Biologische Funktionsanalyse und Identifizierung neuer Substrate der Methyltransferase Dnmt2

Obwohl die DNA Methyltransferase 2 (Dnmt2) hoch konserviert ist und zu der am weitesten verbreiteten eukaryotischen MTase-Familie geh��rt, ist ihre biologische Funktion nach wie vor unklar. Nachdem lange Zeit keine DNA Methylierungsaktivit��t nachgewiesen werden konnte, wurde vor einigen Jahren ��ber geringe Mengen an 5-Methylcytosin (5mC) in Retroelementen der ���Dnmt2-only���-Organismen D. melanogaster, D. discoideum und E. histolytica berichtet (Kunert et al. 2003; Fisher et al. 2004; Kuhlmann et al. 2005; Phalke et al. 2009). Als kurze Zeit sp��ter robuste Methylierung der tRNAAsp durch humane Dnmt2 gezeigt wurde (Goll et al. 2006), wurde zun��chst eine Dualspezifit��t des Enzyms vorgeschlagen (Jeltsch et al. 2006). Neuere Daten zum 5mC-Status verschiedener ���Dnmt2-only���-Organismen bilden Anlass f��r kontroverse Diskussionen ��ber Ausma�� und Bedeutung der DNA Methyltransferaseaktivit��t von Dnmt2 (Schaefer et al. 2010a; Krauss et al. 2011). Die vorliegende Arbeit konzentriert sich auf die Identifizierung neuer RNA Substrate des Dnmt2-Homologs DnmA aus D. discoideum sowie die biologische Bedeutung der tRNA-Methylierung durch Dnmt2. Wie in anderen Organismen beschrieben, fungiert auch DnmA als tRNAAsp(GUC) MTase in vitro und in vivo. Zus��tzlich konnte in vitro tRNAGlu(UUC) als neues Substrat der Dnmt2-Homologe aus D. discoideum und dem Menschen identifiziert werden. In einem Kooperationsprojekt wurde au��erdem auch tRNAAsp-Methylierungsaktivit��t f��r das Dnmt2-Homolog aus S. pombe (Pmt1) nachgewiesen. Crosslink-RNA-Immunopr��zipitationen (RNA-CLIP) mit anschlie��ender Next-Generation-Sequenzierung der mit DnmA assoziierten RNAs zeigen, dass DnmA mit tRNA Fragmenten interagiert, die sich vom Anticodonloop bis in den T-loop erstrecken. Neben der tRNAAsp(GUC) und tRNAGlu(UUC/CUC) sind Fragmente der tRNAGly(GCC) verst��rkt angereichert. Inwiefern diese Fragmente eine biologische Funktion haben oder spezifische Degradationsprodukte darstellen, ist noch ungekl��rt. Interessanterweise sind von einigen tRNAs wenige Sequenzen von antisense-Fragmenten in den RNA-CLIP Daten zu finden, die etwas k��rzer, jedoch exakt komplement��r zu den genannten sense-Fragmenten sind. Besonders stark sind diese Fragmente der tRNAGlu(UUC) vertreten. In einem weiteren RNA-CLIP Experiment wurden U-snRNAs, snoRNA und intergenische Sequenzen mit DnmA angereichert. Bei nachfolgenden in vitro Methylierungsstudien konnte ausschlie��lich die U2-snRNA als potentielles Nicht-tRNA-Substrat der hDnmt2 und DnmA identifiziert werden. Da tRNA Modifikationen im Anticodonloop die Codonerkennung beeinflussen k��nnen, wurde ein System etabliert um die Translationseffizienz eines GFP-Reportergens in Wildtyp- und dnmAKO-Zellen zu messen. In D. discoideum wird das Aspartat-Codon GAU ca. zehnmal h��ufiger genutzt als das GAC Codon, allerdings ist nur eine tRNAAsp(GUC) im Genom der Am��be kodiert. Aus diesem Grund wurde zus��tzlich die Frage adressiert, inwiefern die DnmA-abh��ngige Methylierung dieser tRNA das ���Wobbling��� beeinflusst. Dazu wurde dem Reportergen jeweils eine (GAU)5- und (GAC)5-Leadersequenz vorgeschaltet. Entgegen der Annahme wurde der (GAC)5-Leader in beiden St��mmen etwas effizienter translatiert. Insgesamt zeigte der dnmAKO-Stamm eine leicht erh��hte Translationseffizienz der Reportergene. Vergleichende Analysen zur Aufnahme von Fremd-DNA zeigten signifikant reduzierte Transformationseffizienzen mit einem integrierenden Plasmid in dnmAKO-Zellen. Ein weiterer dnmAKO-Stamm zeigte diesen Effekt jedoch nicht, wobei bei derselben Mutante eine deutlich reduzierte Aufnahme eines extrachromosomalen Plasmids zu verzeichnen war. Untersuchungen zum Einfluss von DnmA auf die Regulation des Retroelements skipper ergaben keinen Zusammenhang zwischen der Generierung kleiner RNAs und der erh��hten Transkription des Retrotransposons in dnmAKO-Zellen (Kuhlmann et al. 2005). Durch Kompensationsversuche sowie Experimente mit einer weiteren dnmAKO-Mutante konnte die Mobilisierung des Retrotransposons nicht eindeutig als DnmA-Funktion eingeordnet werden. In einem weiteren Projekt wurden die Bindung des m5C-bindenden Proteins EhMLBP aus E. histolytica an DNA mittels Rasterkraftmikroskopie abgebildet (Lavi et al. 2006). Neben vermutlich unspezifischen Endbindungsereignissen konnte eine bevorzugte Bindungsstelle des Proteins an LINE DNA (long intersperesed nuclear element) identifiziert werden. M��glicherweise f��llt diese mit einem von zwei A/T-reichen Bereichen der LINE DNA zusammen, von denen vermutet wird, dass diese f��r die Bindung von EhMLBP an DNA von Bedeutung sind. Insgesamt best��tigen die Ergebnisse dieser Arbeit die tRNAAsp Methylierungsaktivit��t als konservierte Dnmt2-Funktion. Dar��ber hinaus erweitern sie das Substratspektrum der Dnmt2-Methyltransferasen im Bereich der tRNA. Au��erdem wird erstmals ein potentielles Nicht-tRNA Substrat vorgeschlagen. Zus��tzlich geben neu entdeckte Ph��notypen Hinweise auf vielf��ltige zellul��re Dnmt2-Funktionen.