HelF, a suppressor of RNAi mediated gene silencing in Dictyostelium discoideum

RNA interference (RNAi) is a recently discovered process, in which double stranded RNA (dsRNA) triggers the homology-dependant degradation of cognate messenger RNA (mRNA). In a search for new components of the RNAi machinery in Dictyostelium, a new gene was identified, which was called helF. HelF is a putative RNA helicase, which shows a high homology to the helicase domain of Dicer, to the helicase domain of Dictyostelium RdRP and to the C. elegans gene drh-1, that codes for a dicer related DExH-box RNA helicase, which is required for RNAi. The aim of the present Ph.D. work was to investigate the role of HelF in PTGS, either induced by RNAi or asRNA. A genomic disruption of the helF gene was performed, which resulted in a distinct mutant morphology in late development. The cellular localization of the protein was elucidated by creating a HelF-GFP fusion protein, which was found to be localized in speckles in the nucleus. The involvement of HelF in the RNAi mechanism was studied. For this purpose, RNAi was induced by transformation of RNAi hairpin constructs against four endogenous genes in wild type and HelF- cells. The silencing efficiency was strongly enhanced in the HelF K.O. strain in comparison with the wild type. One gene, which could not be silenced in the wild type background, was successfully silenced in HelF-. When the helF gene was disrupted in a secondary transformation in a non-silenced strain, the silencing efficiency was strongly improved, a phenomenon named here “retrosilencing”. Transcriptional run-on experiments revealed that the enhanced gene silencing in HelF- was a posttranscriptional event, and that the silencing efficiency depended on the transcription levels of hairpin RNAs. In HelF-, the threshold level of hairpin transcription required for efficient silencing was dramatically lowered. The RNAi-mediated silencing was accompanied by the production of siRNAs; however, their amount did not depend on the level of hairpin transcription. These results indicated that HelF is a natural suppressor of RNAi in Dictyostelium. In contrast, asRNA mediated gene silencing was not enhanced in the HelF K.O, as shown for three tested genes. These results confirmed previous observations (H. Martens and W. Nellen, unpublished) that although similar, RNAi and asRNA mediated gene silencing mechanisms differ in their requirements for specific proteins. In order to characterize the function of the HelF protein on a molecular level and to study its interactions with other RNAi components, in vitro experiments were performed. Besides the DEAH-helicase domain, HelF contains a double-stranded RNA binding domain (dsRBD) at its N-terminus, which showed high similarity to the dsRBD domain of Dicer A from Dictyostelium. The ability of the recombinant dsRBDs from HelF and Dicer A to bind dsRNA was examined and compared. It was shown by gel-shift assays that both HelF-dsRBD and Dicer-dsRBD could bind directly to long dsRNAs. However, HelF-dsRBD bound more efficiently to dsRNA with imperfect matches than to perfect dsRNA. Both dsRBDs bound specifically to a pre-miRNA substrate (pre-let-7). The results suggested that most probably there were two binding sites for the proteins on the pre-miRNA substrate. Moreover, it was shown that HelF-dsRBD and Dicer-dsRBD have siRNA-binding activity. The affinities of the two dsRBDs to the pre-let-7 substrate were also examined by plasmon surface resonance analyses, which revealed a 9-fold higher binding affinity of the Dicer-dsRBD to pre-let-7 compared to that of the HelF-dsRBD. The binding of HelF-dsRBD to the pre-let-7 was impaired in the presence of Mg2+, while the Dicer-dsRBD interaction with pre-let-7 was not influenced by the presence of Mg2+. The results obtained in this thesis can be used to postulate a model for HelF function. In this, HelF acts as a nuclear suppressor of RNAi in wild type cells by recognition and binding of dsRNA substrates. The protein might act as a surveillance system to avoid RNAi initiation by fortuitous dsRNA formation or low abundance of dsRNA trigger. If the protein acts as an RNA helicase, it could unwind fold-back structures in the nucleus and thus lead to decreased RNAi efficiency. A knock-out of HelF would result in initiation of the RNAi pathway even by low levels of dsRNA. The exact molecular function of the protein in the RNAi mechanism still has to be elucidated. RNA interferenz (RNAi) ist ein in jüngster Zeit entdeckter Mechanismus, bei dem doppelsträngige RNA Moleküle (dsRNA) eine Homologie-abhängige Degradation einer verwandten messenger-RNA (mRNA) auslösen. Auf der Suche nach neuen Komponenten der RNAi-Maschinerie in Dictyostelium konnte ein neues Gen (helF) identifiziert werden. HelF ist eine putative RNA-Helikase mit einer hohen Homologie zur Helikasedomäne der bekannten Dicerproteine, der Helikasedomäne der Dictyostelium RdRP und zu dem C. elegans Gen drh-1, welches für eine Dicer-bezogene DExH-box RNA Helikase codiert, die am RNAi-Mechanismus beteiligt ist. Das Ziel dieser Arbeit war es, die Funktion von HelF im Zusammenhang des RNAi oder asRNA induzierten PTGS zu untersuchen. Es wurde eine Unterbrechung des helF-Gens auf genomischer Ebene (K.O.) vorgenommen, was bei den Mutanten zu einer veränderten Morphologie in der späten Entwicklung führte. Die Lokalisation des Proteins in der Zelle konnte mit Hilfe einer GFP-Fusion analysiert werden und kleinen Bereichen innerhalb des Nukleus zugewiesen werden. Im Weiteren wurde der Einfluss von HelF auf den RNAi-Mechanismus untersucht. Zu diesem Zweck wurde RNAi durch Einbringen von RNAi Hairpin-Konstrukten gegen vier endogene Gene im Wiltypstamm und der HelF--Mutante induziert. Im Vergleich zum Wildtypstamm konnte im HelF--Mutantenstamm eine stark erhöhte „Silencing“-Effizienz nachgewiesen werden. Ein Gen, welches nach RNAi Initiation im Wildtypstamm unverändert blieb, konnte im HelF--Mutantenstamm erfolgreich stillgelegt werden. Durch sekundäres Einführen einer Gendisruption im helF-Locus in einen Stamm, in welchem ein Gen nicht stillgelegt werden konnte, wurde die Effizienz des Stilllegens deutlich erhöht. Dieses Phänomen wurde hier erstmals als „Retrosilencing“ beschrieben. Mit Hilfe von transkriptionellen run-on Experimenten konnte belegt werden, dass es sich bei dieser erhöhten Stilllegungseffizienz um ein posttranskriptionelles Ereignis handelte, wobei die Stillegungseffizienz von der Transkriptionsstärke der Hairpin RNAs abhängt. Für die HelF--Mutanten konnte gezeigt werden, dass der Schwellenwert zum Auslösen eines effizienten Stillegens dramatisch abgesenkt war. Obwohl die RNAi-vermittelte Genstilllegung immer mit der Produktion von siRNAs einhergeht, war die Menge der siRNAs nicht abhängig von dem Expressionsniveau des Hairpin-Konstruktes. Diese Ergebnisse legen nahe, dass es sich bei der HelF um einen natürlichen Suppressor des RNAi-Mechanismus in Dictyostelium handelt. Im Gegensatz hierzu war die as-vermittelte Stilllegung von drei untersuchten Genen im HelF-K.O. im Vergleich zum Wildyp unverändert. Diese Ergebnisse bestätigten frühere Beobachtungen (H. Martens und W. Nellen, unveröffentlicht), wonach die Mechanismen für RNAi und asRNA-vermittelte Genstilllegung unterschiedliche spezifische Proteine benötigen. Um die Funktion des HelF-Proteins auf der molekularen Ebene genauer zu charakterisieren und die Interaktion mit anderen RNAi-Komponenten zu untersuchen, wurden in vitro Versuche durchgeführt. Das HelF-Protein enthält, neben der DEAH-Helikase-Domäne eine N-terminale Doppelstrang RNA bindende Domäne (dsRBD) mit einer hohen Ähnlichkeit zu der dsRBD des Dicer A aus Dictyostelium. Die dsRNA-Bindungsaktivität der beiden dsRBDs aus HelF und Dicer A wurde analysiert und verglichen. Es konnte mithilfe von Gel-Retardationsanalysen gezeigt werden, dass sowohl HelF-dsRBD als auch Dicer-dsRBD direkt an lange dsRNAs binden können. Hierbei zeigte sich, dass die HelF-dsRBD eine höhere Affinität zu einem imperfekten RNA-Doppelstrang besitzt, als zu einer perfekt gepaarten dsRNA. Für beide dsRBDs konnte eine spezifische Bindung an ein pre-miRNA Substrat nachgewiesen werden (pre-let-7). Dieses Ergebnis legt nah, dass es zwei Bindestellen für die Proteine auf dem pre-miRNA Substrat gibt. Überdies hinaus konnte gezeigt werden, dass die dsRBDs beider Proteine eine siRNA bindende Aktivität besitzen. Die Affinität beider dsRBDs an das pre-let-7 Substrat wurde weiterhin mit Hilfe der Plasmon Oberflächen Resonanz untersucht. Hierbei konnte eine 9-fach höhere Bindeaffinität der Dicer-dsRBD im Vergleich zur HelF-dsRBD nachgewiesen werden. Während die Bindung der HelF-dsRBD an das pre-let-7 durch die Anwesenheit von Mg2+ beeinträchtigt war, zeigte sich kein Einfluß von Mg2+ auf das Bindeverhalten der Dicer-dsRBD. Mit Hilfe der in dieser Arbeit gewonnen Ergebnisse lässt sich ein Model für die Funktion von HelF postulieren. In diesem Model wirkt HelF durch Erkennen und Binden von dsRNA Substraten als Suppressor von der RNAi im Kern. Das Protein kann als Überwachungsystem gegen eine irrtümliche Auslösung von RNAi wirken, die durch zufällige dsRNA Faltungen oder eine zu geringe Häufigkeit der siRNAs hervorgerufen sein könnte. Falls das Protein eine Helikase-Aktivität besitzt, könnte es rückgefaltete RNA Strukturen im Kern auflösen, was sich in einer verringerten RNAi-Effizienz wiederspiegelt. Durch Ausschalten des helF-Gens würde nach diesem Modell eine erfolgreiche Auslösung von RNAi schon bei sehr geringer Mengen an dsRNA möglich werden. Das Modell erlaubt, die exakte molekulare Funktion des HelF-Proteins im RNAi-Mechanismus weiter zu untersuchen.

Protein-Expressions-Analysen zur Etablierung prädiktiver Biomarker bei der Behandlung fortgeschrittener Tumoren der Mamma und der Prostata

Aktuelle Entwicklungen auf dem Gebiet der zielgerichteten Therapie zur Behandlung maligner Erkrankungen erfordern neuartige Verfahren zur Diagnostik und Selektion geeigneter Patienten. So ist das Ziel der vorliegenden Arbeit die Identifizierung neuer Zielmoleküle, die die Vorhersage eines Therapieerfolges mit targeted drugs ermöglichen. Besondere Aufmerksamkeit gilt dem humanisierten monoklonalen Antikörper Trastuzumab (Herceptin), der zur Therapie Her-2 überexprimierender, metastasierter Mammakarzinome eingesetzt wird. Jüngste Erkenntnisse lassen eine Anwendung dieses Medikamentes in der Behandlung des Hormon-unabhängigen Prostatakarzinoms möglich erscheinen. Therapie-beeinflussende Faktoren werden in der dem Rezeptor nachgeschalteten Signaltransduktion oder Veränderungen des Rezeptors selbst vermutet. Mittels Immunhistochemie wurden die Expressions- und Aktivierungsniveaus verschiedener Proteine der Her-2-assoziierten Signaltransduktion ermittelt; insgesamt wurden 37 molekulare Marker untersucht. In Formalin fixierte und in Paraffin eingebettete korrespondierende Normal- und Tumorgewebe von 118 Mammakarzinom-Patientinnen sowie 78 Patienten mit Prostatakarzinom wurden in TMAs zusammengefasst. Die in Zusammenarbeit mit erfahrenen Pathologen ermittelten Ergebnisse dienten u.a. als Grundlage für zweidimensionales, unsupervised hierarchisches clustering. Ergebnis dieser Analysen war für beide untersuchten Tumorentitäten die Möglichkeit einer Subklassifizierung der untersuchten Populationen nach molekularen Eigenschaften. Hierbei zeigten sich jeweils neue Möglichkeiten zur Anwendung zielgerichteter Therapien, deren Effektivität Inhalt weiterführender Studien sein könnte. Zusätzlich wurden an insgesamt 43 Frischgeweben die möglichen Folgen des sog. shedding untersucht. Western Blot-basierte Untersuchungen zeigten hierbei die Möglichkeit der Selektion von Patienten aufgrund falsch-positiver Befunde in der derzeit als Standard geltenden Diagnostik. Zusätzlich konnte durch Vergleich mit einer Herceptin-sensitiven Zelllinie ein möglicher Zusammenhang eines Therapieerfolges mit dem Phosphorylierungs-/ Aktivierungszustand des Rezeptors ermittelt werden. Fehlende klinische Daten zum Verlauf der Erkrankung und Therapie der untersuchten Patienten lassen keine Aussagen über die tatsächliche Relevanz der ermittelten Befunde zu. Dennoch verdeutlichen die erhaltenen Resultate eindrucksvoll die Komplexität der molekularen Vorgänge, die zu einem Krebsgeschehen führen und damit Auswirkungen auf die Wirksamkeit von targeted drugs haben können. Entwicklungen auf dem Gebiet der zielgerichteten Therapie erfordern Verbesserungen auf dem Gebiet der Diagnostik, die die sichere Selektion geeigneter Patienten erlauben. Die Zukunft der personalisierten, zielgerichteten Behandlung von Tumorerkrankungen wird verstärkt von molekularen Markerprofilen hnlich den hier vorgestellten Daten beeinflusst werden.

Elterliche Geschlechtsstereotype und deren Einfluss auf das mathematische Selbstkonzept von Grundschulkindern

Ausgangspunkt dieser Dissertation ist die Überlegung, warum Mädchen und Frauen in mathematisch-naturwissenschaftlichen Fächern und Berufen unterrepräsentiert sind. Irrtümlicherweise werden als Erklärung hierfür häufig Geschlechterdifferenzen in der Mathematikleistung herangezogen. Diese bieten jedoch aufgrund nicht einheitlicher Forschungsbefunde keinen zufriedenstellenden Erklärungsansatz. Naheliegender ist es, das mangelnde Selbstvertrauen von Mädchen in Mathematik (als mathematisches Selbstkonzept bezeichnet) als Ursache heranzuziehen, denn verschiedene Studien kamen zu dem Ergebnis, dass Mädchen, auch bei vergleichbarer Leistung, ein geringeres mathematisches Selbstkonzept aufweisen als Jungen (Dickhäuser & Stiensmeier-Pelster, 2003; Frome & Eccles, 1998; Rustemeyer & Jubel, 1996; Skaalvik & Skaalvik, 2004). Die Rolle der Eltern als primäre Sozialisationsinstanz wird als bedeutsamer Einflussfaktor auf das mathematische Selbstkonzept von Kindern beschrieben. Besonders für den Bereich Mathematik besteht die Gefahr, dass Eltern durch geschlechtsstereotype Einstellungen und Erwartungen ihre Tochter ungünstig beeinflussen (Jacobs, 1991; Tiedemann, 2000). In dieser Arbeit wird untersucht, inwiefern Eltern Geschlechtsstereotype zuungunsten der Mädchen in Mathematik äußern und inwiefern sich diese – schon zur Grundschulzeit – in den elterlichen Einschätzungen (elterliche Leistungs- und Fähigkeitseinschätzungen sowie elterliche Ursachenerklärungen) des eigenen Kindes widerspiegeln. Es wird angenommen, dass Mädchen entsprechend dem klassischen Geschlechtsstereotyp weniger talentiert und weniger leistungsstark in Mathematik eingeschätzt werden als Jungen. Für die Einschätzungen des eigenen Kindes wird erwartet, dass diese geschlechtsspezifische Verzerrungen zuungunsten der Mädchen aufweisen. Anhand von Pfadmodellen wird in dieser Arbeit der Einfluss elterlicher Geschlechtsstereotype und Einschätzungen, unter Kontrolle der vorangegangenen Mathematikleistung und des vorangegangenen mathematischen Selbstkonzeptes des Kindes, auf das aktuelle mathematische Selbstkonzept des Kindes am Ende des dritten Schuljahres analysiert. Als Grundlage dienen Daten von circa 900 Schülern und 400 Eltern aus dem Projekt Persönlichkeits- und Lernentwicklung von Grundschulkindern (PERLE). Die Befunde der vorliegenden Arbeit können bisherige Forschungsbefunde aus dem Sekundarbereich für den Grundschulbereich replizieren und weitere erstmalige Befunde ergänzen. Zusammenfassend kann festgehalten werden, dass knapp zwei Drittel der Eltern Geschlechtsstereotype zuungunsten der Mädchen in Mathematik äußern. Die Pfadanalysen ergeben, dass nicht das Geschlecht des Kindes, sondern Wechselwirkungen zwischen Geschlecht und elterlichen Geschlechtsstereotypen die elterlichen Einschätzungen des eigenen Kindes beeinflussen. Wenn Eltern Geschlechtsstereotype vertreten, schätzen sie eine Tochter ungünstiger ein als einen Sohn (unabhängig von der tatsächlichen Mathematikleistung des Kindes). Die elterlichen Einschätzungen haben wiederum einen signifikanten Einfluss auf das mathematische Selbstkonzept des Kindes. Die Ergebnisse dieser Arbeit werden abschließend diskutiert und Ansätze für Interventionen aufgezeigt.