The role of Ken&Barbie in JAK/STAT signalling during development of Drosophila melanogaster

Cell-cell interactions during embryonic development are crucial in the co-ordination of growth, differentiation and maintenance of many different cell types. To achieve this co-ordination each cell must properly translate signals received from neighbouring cells, into spatially and temporally appropriate developmental responses. A surprisingly limited number of signal pathways are responsible for the differentiation of enormous variety of cell types. As a result, pathways are frequently 'reused' during development. Thus, in mammals the JAK/STAT pathway is required during early embryogenesis, mammary gland formation, hematopoiesis and, finally, plays a pivotal role in immune response. In the canonical way, the JAK/STAT pathway is represented by a transmembrane receptor associated with a Janus kinase (JAK), which upon stimulation by an extra-cellular ligand, phosphorylates itself, the receptor and, finally, the signal transducer and activator of transcription (STAT) molecules. Phosphorylated STATs dimerise and translocate to the nucleus where they activate transcription of target genes. The JAK/STAT pathway has been conserved throughout evolution, and all known components are present in the genome of Drosophila melanogaster. Besides hematopoietic and immunity functions, the pathway is also required during development for processes including embryonic segmentation, tracheal morphogenesis, posterior spiracle formation etc. This study describes Drosophila Ken&Barbie (Ken) as a selective regulator of JAK/STAT signalling. ken mutations identified in a screen for modulators of an eye overgrowth phenotype, caused by over-expression of the pathway ligand unpaired, also interact genetically with the pathway receptor domeless (dome) and the transcription factor stat92E. Over-expression of Ken can phenocopy developmental defects known to be caused by the loss of JAK/STAT signalling. These genetic interactions suggest that Ken may function as a negative regulator of the pathway. Ken has C-terminal Zn-finger domain, presumably for DNA binding, and N-terminal BTB/POZ domain, often found in transcriptional repressors. Using EGFP-fused construct expressed in vivo revealed nuclear accumulation of Ken. Therefore, it is proposed that Ken may act as a suppresser of STAT92E target genes. An in vitro assay, termed SELEX, determined that Ken specifically binds to a DNA sequence, with the essential for DNA recognition core overlapping that of STAT92E. This interesting observation suggests that not all STAT92E sites may also allow Ken binding. Strikingly, when effects of ectopic Ken on the expression of putative JAK/STAT pathway target genes were examined, only a subset of the genes tested, namely vvl, trh and kni, were down-regulated by Ken, whereas some others, such as eve and fj, appeared to be unresponsive. Further analysis of vvl, one of the genes susceptible to ectopic Ken, was undertaken. In the developing hindgut, expression of vvl is JAK/STAT pathway dependent, but remains repressed in the posterior spiracles, despite the stimulation of STAT92E by Upd in their primordia. Importantly, ken is also expressed in the developing posterior spiracles. Strikingly, up-regulation of vvl is observed in these tissues in ken mutant embryos. These imply that while ectopic Ken is sufficient to repress the expression of vvl in the hindgut, endogenous Ken is also necessary to prevent its activation in the posterior spiracles. It is therefore conceivable that ectopic vvl expression in the posterior spiracles of the ken mutants may be the result of de-repression of endogenous STAT92E activity. Another consequence of these observations is a fine balance that must exist between STAT92E and Ken activities. Apparently, endogenous level of Ken is sufficient to repress vvl, but not other, as yet unidentified, JAK/STAT pathway targets, whose presumable activation by STAT92E is required for posterior spiracle development as the embryos mutant for dome, the receptor of the pathway, show severe spiracle defects. These defects are also observed in the embryos mis-expressing Ken. Though it is possible that the posterior spiracle phenotype caused by higher levels of Ken results from a JAK/STAT pathway independent activity, it seems to be more likely that Ken acts in a dosage dependent manner, and extra Ken is able to further antagonise JAK/STAT pathway target genes. While STAT92E binding sites required for target gene expression have been poorly characterised, the existence of genome data allows the prediction of candidate STAT92E sites present in target genes promoters to be attempted. When a 6kb region containing the putative regulatory domains flanking the vvl locus are examined, only a single potential STAT92E binding site located 825bp upstream of the translational start can be detected. Strikingly, this site also includes a perfect Ken binding sequence. Such an in silico observation, though consistent with both Ken DNA binding assay in vitro and regulation of STAT92E target genes in vivo, however, requires further analysis. The JAK/STAT pathway is implicated in a variety of processes during embryonic and larval development as well as in imago. In each case, stimulation of the same transcription factor results in different developmental outcomes. While many potential mechanisms have been proposed and demonstrated to explain such pleiotropy, the present study indicates that Ken may represent another mechanism, with which signal transduction pathways are controlled. Ken selectively down-regulates a subset of potential target genes and so modifies the transcriptional profile generated by activated STAT92E - a mechanism, which may be partially responsible for differences in the morphogenetic processes elicited by JAK/STAT signalling during development.

Characterization of the role of Drosophila JAK/STAT signalling in cellular proliferation

Der Janus Kinase / signal transducer and activator of transcription (JAK/STAT) Signal- transduktionsweg wird für viele Entwicklungsvorgänge benötigt und spielt eine zentrale Rolle bei der Hämatopoese und bei der Immunantwort. Obwohl der JAK/STAT-Signalweg in den vergangenen Jahren Gegenstand intensiver Forschung war, erschwert die Redundanz des Signalwegs bei Wirbeltieren genetische Untersuchungen zur Identifizierung derjenigen Mechanismen, die den JAK/STAT-Signalweg regulieren. Der JAK/STAT-Signaltransduktionsweg ist evolutionär konserviert und ebenfalls bei der Taufliege Drosophila melanogaster vorhanden. Im Gegensatz zu Wirbeltieren ist der Signaltransduktionsweg von Drosophila weniger redundant und beinhaltet folgende Hauptkomponenten: den Liganden Unpaired (Upd), den Transmembranrezeptor Domeless (Dome), die einzige JAK-Tyrosinkinase Hopscotch (hop), sowie den Transkriptionsfaktor STAT92E. In der vorliegenden Arbeit wird die Rolle des JAK/STAT-Signalwegs bei der zellulären Proliferation mithilfe der Modellsysteme der Flügel- und der Augen-Imaginalscheiben von Drosophila charakterisiert. "Loss-of-function"- und "Gain-of-function"-Experimente zur Verminderung beziehungs-weise Erhöhung der Signalaktivität zeigten, dass der JAK/STAT-Signalweg eine Rolle bei der zellulären Proliferation der Flügel-Imaginalscheiben spielte, ohne die Zellgröße oder Apoptose zu verändern. Bei der Flügelentwicklung während des zweiten und des frühen dritten Larvalstadiums war die Aktivität des JAK/STAT-Signalwegs sowohl notwendig für die zelluläre Proliferation als auch hinreichend, um Überproliferation anzutreiben. Allerdings änderte sich während der späten dritten Larvalstadien die JAK/STAT-Signalaktivität, sodass endogene STAT92E-Mengen einen anti-proliferativen Effekt im gleichen Gewebe aufwiesen. Weiterhin reichte die ektopische Aktivierung des JAK/STAT-Signalwegs zu diesem späten Entwicklungszeitpunkt aus, um die Mitose zu inhibieren und die Zellen in der Phase G2 des Zellzyklus zu arretieren. Diese Ergebnisse legen den Schluss nahe, dass der JAK/STAT-Signalweg sowohl pro-proliferativ in frühen Flügelscheiben als auch anti-proliferativ zu späten Stadien der Flügelscheiben-Entwicklung wirken kann. Dieser späte anti-proliferative Effekt wurde durch einen nicht-kanonischen Mechanismus der STAT92E-Aktivierung vermittelt, da späte hop defiziente Zellverbände im Vergleich zu Wildtyp-Zellen keine Veränderungen im Ausmaß der zellulären Proliferation aufwiesen. Ferner konnte gezeigt werden, dass eine während der Larvalstadien exprimierte dominant-negative und im N-Terminus deletierte Form von STAT92E (?NSTAT92E) nicht für den anti-proliferativen Effekt verantwortlich ist. Diese Tatsache ist ein weiteres Indiz dafür, dass das vollständige STAT92E den späten anti-proliferativen Effekt verursacht. Um Modulatoren für die von JAK/STAT vermittelte zelluläre Proliferation zu identifieren, wurde ein P-Element-basierter genetischer Interaktions-Screen in einem sensibilisierten genetischen Hintergrund durchgeführt. Insgesamt wurden dazu 2267 unabhängige P-Element-Insertionen auf ihre Wechselwirkung mit der JAK/STAT-Signalaktivität untersucht und 24 interagierende Loci identifiziert. Diese Kandidaten können in folgende Gruppen eingeordnet werden: Zellzyklusproteine, Transkriptionsfaktoren, DNA und RNA bindende Proteine, ein Mikro-RNA-Gen, Komponenten anderer Signaltransduktionswege und Zelladhäsionsproteine. In den meisten Fällen wurden mehrere Allele der interagierenden Kandidatengene getestet. 18 Kandidatengene mit übereinstimmend interagierenden Allelen wurden dann zur weiteren Analyse ausgewählt. Von diesen 18 Kandidaten-Loci wurden 7 mögliche JAK/STAT-Signalwegskomponenten und 6 neue Zielgene des Signalwegs gefunden. Zusammenfassend wurde das Verständnis um STAT92E verbessert. Dieses Protein hat die gleiche Funktion wie das STAT3-Protein der Wirbeltiere und treibt die zelluläre Proliferation voran. Analog zu STAT1 hat STAT92E aber auch einen anti-proliferativen Effekt. Ferner wurden 24 mögliche Modulatoren der JAK/STAT-Signalaktivität identifiziert. Die Charakterisierung dieser Wechselwirkungen eröffnet vielversprechende Wege zu dem Verständnis, wie JAK/STAT die zelluläre Proliferation reguliert und könnte bei der Entwicklung von neuartigen therapeutischen Targets zur Behandlung von Krebskrankheiten und Entwicklungsstörungen beitragen.

Entwicklung und Validierung der Steigbildmethode zur Differenzierung von ausgewählten Lebensmitteln aus verschiedenen Anbausystemen und Verarbeitungsprozessen

Zusammenfassung (deutsch) Seit den 1980iger Jahren wächst die Bedeutung der sog. Bildschaffenden Methoden für die Bestimmung der Qualität ökologischer Produkte. Zu diesen Methoden gehört die Biokristallisation, Steigbild und Rundfilter-Chromatographie. Die Ergebnisse dieser Methoden sind Bilder, die anhand definierter Kriterien ausgewertet werden. Bei der Biokristallisation sind es mehr oder weniger geordnete Kristallisationen auf einer Glasplatte, bei dem Steigbild zweidimensionale Strukturen auf Chromatographiepapier. In der Vergangenheit wurden die Bilder von Spezialisten ausgewertet, die nach einer längeren Schulung produktspezifische Kriterien entwickelt hatten. Im Gegensatz zur Dünnschicht-Chromatographie, wo der einzelne Stoff von der Matrix separiert wird, ist das Ziel beim Steigbild, Strukturen der möglichst ganzen Probe zu erzeugen. Die Methode wurde von Kolisko in den 1929iger Jahren entwickelt, wobei eine Kombination aus Chromatographieprozess und Metallkomplexreaktionen genutzt wurde. Die Firma WALA entwickelte die Methode für die Kontrolle ihrer Produkte und setze Silbernitrat und Eisensulfat ein. Bisher wurde die Methode qualitativ beschreibend ausgewertet, wobei einzelne Bildelemente und deren Interaktion beschrieben wurden. Deshalb musste für die vorliegende Arbeit Auswertungsmethoden entwickelt werden, mit denen auch eine statistische Bearbeitung der Ergebnisse möglich ist (nominale Unterscheidung von proben anhand der Bilder). Die Methode wurde bisher in einer Reihe von Studien eingesetzt (u.a. die Unterscheidung von Produktionsweisen). Obwohl die Bilder nur qualitativ ausgewertet wurden, konnten geschulte Prüfpersonen Proben aus verschiedenen Anbausystemen anhand der Bilder trennen. Die Ergebnisse wurden aber nicht so dokumentiert, dass sie den Erfordernissen internationaler Standardnormen für Laboratorien genügten. Deshalb mussten für diese Arbeit zunächst die Prozeduren dokumentiert und eine systematische Untersuchung zu den Einflussgrößen durchgeführt werden. Dazu wurde die visuelle Bildauswertung entwickelt und standardisiert. Die visuelle Bildauswertung basiert auf morphologischen Kriterien der Bilder von den untersuchten Weizen- und Möhrenproben. Ein Panel aus geschulten Personen entwickelte dann die Kriterien und legte sie anhand von Referenzbildern fest. Die Bilder der vorliegenden Arbeit wurden mit der einfach beschreibenden Prüfung ausgewertet, wie sie aus der sensorischen Prüfung von Lebensmitteln übernommen werden konnte. Mit geschulten und ungeschulten Prüfpersonen wurden Weizenproben und verschiedene Möhrensäfte mit der sog. Dreiecksprüfung ausgewertet (von ISO 4120). Alle Laborprozeduren wurden dokumentiert. Mit der Anwendung dieser Prozeduren wurden Vergleichsversuche mit Laboren in Dänemark und Holland (BRAD, LBI) durchgeführt. Die Ergebnisse waren sowohl für Weizen- als auch für Möhrenproben vergleichbar, wobei alle drei Labore zwischen jeweils zwei Proben unterscheiden konnten. Die systematische Untersuchung zu den Einflussgrößen zeigte, dass das Unterscheidungsvermögen der Methode vor allem von den klimatischen Bedingungen während der Steigphasen beeinflusst wird. Auch die Präkonditionierung der Papiere hat einen großen Einfluss, während die Wasserqualität (ultra-filtriert, de-ionisiert, destilliert) eine untergeordnete Bedeutung hat. Für Weizen- und Möhrenproben wurde sowohl die Wiederholbarkeit als auch die Reproduzierbarkeit getestet. Die Unterschiede in den Bildern der verschiedenen Proben waren dabei immer größer als die Variation durch Proben- und Bildwiederholung und das Labor. Die so charakterisierte Methode wurde auf kodierte Proben von definierten Feldversuchen und auf Marktproben (Paarvergleich von Anbausystemen ökologisch und konventionell) angewandt, wobei als Ergebnis mehr als 90% der Proben mit der einfach beschreibenden Prüfung anhand der Bilder unterschieden werden konnten. Die Auswertung mit der Dreiecksprüfung zeigte, dass sowohl Sorten und Verarbeitungsschritte (Saft) als auch Anbauweisen signifikant getrennt wurden. Darüber hinaus wurde die Methode auch erfolgreich auf Apfelproben angewandt. Weitere Untersuchungen müssen zeigen, ob sich das Potential der Methode, verschiedene Fragen wie die Authentizitätsprüfung von Lebensmitteln verifizieren lassen.