen, sondern auch zusätzlich in Tiefenrichtung. In diesem Zusammenhang werden in-situ Versuche mit hochbrillianter Röntgenstrahlung am Synchrotron SPring-8 vorgestellt und mittels Methoden der Volumenkorrelation ausgewertet. Die Kopplung der Ergebnisse aus den einzelnen analytischen Verfahren liefert ein Betrag zur Ursachenfindung von Rissinitiierung und –Ausbreitung auf mikrostruktureller Ebene sowohl für oberflächen- als auch volumenbehafte Aspekte.

Domänenwandwiderstandseffekt in künstlich erstellten Domänenwänden nach Ionenbeschuss von magnetischen Zweischichtsystemen

Im Rahmen dieser Arbeit wurden magnetische Zweischichtsysteme mit Exchange-Bias-Effekt und künstlichen lateralen Domänenstrukturen auf den Domänenwandwiderstand (DWR) untersucht. Die Erzeugung dieser Domänenmuster erfolgte über Ion Bombardment induced Magnetic Patterning (IBMP), d.h. 10 keV Helium-Ionenbeschuss durch Schattenmasken auf der Probenoberfläche. Mithilfe eines externen Magnetfelds können anschließend die Domänenwände gezielt ein- und ausgeschaltet werden. Zur Untersuchung des DWR-Effekts müssen einige physikalische Voraussetzungen erfüllt sein, wodurch die Herstellung und Charakterisierung entsprechender magnetischer Domänenstrukturen eine der Hauptaufgaben war. Die folgenden Themen werden in dieser Arbeit im Einzelnen behandelt: • Anwendung verschiedener Lithographie-Verfahren zur Erzeugung von Schattenmasken: Für die Verkleinerung der magnetischen Strukturen bis in den Sub-µm-Bereich waren neue Verfahren notwendig. Hierfür wurden die Interferenz- und die NanoImprint-Lithographie eingesetzt. Außerdem wurden Metallnetzchen als Schattenmasken für den Ionenbeschuss genutzt. • Charakterisierung der künstlichen Domänenmuster: Identifikation des Domänenwandtyps anhand von MFM-Messungen unter Zuhilfenahme mikromagnetischer Simulationen und Validierung der Ergebnisse mithilfe von PEEM-Messungen. Untersuchung der Domänenmuster auf die Domänenbreite und Domänenwandbreite in Abhängigkeit der verwendeten Strukturgrößen, Geometrien und Materialien. Magnetische Strukturierung von Exchange-Bias-Proben mit einem nicht-metallischen Antiferromagneten. • Domänenwandwiderstand: Untersuchung des DWR-Effekts in metallischen Exchange-Bias-Proben bei Raumtemperatur sowohl über viele als auch über einzelne Domänenwände sowie temperaturabhängig unterhalb der Raumtemperatur. Untersuchung des DWR-Effekts in oxidischen Zweilagenschichtsystemen bei Raumtemperatur über viele sowie über einzelne Domänenwände. Die Untersuchungen erfolgten mit Vibrationsmagnetometrie (VSM) und magnetooptischem Kerr-Effekt (MOKE), Rasterkraft-/Magnetokraft- und Rasterelektronenmikroskopie (AFM, MFM, REM), Photoemissions-Elektronenmikroskopie (PEEM) und Magnetotransportmessungen.