Vergleichende Untersuchungen Methicillin-resistenter Staphylococcus aureus des Klinikums Kassel der Jahre 1999 bis 2004

Die vorliegende Arbeit liefert erstmals einen umfassenden Überblick über die molekulare Epidemiologie von Methicillin resistenten Staphylococcus aureus (MRSA) eines nordhessischen Krankenhauses inklusive seines Umfeldes und deren Entwicklung in einem Zeitraum von fünf Jahren. Von besonderer Bedeutung ist, dass die MRSA-Stämme hierfür nicht nur anhand ihrer SCCmec-Region (staphylococcal cassette chromosome) typisiert wurden, sondern eine weitergehende Charakterisierung auf Grund der Bestimmung des Vorkommens von Antibiotikaresistenz- und Toxingenen, sowie Plasmiden erfolgte. Dabei wurde ein neuer SCCmec-Typ entdeckt und charakterisiert und weitere noch unbekannte SCCmec-Elemente beschrieben. Bei der Charakterisierung der MRSA-Kollektive konnten bzgl. aller untersuchten Eigenschaften im Laufe der Zeit signifikante Veränderungen beobachtet werden. Am deutlichsten waren diese Unterschiede zwischen dem ältesten Kollektiv aus 1999 und allen nachfolgenden Kollektiven. Die Kollektive aus 2001, 2002, 2003 und 2004 zeigten untereinander größere Ähnlichkeiten, aber dennoch gleichzeitig eine tendenziell divergente Entwicklung einzelner Eigenschaften. Besonders auffallend war das dominante Auftreten von SCCmecIV mit 63-87% der Isolate eines Kollektivs ab 2001, gegenüber 16% in 1999. Weiterhin erfolgte eine markante Veränderung im Vorkommen einzelner Antibiotikaresistenzgene von 1999 bis 2004. So waren aacA-aphD und ermA bei MRSA aus 1999 mit 84% bzw. 90% deutlich häufiger als in allen Kollektiven der folgenden Jahre (aacA-aphD: max. 32%, ermA: max. 40%). Wohingegen ermC ein stets zunehmendes Vorkommen von 3% auf 67% über den Untersuchungszeitraum zeigte. Unkontinuierliches aber statistisch relevant vermehrtes Auftreten von tetM konnte bei Isolaten aus 1999 (40%) und 2004 (74%) nachgewiesen werden. Auch bei Toxingenen zeigten sich deutliche Unterschiede in der zeitlichen Verteilung. Ab 2001 zeigten alle Isolate wesentlich höhere Anteile an sec, seg und sei verglichen mit den MRSA aus 1999. So konnte sec im Kollektiv aus 1999 gar nicht nachgewiesen werden, in denen der Folgejahre mit 54-77%. Die Werte für seg und sei stiegen von 48% bzw. 41% in 1999 kontinuierlich auf über 90% in 2004. Die Häufigkeit von MRSA sowohl mit mehreren Resistenzgenen als auch die mit mehreren Toxingenen nahm im Laufe der Zeit zu und korrelierte mit dem Vorkommen von Plasmiden. Bezüglich seiner Korrelation mit den vorkommenden Plasmiden zeigte SCCmecIV im Erhebungszeitraum besonders deutlich eine Veränderung. So nahm über den Zeitraum der Beobachtung die Anzahl der Stämme die zusätzlich zu einem großen Plasmid ein weiteres kleines Plasmid besaßen signifikant zu. Auch beim Vergleich der SCCmec-Typen der MRSA-Isolate konnten Unterschiede bzgl. aller weiteren untersuchten Eigenschaften dargestellt werden. So zeigten z.B. alle SCCmecIIIA das sea-Gen, während dies bei allen anderen in der vorliegenden Arbeit untersuchten SCCmec-Typen nur vereinzelt vorkam. SCCmecII-Stämme wiesen sowohl die meisten Antibiotikaresistenz- als auch Toxingene auf. Es wurde ferner gezeigt, dass Stämme mit vielen Resistenzgenen auch eine hohe Anzahl Toxingene besaßen und dies im Zusammenhang mit einem erhöhten Plasmidgehalt stehen könnte. Aus den MRSA-Kollektiven isolierte Plasmide konnten aufgrund von Restriktionsanalysen als verwandt zu β-Laktamase-Plasmiden des Grundtyps pI524 und pI258 beschrieben werden. Der in vorliegender Arbeit gezeigte Zusammenhang zwischen der Anzahl von direct repeat units (dru) in der Hypervariablen Region (HVR) und dem SCCmec-Typ half den Unterschied zwischen SCCmecIV und SCCmecIVA, sowie die Sonderstellung des in vorliegender Arbeit erstmalig beschriebenen SCCmecIA/II darzustellen. Nicht alle Isolate konnten einem bekannten SCCmec-Typ zugeordnet werden, es handelt sich bei diesen Ausnahmen um weitere noch unbekannte und hier erstmalig beschriebene SCCmec-Typen. Aufgrund der vorliegenden Arbeit konnte ein neuer SCCmec-Typ definiert werden, namentlich der Typ SCCmecIA/II, der seit 1999 in der Region gehäuft vorkommt Die vorliegenden Untersuchungen zeigten somit, dass die Epidemiologie von MRSA der Region Nordhessen trotz bestehender Gemeinsamkeiten zur MRSA-Situation in ganz Deutschland auch Besonderheiten aufweist. Diese nun zu kennen kann einen Beitrag zur gezielten Verbesserung bisheriger Maßnahmen zur Ausbreitungskontrolle von MRSA in der nordhessischen Region leisten.

Studies on arbuscular mycorrhiza (AM) in the Alentejo (Portugal) using pea mutants resistant to AM fungi as a control tool for field conditions

The utilization and management of arbuscular mycorrhiza (AM) symbiosis may improve production and sustainability of the cropping system. For this purpose, native AM fungi (AMF) were sought and tested for their efficiency to increase plant growth by enhanced P uptake and by alleviation of drought stress. Pot experiments with safflower (Carthamus tinctorius) and pea (Pisum sativum) in five soils (mostly sandy loamy Luvisols) and field experiments with peas were carried out during three years at four different sites. Host plants were grown in heated soils inoculated with AMF or the respective heat sterilized inoculum. In the case of peas, mutants resistant to AMF colonization were used as non-mycorrhizal controls. The mycorrhizal impact on yields and its components, transpiration, and P and N uptake was studied in several experiments, partly under varying P and N levels and water supply. Screening of native AMF by most probable number bioassays was not very meaningful. Soil monoliths were placed in the open to simulate field conditions. Inoculation with a native AMF mix improved grain yield, shoot and leaf growth variables as compared to control. Exposed to drought, higher soil water depletion of mycorrhizal plants resulted in a haying-off effect. The growth response to this inoculum could not be significantly reproduced in a subsequent open air pot experiment at two levels of irrigation and P fertilization, however, safflower grew better at higher P and water supply by multiples. The water use efficiency concerning biomass was improved by the AMF inoculum in the two experiments. Transpiration rates were not significantly affected by AM but as a tendency were higher in non-mycorrhizal safflower. A fundamental methodological problem in mycorrhiza field research is providing an appropriate (negative) control for the experimental factor arbuscular mycorrhiza. Soil sterilization or fungicide treatment have undesirable side effects in field and greenhouse settings. Furthermore, artificial rooting, temperature and light conditions in pot experiments may interfere with the interpretation of mycorrhiza effects. Therefore, the myc- pea mutant P2 was tested as a non-mycorrhizal control in a bioassay to evaluate AMF under field conditions in comparison to the symbiotic isogenetic wild type of var. FRISSON as a new integrative approach. However, mutant P2 is also of nod- phenotype and therefore unable to fix N2. A 3-factorial experiment was carried out in a climate chamber at high NPK fertilization to examine the two isolines under non-symbiotic and symbiotic conditions. P2 achieved the same (or higher) biomass as wild type both under good and poor water supply. However, inoculation with the AMF Glomus manihot did not improve plant growth. Differences of grain and straw yields in field trials were large (up to 80 per cent) between those isogenetic pea lines mainly due to higher P uptake under P and water limited conditions. The lacking N2 fixation in mutants was compensated for by high mineral N supply as indicated by the high N status of the pea mutant plants. This finding was corroborated by the results of a major field experiment at three sites with two levels of N fertilization. The higher N rate did not affect grain or straw yields of the non-fixing mutants. Very efficient AMF were detected in a Ferric Luvisol on pasture land as revealed by yield levels of the evaluation crop and by functional vital staining of highly colonized roots. Generally, levels of grain yield were low, at between 40 and 980 kg ha-1. An additional pot trial was carried out to elucidate the strong mycorrhizal effect in the Ferric Luvisol. A triplication of the plant equivalent field P fertilization was necessary to compensate for the mycorrhizal benefit which was with five times higher grain yield very similar to that found in the field experiment. However, the yield differences between the two isolines were not always plausible as the evaluation variable because they were also found in (small) field test trials with apparently sufficient P and N supply and in a soil of almost no AMF potential. This similarly occurred for pea lines of var. SPARKLE and its non-fixing mycorrhizal (E135) and non-symbiotic (R25) isomutants, which were tested in order to exclude experimentally undesirable benefits by N2 fixation. In contrast to var. FRISSON, SPARKLE was not a suitable variety for Mediterranean field conditions. This raises suspicion putative genetic defects other than symbiotic ones may be effective under field conditions, which would conflict with the concept of an appropriate control. It was concluded that AMF resistant plants may help to overcome fundamental problems of present research on arbuscular mycorrhiza, but may create new ones.