Untersuchungen über die Redoxregulation der Glutathionsynthese und Charakterisierung von Glutaredoxinen in Spinat

Die an der Glutathionsynthese im Chloroplasten von Spinatblättern beteiligten Enzyme sind auf eine lichtabhängige Regulation durch Thioredoxine (Trx) und Glutaredoxine (Grx) hin untersucht worden. Dazu wurde eine neue, vereinfachte Methode zur Aktivitätsbestimmung für die gamma-Glutamylcystein- und Glutathionsynthetase auf der Kapillarelektrophorese entwickelt. Untersuchungen mit den homologen Thioredoxinen Trx m und Trx f aus Spinatchloroplasten und mit dem E.coli Trx und E.coli Grx 1 zeigten, dass bei beiden Enzymen keine Redoxmodulation durch diese Proteine stattfindet. Weitere Untersuchungen mit der Glutathionsynthetase zeigten keinen Einfluss von Dithiothreit, Sulfit-Ionen und Ascorbat auf die Enzymaktivität. Nur H2O2, in unphysiologischen Konzentrationen, bewirkte eine leichte Abnahme der Ausgangsaktivität. Im Fall der gamma-Glutamylcysteinsynthetase konnten verschiedene Einflüsse ausgemacht werden. So war mit Dithiothreit und H2O2 bei niedrigen Konzentrationen eine Stimulation und bei höheren Konzentration eine Inhibition der Enzymaktivität festzustellen: Sulfit-Ionen zeigten eine starke Stimulierung der gamma-Glutamylcysteinsynthetase über einen weiten Konzentrationsbereich, wobei eine starke pH-Wert-Abhängigkeit der Stimulation zu beobachten war. Ascorbat zeigte, wie bei der Glutathionsynthetase, keinen Einfluss auf die Enzymaktivität der gamma-Glutamyl-cysteinsynthetase. In einem zweiten Teil der Arbeit über die Glutaredoxine des Spinats konnte ein 12,4 kDa Protein mit Thioltransferase-Aktivität, das bisher als cytosolisches Glutaredoxin beschrieben wurde, aufgereinigt und mittels N-terminaler Sequenzierung eindeutig als ein Glutaredoxin identifiziert werden. Überdies konnte ein noch nicht beschriebenes 12,8 kDa Protein mit Thioltransferase-Aktivität aus Spinatchloroplasten aufgereinigt werden. Durch Peptid-Sequenzierung gelang es dieses Protein auch als ein Glutaredoxin zu identifizieren. Beide pflanzlichen Glutaredoxine zeigten keine Modulation der Aktivitäten der chloroplastidären Fructosebisphosphatase (FbPase) und NADPH-Malatdehydrogenase (NADPH-MDH). Auch war mit beiden Glutaredoxinen keine Dehydroascorbatreduktase-Aktivität, oder eine Stimulation der Ribonucleotidreduktase aus Lactobacillus leichmannii festzustellen.

Untersuchung zum Phosphorylierungsstatus der katalytischen Untereinheit der PKA mittels proteomischer Techniken

ZUSAMMENFASSUNG: Das Phosphorylierungsmuster eines Proteins ist kein statischer Zustand, sondern vielmehr ein dynamischer Status, den es in der modernen funktionellen (Phospho-) Proteomik und Analytik abzubilden gilt. Klassischerweise erfolgt der Nachweis der Proteinphosphorylierung auf Peptid-Ebene mittels MS/MS Sequenzierung. Diese Standardmethode der shotgun Phosphoproteomanalytik vernachlässigt jedoch wegen den in LC MS/MS Analysen oftmals schwer detektierbaren Phosphopeptiden gerade den variablen und oftmals nur geringen Phosphorylierungsgrad vieler Phosphorylierungsstellen (P-Stellen). Mittels phosphospezifischer Anreicherungsstrategien und MS/MS Sequenzierung konnten an der Modellkinase PKA-Cα nach rekombinanter Expression in E. coli insgesamt acht P-Stellen identifiziert werden. Der Phosphorylierungsgrad wurde in Kooperation mit Dr. J. Seidler über quantitative Signalintensitätsmessungen bestimmt und zeigte eine nahezu vollständige Phosphorylierung von pS10, pS139, pT197 und pS338, während der Phosphorylierungsgrad für pS34, pS53, pS65 und pS259 zwischen <5 und 45 % variierte. Neben der Quantifizierung der P-Stellen wurde auch das Auftreten und die Verteilung definierter Phosphoformen der PKA-Cα untersucht und deren Abhängigkeit von der primären Aminosäureabfolge, dem Auftreten von zusätzlichen Modifikationen sowie den gewählten Expressions- und Reinigungsbedingungen aufgezeigt. Endogene, aus Säugergewebe isolierte PKA-Cα wies nur eine einzige Phosphoform mit den P-Stellen pT197 und pS338 auf. Auch in vitro autophosphorylierte rekombinante PKA-Cα, die zuvor dephosphoryliert worden war, wies eine zweifach modifizierte Phosphoform auf. Im Vergleich zum endogenen Protein ließ sich dieses Protein an S10 und S338 exzessiv phosphorylieren, wohingegen an T197 keine Autophosphorylierung nachzuweisen war. Das Ausbleiben weiterer Phosphorylierungen stellt in Frage, ob die Hyperphosphorylierung in E. coli ausschließlich auf Autophosphorylierungsprozessen beruht, was anhand einer nicht phosphorylierten, katalytisch inaktiven Variante von PKA-Cα (PKA-Cα K72H) vermutet wurde. Im Hinblick auf die funktionellen P-Stellen pT197 und pS338 erfordert diese Entdeckung sowie der unabhängige Nachweis, dass zellfrei exprimierte PKA-Cα nur an S338 phosphoryliert ist, eine Modifizierung des sequenziellen Vorhersagemodells, wonach die Phosphorylierung an T197 eine zwingende Voraussetzung für die nachfolgende Phosphorylierung an S338 ist. Ferner konnte über phosphomimetische Mutagenese die Funktionalität der Phosphorylierung an S53 innerhalb der glycinreichen Schleife der PKA-Cα und somit ein potenzieller Weg zur Regulation der enzymatischen Aktivität gezeigt werden. Ein weiterer möglicher upstream Regulator von PKA-Cα ist die Proteinphosphatase 5, die in der Lage war, die bislang als phosphatasestabil beschriebene P Stelle pT197 in vitro zu dephosphorylieren. Die vorliegende Arbeit zeigt, dass der Phosphorylierungszustand eines Proteins von zahlreichen internen und externen Faktoren abhängt – eine Tatsache, die gerade für rekombinante Proteine, insbesondere enzymatisch aktive Kinasen, oft vernachlässigt wurde. Daher müssen auch in der shotgun Phosphoproteomanalytik P-Stellen nicht mehr nur identifiziert und quantifiziert werden, sondern die resultierenden Proteinphosphoformen differenziert auch in ihrem physiologischen Kontext beschrieben werden.

Neurochondrin und Rack1 vermitteln die Signalintegration der Proteinkinase A

Die Spezifität und Effizienz zellulärer Signalprozesse wird durch die intrazelluläre Kompartimentierung von Signalmolekülen erreicht. A-Kinase-Ankerproteine (AKAPs) bilden eine Familie aus Gerüstproteinen, die zeitliche und räumliche Lokalisation der cAMP-abhängigen Proteinkinase (PKA) übernehmen. Die direkte Interaktion wird dabei über die Dimerisierungs- und Dockingdomäne (DD-Domäne) der regulatorischen Untereinheiten von PKA vermittelt. Das charakteristische strukturelle Merkmal bei kanonischen AKAPs ist eine amphipathische Helix. Es existiert allerdings auch eine kleine Gruppe von nicht-kanonischen AKAPs, deren Bindung an die DD-Domäne nicht über eine amphipathische Helix vermittelt wird. In dieser Arbeit wurden die zwei potentiellen nicht-kanonischen AKAPs Neurochondrin (neurite-outgrowth promoting protein) und Rack1 (receptor of activated C-kinase 1) charakterisiert. Neurochondrin, dessen Expression mit dem Neuriten-Wachstum in jungen Neuronen korreliert ist und das vermutlich eine entscheidende Funktion bei der Langzeitpotenzierung im Hippocampus übernimmt, zeigt in SPR-Bindungsstudien eine hochaffine, nanomolare Interaktion mit der R-Untereinheit Typ IIalpha von PKA. Kompetitionsanalysen mit dem AKAP-Disruptor-Peptid Ht 31 und Untersuchungen mit der isolierten DD-Domäne von RIIalpha bestätigen eine spezifische Interaktion. Das nicht-kanonische RII-Bindemotiv von Neurochondrin ist aus zwei Domänen aufgebaut, die einen hohen alpha-helikalen Anteil besitzen, aber keine amphipathische Helix bilden. Peptidbasierte Interaktionsstudien der einzelnen Domänen zeigen dennoch ebenfalls nanomolare Affinitäten zu RIIalpha. Rack1 ist ein etabliertes Gerüstprotein mit einer propellerartigen beta-Faltblattstruktur, für das bereits über 100 verschiedene Interaktionspartner beschrieben werden konnten. Die Integration von Rack1 in unterschiedliche Signalprozesse ist äußerst vielfältig. Um dabei die Spezifität jeder einzelnen Interaktion zu gewährleisten, sind individuelle Bindungsstrategien nötig. Die niedrigaffine Interaktion zur RIbeta-Untereinheit von PKA wird daher über multiple Bindestellen vermittelt. Die DD-Domäne von RIbeta übernimmt dabei eine spezifische Funktion, wie unter anderem durch Kompetitionsanalysen mit dem RI-spezifischen AKAP-Disruptor-Peptid RIAD gezeigt werden konnte. Die einzigartige Struktur der DD-Domäne generiert zudem ein Bindemotiv für Rack1, das Ähnlichkeiten mit der „Rack1 interacting-Domäne“ (RAID) von PDE4D5 aufweist. Sowohl Neurochondrin als auch Rack1 besitzen essenzielle neuronale Funktionen. Daher erweitert die Identifizierung der beiden neuen nicht-kanonischen AKAPs nicht nur die strukturelle Diversität der AKAP-Familie, sondern trägt zudem zum Verständnis der neuronalen Signalintegration von PKA bei.

Lokalisation und Funktion von Mitgliedern der Familie der short-chain Dehydrogenasen/Reduktasen in Dictyostelium discoideum

Dictyostelium discoideum wird als Modellorganismus für diverse Krankheitsbilder benutzt. Darunter zählen lysosomale, neurodegenerative Störungen sowie Stoffwechselerkrankungen. Werden diese Amöben mit einer Fettsäure gefüttert, so wird die Biogenese von lipid droplets (LDs) initiiert. Diese dynamischen Organellen dienen der Neutrallipidspeicherung. Das Proteom der LDs konnte für D. discoideum entschlüsselt werden. Unter den rund 70 Proteinen, befinden sich ca. 15, die eine Funktion im Lipidstoffwechsel haben. Darunter befinden sich auch Mitglieder der Enzymklasse der short-shain Dehydrogenasen/Reduktasen. Diese zeigen, wie viele andere LD-Proteine auch, eine duale Lokalisation im Endoplasmatischen Retikulum (ER) und auf LDs. In dieser Arbeit konnten die Sequenzen, die den Wechsel von einer doppelte Phospholipidschicht (ER) auf eine einfache Membran (LDs) möglich machen, entschlüsselt werden. Im Fall der Proteine SdrB/C/D/E/F handelt es sich dabei um ein membranständiges N-terminales Peptid gefolgt von einer Membrandomäne. Helix-brechende Aminosäuren wie Prolin und Glycin in diesen Domänen erzeugen einen Knick, sodass sowohl die C- als auch N-Termini fusioniert an ein Reporterprotein cytoplasmatisch lokalisieren können. Direkt nach der Membrandomäne befindet sich ein kurzer Abschnitt mit basischen, positiv geladenen Aminosäuren, die mit der negativ geladenen Oberfläche der LDs interagieren. Die Membrandomäne allein ist zwar für eine ER-Lokalisation ausreichend, eine LD-Verteilung kann jedoch nur in Kombination mit dem basischen Abschnitt erfolgen. Des Weiteren konnte die Lokalisation von SdrG aufgeklärt werden. Dieses Protein lokalisiert sowohl im ER, als auch auf LDs und den Peroxisomen. Die knockouts einzelner Sdr-Gene zeigten keinen Phänotyp. Auch der Doppel-knockout von SdrB und SdrC blieb Phänotyp-frei. Aus diesem Grund wurden die tandemartig im Genom vorliegenden Gene SdrD-F in einem Triple-knockout untersucht, ebenso wie ein Penta-knockout der Gene SdrB-F. Weiterhin konnten keine Auswirkungen auf die Phagocytose bzw. auf die Verwertung von Fettsäuren und die Mitoserate festgestellt werden. Ebenfalls verläuft der Aufbau und die Degradation von lipid droplets wildtypisch. Mittels Gaschromatographie gekoppelter Massenspektrometrie konnte jedoch ein geringer Unterschied in der Fettsäurekomposition der LDs festgestellt werden. Sobald diese fünf Proteine nicht mehr vorhanden sind, werden 5% weniger 18:1 Δ11 Fettsäuren gebildet und es verbleiben mehr 16:0 Fettsäuren in den LDs. Eine Übernahme der Funktion als Δ9 Desaturase, nach dem Abschnüren der LDs vom Endoplasmatischen Retikulum ist wahrscheinlich.