Funktionsanalysen der Domänen des Vacuolin B und die Rolle des filamentösen Actins am Vacuolin B-positiven Kompartiment im endocytotischen Transit in Dictyostelium discoideum

Ähnlich wie in Säugerzellen ist das neutrale Postlysosom in Dictyostelium discoideum von einem Coat aus filamentösem Actin umgeben. In dieser Arbeit wurde der Frage nach der Funktion dieses Actin-Cytoskeletts am späten Endosom nachgegangen. Hierzu wurde zunächst eine Analyse der Domänen des Vacuolin B durchgeführt, das als bisher spätester bekannter Marker im Endocytoseweg in Dictyostelium discoideum das neutrale, postlysosomale Kompartiment dekoriert. In einer Yeast Two Hybrid-Analyse wurden die Bereiche des Vacuolin B identifiziert, die für eine Selbst-Interaktion des Proteins notwendig und ausreichend sind. Es handelt sich dabei um die coiled-coil-Domäne und einen daran anschließenden, 18 Aminosäuren langen, alpha-helicalen Abschnitt. Diesem helicalen Bereich scheint die Funktion einer modifizierenden, die coiled-coil-Ausbildung vermittelnden oder initiierenden Faltungseinheit zuzukommen. Sie weist jedoch nicht die typischen Merkmale einer trigger-Helix auf. Lokalisationsuntersuchungen mit GFP-Deletionskonstrukten zeigten, dass es einen Zusammenhang zwischen Interaktionsfähigkeit und Bindung des Vacuolin an die Oberfläche später Endosomen gibt: Eine korrekte Lokalisation und Membranassoziation waren nur dann zu beobachten, wenn in der Yeast Two Hybrid-Analyse eine Interaktion nachgewiesen werden konnte. Es wurden die für die Lokalisation und Assoziation mit der vacuolären Membran notwendigen Sequenzbereiche identifiziert; diese waren jedoch nicht hinreichend. Vermutlich sind hierfür auch Sequenzen des N-Terminus notwendig. Die erhobenen Daten legen weiterhin eine Bedeutung der hydrophoben Domäne des Vacuolin B für die korrekte Faltung des Proteins nahe. Im Anschluss an die Domänenanalyse wurde Vacuolin dazu benutzt, durch Herstellung von Hybridproteinen Actin-interagierende Proteine gezielt an das späte Endosom zu transportieren. Es wurde deren Einfluss auf den lokalen Actin Coat und den endocytotischen Transit untersucht. Zwei Actin-bindende Proteine mit depolymerisierender Wirkung konnten im Rahmen dieser Arbeit getestet werden, nämlich Severin und Cofilin. Die Schwächung des lokalen Actin Coats durch das Vorhandensein von Severin an der späten Vacuole war nicht eindeutig festzustellen. Severin am Postlysosom führte nicht zu einer Veränderung der Transitkinetik von Flüssigphasenmarker. Allerdings konnte ein Defekt in der Phagocytose festgestellt werden. Es könnte hierbei ein Zusammenhang zwischen der Mobilisierung von intrazellulärem Calcium während der Partikelaufnahme und der Calcium-abhängigen Regulation der Severin-Aktivität bestehen. Das Hybridprotein aus Vacuolin und Cofilin zeigte neben einer Assoziation mit der vacuolären Membran auch eine Lokalisation im Cytoplasma und Cortex der Zellen. Mit der Lokalisation im Cytoplasma und Cortex korrelierte eine Veränderung der endocytotischen Aktivität. Das Vacuolin-Cofilin-Fusionsprotein am Postlysosom rief einen Verlust des lokalen Actin Coats hervor. Dies führte zu einer traubenförmigen Assoziation der späten Endosomen; exocytotische Parameter blieben jedoch unbeeinflusst. Aufgrund der hier erhobenen Daten kann vermutet werden, dass der Actin Coat am Postlysosom dazu dient, eine Agglutination dieser Endosomen zu inhibieren. Dies könnte ein Schutzmechanismus zum Ausschluss von Docking- und Fusionsereignissen sein.

Funktionelle Analyse der LC-FACS in Dictyostelium discoideum

"Funktionelle Analyse der LC-FACS in Dictyostelium discoideum" Das Dictyostelium discoideum Gen fcsA kodiert für ein 75 kDa großes Protein. Es kann durch Homologieanyalysen der Amino-säuresequenz zu den "long-chain fatty acyl-CoA"-Synthetasen ge-rechnet werden, die lang-kettige Fettsäuren durch die kovalente Bindung von Coenzym A akti-vie-ren und damit für diverse Reak-tionen in Stoffwechsel und Molekül-Synthese der Zelle verfügbar machen. Die hier untersuchte D. discoideum LC-FACS lokalisiert als peripher assoziiertes Protein an der cytosolischen Seite der Membran von Endo-somen und kleiner Vesikel. Bereits kurz nach der Bildung in der frühen sauren Phase kann die Lokalisation der LC-FACS auf Endosomen ge-zeigt werden. Sie dissoziiert im Laufe ihrer Neutra-li-sierung und kann auf späten Endosomen, die vor ihrer Exocytose stehen nicht mehr nach-gewiesen werden. Ein Teil der kleinen die in der gesamte Zelle verteilten kleinen Vesikel zeigt eine Kolokalisation mit lysosomalen Enzymen. Trotz des intrazellulären Verteilungs-mus-ters, das eine Beteiligung dieses Pro-teins an der Endocytose nahe-legt, konnte kein signifikanter Rückgang der Pino- und Phagocytose-Rate in LC-FACS Nullmutanten beobachtet werden. Der endo-cy-to-ti-sche Transit ist in diesen Zellen etwas verlängert, außerdem zeigen die Endosomen einen deutlich erhöhten pH-Wert, was zu einer weniger effektiven Prozessierung eines lysosomalen Enzyms führt (a-Mannosidase). Die Funktion der LC-FACS ist die Aufnahme von langkettigen Fettsäuren aus dem Lumen der Endosomen.

On the function of the Dictyostelium Argonaute A protein (AgnA) in epigenetic gene regulation

With molecular biology methods and bioinformatics, the Argonaute proteins in Dictyostelium discoideum were characterized, and the function of the AgnA protein in RNAi and DNA methylation was investigated, as well as cellular features. Also interaction partners of the PAZ-Piwi domain of AgnA (PAZ-PiwiAgnA) were discovered. The Dictyostelium genome encodes five Argonaute proteins, termed AgnA/B/C/D/E. The expression level of Argonaute proteins was AgnB/D/E > AgnA > AgnC. All these proteins contain the characteristic conserved of PAZ and Piwi domains. Fluorescence microscopy revealed that the overexpressed C-terminal GFP-fusion of PAZ-PiwiAgnA (PPWa-GFP) localized to the cytoplasm. Overexpression of PPWa-GFP leaded to an increased gene silencing efficiency mediated by RNAi but not by antisense RNA. This indicated that PAZ-PiwiAgnA is involved in the RNAi pathway, but not in the antisense pathway. An analysis of protein-protein interactions by a yeast-two-hybrid screen on a cDNA library from vegetatively grown Dictyostelium revealed that several proteins, such as EF2, EF1-I, IfdA, SahA, SamS, RANBP1, UAE1, CapA, and GpdA could interact with PAZ-PiwiAgnA. There was no interaction between PAZ-PiwiAgnA and HP1, HelF and DnmA detected by direct yeast-two-hybrid analysis. The fluorescence microscopy images showed that the overexpressed GFP-SahA or IfdA fusion proteins localized to both cytoplasm and nuclei, while the overexpressed GFP-SamS localized to the cytoplasm. The expression of SamS in AgnA knock down mutants was strongly down regulated on cDNA and mRNA level in, while the expression of SahA was only slightly down regulated. AgnA knock down mutants displayed defects in growth and phagocytosis, which suggested that AgnA affects also cell biological features. The inhibition of DNA methylation on DIRS-1 and Skipper retroelements, as well as the endogenous mvpB and telA gene, observed for the same strains, revealed that AgnA is involved in the DNA methylation pathway. Northern blot analysis showed that Skipper and DIRS-1 were rarely expressed in Ax2, but the expression of Skipper was upregulated in AgnA knock down mutants, while the expression of DIRS-1 was not changed. A knock out of the agnA gene failed even though the homologous recombination of the disruption construct occurred at the correct site, which indicated that there was a duplication of the agnA gene in the genome. The same phenomenon was also observed in ifdA knock out experiments.

Immunologisches Reaktionsvermögen als Indikator für Belastungen bei der Milchkuh

Mit ansteigenden Jahresmilchleistungen werden die Kühe einer hohen metabolischen Belastung ausgesetzt, die bei einer suboptimalen Gestaltung der Lebensbedingungen mit einer Erhöhung der Inzidenzrate von Faktorenkrankheiten einhergehen kann. Im Vordergrund der Untersuchungen stand die Frage, inwieweit metabolische Belastungszustände von Milchkühen in der Phase des Puerperiums und in Abhängigkeit von der Milchleistung sowie Belastungen durch eine klinische Erkrankung zu Beginn der Laktation mit Hilfe von Parametern der immunologischen Abwehr und der Reaktion des Immunsystems auf eine Challenge dargestellt werden können. In die Untersuchung wurden insgesamt 68 klinisch gesunde sowie 20 klinisch erkrankte Milchkühe der Rasse Holstein Friesian einbezogen. Die Untersuchungen erfolgten in den Zeiträumen 10-21 Tage sowie 14-15 Wochen nach der Kalbung. Dazu wurden an jeweils drei Untersuchungstagen (Tag 0, 2, 7) Blutproben aus der Vena jugularis entnommen. Zur Stimulierung des unspezifischen Immunsystems wurde in beiden Versuchszeiträumen an den Untersuchungstagen 0 und 2 der Paramunitätsinducer Zylexis® appliziert. Ferner wurde den Kühen zu Beginn der Laktation der Tollwutimpfstoff Rabisin® verabreicht. Für die Auswertung wurden die untersuchten Milchkühe in Gruppen unterteilt. Die klinisch gesunden Kühe wurden anhand der nach Fett und Eiweiß korrigierten 305-Tage-Leistung in die Gruppe M = mittleres Leistungsniveau (Milchmengenleistung 6.500-8.990 kg) und die Gruppe H = hohes Leistungsniveau (Milchmengenleistung 9.000-12.500 kg) aufgeteilt. Die klinisch erkrankten Kühe wurden in der Gruppe K zusammengefasst. Zur Beurteilung der Immunabwehr wurden die Parameter Phagozytoseaktivität der isolierten Neutrophilen Granulozyten, die Vollblutbakterizidie, die Lymphozytenproliferation mit den Mitogenen ConA, PHA und PWM sowie die spezifische Antikörperbildung gegen Tollwut untersucht. Anhand der Parameter Phagozytoseaktivität, Vollblutbakterizidie und Lymphozytenproliferation wurde zusätzlich die Reaktion auf die Challenge mit dem Paramunitätsinducer Zylexis® überprüft. Zur Erfassung der metabolischen Belastungszustände wurden verschiedene Stoffwechselparameter und hämatologische Parameter erfasst. Zu Beginn der Laktation konnten bei den Kühen in der mittleren und hohen Leistungsgruppe signifikant höhere Konzentrationen an ß-Hydroxybuttersäure und Freien Fettsäuren im Vergleich zu der Laktationsmitte festgestellt werden. Die Kühe mit einem hohen Leistungsniveau zeigten darüber hinaus eine signifikant höhere Bilirubinkonzentration am Laktationsanfang gegenüber der Laktationsmitte. Die mittlere Konzentration der freien Fettsäuren lag bei den Kühen in beiden Leistungsgruppen oberhalb des Referenzbereiches und wies auf eine negative Energiebilanz zu Laktationsbeginn hin. Die mittleren Konzentrationen bzw. Enzymaktivitäten der Parameter Cholesterol, Harnstoff, AST, GLDH, γ-GT, Gesamtprotein, Kalzium und Phosphor wiesen in der Laktationsmitte signifikant höhere Werte als am Laktationsanfang auf. Dabei lagen die mittleren Enzymaktivitäten von AST und GLDH sowie die Konzentrationen von Harnstoff und Gesamtprotein in der Laktationsmitte oberhalb des Referenzbereiches. Die untersuchten Stoffwechselparameter wurden durch die Challenge mit einem Paramunitätsinducer nicht signifikant beeinflusst. Hinsichtlich der Immunparameter zeigten die Milchkühe mit einem mittleren Leistungsniveau in Abhängigkeit vom Laktationszeitpunkt zu Beginn der Laktation eine signifikant höhere Phagozytoseaktivität gegenüber der Laktationsmitte (p < 0,05). Die Gruppe mit einem hohen Leistungsniveau wies dagegen keine signifikanten Unterschiede in der Phagozytoseaktivität zwischen den beiden Untersuchungszeiträumen auf. Bei den Immunparametern Vollblutbakterizidie und Lymphozytenproliferation konnten bei den Kühen beider Gruppen keine signifikanten Unterschiede in Abhängigkeit vom Laktationszeitpunkt festgestellt werden. Im Hinblick auf die Milchleistung wiesen die Kühe in den beiden Leistungsgruppen am Untersuchungstag 0 weder zu Beginn noch in der Mitte der Laktation signifikante Unterschiede bezüglich der untersuchten Immunparameter auf. Nach der Challenge durch den Paramunitätsinducer reagierten einzig die Kühe mit einer mittleren Leistung zu Beginn der Laktation auf die Challenge mit einer signifikanten Reduzierung der mittleren Phagozytoseaktivität von Tag 0 zu Tag 2 (p < 0,05). Bei den weiteren untersuchten Immunparametern konnten weder bei den Kühen mit einer mittleren noch mit einer hohen Leistung eine signifikante Reaktion auf die Challenge nachgewiesen werden. Die klinisch erkrankten Kühe zeigten im Vergleich zu den klinisch gesunden Kühen keine unterschiedlichen Konzentrationen bzw. Aktivitäten der untersuchten Stoffwechselparameter. Auch konnten anhand der immunologischen Parameter und der Reaktion auf die Challenge keine Unterschiede zwischen den klinisch gesunden Kühen festgestellt werden. Die in der vorliegenden Untersuchung geprüften metabolischen Belastungen konnten weder anhand der Immunparameter noch durch die Reaktion der Immunparameter auf eine Challenge dargestellt werden. Es wird geschlussfolgert, dass das immunologische Reaktionsvermögen nicht geeignet ist, um als Indikator für Belastungszustände bei der Milchkuh herangezogen zu werden.

Unveiling the components of the signaling pathway between endosomes and the phagocytic uptake machinery in Dictyostelium discoideum

The soil amoebae Dictyostelium discoideum take up particles from their environment in order to obtain nutrition. The particle transits through the cell within a phagosome that fuses with organelles of different molecular compositions, undergoing a gradual degradation by different sets of hydrolytic enzymes. Griffiths’ concept of “phagosome individuality” predicts signaling from phagosomes into the cytoplasm, which might regulate many aspects of cell physiology. The finding that Dictyostelium cells depleted of the lysozyme AlyA or over-expressing the esterase Gp70 exhibit increased uptake of food particles, led to the postulation of a signaling cascade between endocytic compartments and the cytoskeletal uptake machinery at the plasma membrane. Assuming that Gp70 acts downstream of AlyA, gene-expression profiling of both mutants revealed different and overlapping sets of misregulated genes that might participate in this signaling cascade. Based on these results, we analyzed the effects of the artificial misregulation of six candidate genes by over-expression or negative genetic interference, in order to reconstruct at least part of the signaling pathway. SSB420 and SSL793 were chosen as candidates for the first signaling step, as they were up-regulated in AlyA-null cells and remained unaltered in the Gp70 over-expressing cells. The over-expression of SSB420 enhanced phagocytosis and raised the expression levels of Gp70, supporting its involvement in the signaling pathway between AlyA and Gp70 as a positive regulator of phagocytosis. However, this was not the case of cells over-expressing SSL793, as this mutation had no effects on phagocytosis. For the signaling downstream of Gp70, we studied four commonly misregulated genes in AlyA-depleted and Gp70 over-expressing cells. The expression levels of SLB350, SSB389 and TipD were lower in both mutants and therefore these were assumed as possible candidates for the negative regulation of phagocytosis. Cells depleted of SLB350 exhibited an increased phagocytic activity and no effect on Gp70 expression, proving its participation in the signaling pathway downstream of Gp70. Unlike SLB350, the disruption of the genes coding for SSB389 and TipD had no effects on particle uptake, excluding them from the pathway. The fourth candidate was Yipf1, the only gene that was commonly up-regulated in both mutants. Yet, the artificial over-expression of this protein had no effects on phagocytosis, so this candidate is also not included in the signaling pathway. Furthermore, localizing the products of the candidate genes within the cell helped unveiling several cellular organelles that receive signals from the phagosome and transduce them towards the uptake machinery.

Characterization of Lipid Droplets and Functional Analysis of Lipid Droplet-Associated Proteins in Dictyostelium discoideum

Lipid droplets (LDs) are the universal storage form of fat as a reservoir of metabolic energy in animals, plants, bacteria and single celled eukaryotes. Dictyostelium LD formation was investigated in response to the addition of different nutrients to the growth medium. LDs were induced by adding exogenous cholesterol, palmitic acid (PA) as well as growth in bacterial suspension, while glucose addition fails to form LDs. Among these nutrients, PA addition is most effective to stimulate LD formation, and depletion of PA from the medium caused LD degradation. The neutral lipids incorporated into the LD-core are composed of triacylglycerol (TAG), steryl esters, and an unknown neutral lipid (UKL) species when the cells were loaded simultaneously with cholesterol and PA. In order to avoid the contamination with other cellular organelles, the LD-purification method was modified. The isolated LD fraction was analysed by mass spectrometry and 100 proteins were identified. Nineteen of these appear to be directly involved in lipid metabolism or function in regulating LD morphology. Together with a previous study, a total of 13 proteins from the LD-proteome were confirmed to localize to LDs after the induction with PA. Among the identified LD-proteins, the localization of Ldp (lipid droplet membrane protein), GPAT3 (glycerol-3-phosphate acyltransferase 3) and AGPAT3 (1-acylglycerol-3-phosphate-acyltransferase 3) were further verified by GFP-tagging at the N-termini or C-termini of the respective proteins. Fluorescence microscopy demonstrated that PA-treatment stimulated the translocation of the three proteins from the ER to LDs. In order to clarify DGAT (diacylglycerol acyltransferase) function in Dictyostelium, the localization of DGAT1, that is not present in LD-proteome, was also investigated. GFP-tagged DGAT1 localized to the ER both, in the presence and absence of PA, which is different from the previously observed localization of GFP-tagged DGAT2, which almost exclusively binds to LDs. The investigation of the cellular neutral lipid level helps to elucidate the mechanism responsible for LD-formation in Dictyostelium cells. Ldp and two short-chain dehydrogenases, ADH (alcohol dehydrogenase) and Ali (ADH-like protein), are not involved in neutral lipid biosynthesis. GPAT, AGPAT and DGAT are three transferases responsible for the three acylation steps of de novo TAG synthesis. Knock-out (KO) of AGPAT3 and DGAT2 did not affect storage-fat formation significantly, whereas cells lacking GPAT3 or DGAT1 decreased TAG and LD accumulation dramatically. Furthermore, DGAT1 is responsible for the accumulation of the unknown lipid UKL. Overexpression of DGAT2 can rescue the reduced TAG content of the DGAT1-KO mutant, but fails to restore UKL content in these cells, indicating that of DGAT1 and DGAT2 have overlapping functions in TAG synthesis, but the role in UKL formation is unique to DGAT1. Both GPAT3 and DGAT1 affect phagocytic activity. Mutation of GPAT3 increases it but a DGAT1-KO decreases phagocytosis. The double knockout of DGAT1 and 2 also impairs the ability to grow on a bacterial lawn, which again can be rescued by overexpression of DGAT2. These and other results are incorporated into a new model, which proposes that up-regulation of phagocytosis serves to replenish precursor molecules of membrane lipid synthesis, whereas phagocytosis is down-regulated when excess fatty acids are used for storage-fat formation.