HelF, a suppressor of RNAi mediated gene silencing in Dictyostelium discoideum

RNA interference (RNAi) is a recently discovered process, in which double stranded RNA (dsRNA) triggers the homology-dependant degradation of cognate messenger RNA (mRNA). In a search for new components of the RNAi machinery in Dictyostelium, a new gene was identified, which was called helF. HelF is a putative RNA helicase, which shows a high homology to the helicase domain of Dicer, to the helicase domain of Dictyostelium RdRP and to the C. elegans gene drh-1, that codes for a dicer related DExH-box RNA helicase, which is required for RNAi. The aim of the present Ph.D. work was to investigate the role of HelF in PTGS, either induced by RNAi or asRNA. A genomic disruption of the helF gene was performed, which resulted in a distinct mutant morphology in late development. The cellular localization of the protein was elucidated by creating a HelF-GFP fusion protein, which was found to be localized in speckles in the nucleus. The involvement of HelF in the RNAi mechanism was studied. For this purpose, RNAi was induced by transformation of RNAi hairpin constructs against four endogenous genes in wild type and HelF- cells. The silencing efficiency was strongly enhanced in the HelF K.O. strain in comparison with the wild type. One gene, which could not be silenced in the wild type background, was successfully silenced in HelF-. When the helF gene was disrupted in a secondary transformation in a non-silenced strain, the silencing efficiency was strongly improved, a phenomenon named here “retrosilencing”. Transcriptional run-on experiments revealed that the enhanced gene silencing in HelF- was a posttranscriptional event, and that the silencing efficiency depended on the transcription levels of hairpin RNAs. In HelF-, the threshold level of hairpin transcription required for efficient silencing was dramatically lowered. The RNAi-mediated silencing was accompanied by the production of siRNAs; however, their amount did not depend on the level of hairpin transcription. These results indicated that HelF is a natural suppressor of RNAi in Dictyostelium. In contrast, asRNA mediated gene silencing was not enhanced in the HelF K.O, as shown for three tested genes. These results confirmed previous observations (H. Martens and W. Nellen, unpublished) that although similar, RNAi and asRNA mediated gene silencing mechanisms differ in their requirements for specific proteins. In order to characterize the function of the HelF protein on a molecular level and to study its interactions with other RNAi components, in vitro experiments were performed. Besides the DEAH-helicase domain, HelF contains a double-stranded RNA binding domain (dsRBD) at its N-terminus, which showed high similarity to the dsRBD domain of Dicer A from Dictyostelium. The ability of the recombinant dsRBDs from HelF and Dicer A to bind dsRNA was examined and compared. It was shown by gel-shift assays that both HelF-dsRBD and Dicer-dsRBD could bind directly to long dsRNAs. However, HelF-dsRBD bound more efficiently to dsRNA with imperfect matches than to perfect dsRNA. Both dsRBDs bound specifically to a pre-miRNA substrate (pre-let-7). The results suggested that most probably there were two binding sites for the proteins on the pre-miRNA substrate. Moreover, it was shown that HelF-dsRBD and Dicer-dsRBD have siRNA-binding activity. The affinities of the two dsRBDs to the pre-let-7 substrate were also examined by plasmon surface resonance analyses, which revealed a 9-fold higher binding affinity of the Dicer-dsRBD to pre-let-7 compared to that of the HelF-dsRBD. The binding of HelF-dsRBD to the pre-let-7 was impaired in the presence of Mg2+, while the Dicer-dsRBD interaction with pre-let-7 was not influenced by the presence of Mg2+. The results obtained in this thesis can be used to postulate a model for HelF function. In this, HelF acts as a nuclear suppressor of RNAi in wild type cells by recognition and binding of dsRNA substrates. The protein might act as a surveillance system to avoid RNAi initiation by fortuitous dsRNA formation or low abundance of dsRNA trigger. If the protein acts as an RNA helicase, it could unwind fold-back structures in the nucleus and thus lead to decreased RNAi efficiency. A knock-out of HelF would result in initiation of the RNAi pathway even by low levels of dsRNA. The exact molecular function of the protein in the RNAi mechanism still has to be elucidated. RNA interferenz (RNAi) ist ein in jüngster Zeit entdeckter Mechanismus, bei dem doppelsträngige RNA Moleküle (dsRNA) eine Homologie-abhängige Degradation einer verwandten messenger-RNA (mRNA) auslösen. Auf der Suche nach neuen Komponenten der RNAi-Maschinerie in Dictyostelium konnte ein neues Gen (helF) identifiziert werden. HelF ist eine putative RNA-Helikase mit einer hohen Homologie zur Helikasedomäne der bekannten Dicerproteine, der Helikasedomäne der Dictyostelium RdRP und zu dem C. elegans Gen drh-1, welches für eine Dicer-bezogene DExH-box RNA Helikase codiert, die am RNAi-Mechanismus beteiligt ist. Das Ziel dieser Arbeit war es, die Funktion von HelF im Zusammenhang des RNAi oder asRNA induzierten PTGS zu untersuchen. Es wurde eine Unterbrechung des helF-Gens auf genomischer Ebene (K.O.) vorgenommen, was bei den Mutanten zu einer veränderten Morphologie in der späten Entwicklung führte. Die Lokalisation des Proteins in der Zelle konnte mit Hilfe einer GFP-Fusion analysiert werden und kleinen Bereichen innerhalb des Nukleus zugewiesen werden. Im Weiteren wurde der Einfluss von HelF auf den RNAi-Mechanismus untersucht. Zu diesem Zweck wurde RNAi durch Einbringen von RNAi Hairpin-Konstrukten gegen vier endogene Gene im Wiltypstamm und der HelF--Mutante induziert. Im Vergleich zum Wildtypstamm konnte im HelF--Mutantenstamm eine stark erhöhte „Silencing“-Effizienz nachgewiesen werden. Ein Gen, welches nach RNAi Initiation im Wildtypstamm unverändert blieb, konnte im HelF--Mutantenstamm erfolgreich stillgelegt werden. Durch sekundäres Einführen einer Gendisruption im helF-Locus in einen Stamm, in welchem ein Gen nicht stillgelegt werden konnte, wurde die Effizienz des Stilllegens deutlich erhöht. Dieses Phänomen wurde hier erstmals als „Retrosilencing“ beschrieben. Mit Hilfe von transkriptionellen run-on Experimenten konnte belegt werden, dass es sich bei dieser erhöhten Stilllegungseffizienz um ein posttranskriptionelles Ereignis handelte, wobei die Stillegungseffizienz von der Transkriptionsstärke der Hairpin RNAs abhängt. Für die HelF--Mutanten konnte gezeigt werden, dass der Schwellenwert zum Auslösen eines effizienten Stillegens dramatisch abgesenkt war. Obwohl die RNAi-vermittelte Genstilllegung immer mit der Produktion von siRNAs einhergeht, war die Menge der siRNAs nicht abhängig von dem Expressionsniveau des Hairpin-Konstruktes. Diese Ergebnisse legen nahe, dass es sich bei der HelF um einen natürlichen Suppressor des RNAi-Mechanismus in Dictyostelium handelt. Im Gegensatz hierzu war die as-vermittelte Stilllegung von drei untersuchten Genen im HelF-K.O. im Vergleich zum Wildyp unverändert. Diese Ergebnisse bestätigten frühere Beobachtungen (H. Martens und W. Nellen, unveröffentlicht), wonach die Mechanismen für RNAi und asRNA-vermittelte Genstilllegung unterschiedliche spezifische Proteine benötigen. Um die Funktion des HelF-Proteins auf der molekularen Ebene genauer zu charakterisieren und die Interaktion mit anderen RNAi-Komponenten zu untersuchen, wurden in vitro Versuche durchgeführt. Das HelF-Protein enthält, neben der DEAH-Helikase-Domäne eine N-terminale Doppelstrang RNA bindende Domäne (dsRBD) mit einer hohen Ähnlichkeit zu der dsRBD des Dicer A aus Dictyostelium. Die dsRNA-Bindungsaktivität der beiden dsRBDs aus HelF und Dicer A wurde analysiert und verglichen. Es konnte mithilfe von Gel-Retardationsanalysen gezeigt werden, dass sowohl HelF-dsRBD als auch Dicer-dsRBD direkt an lange dsRNAs binden können. Hierbei zeigte sich, dass die HelF-dsRBD eine höhere Affinität zu einem imperfekten RNA-Doppelstrang besitzt, als zu einer perfekt gepaarten dsRNA. Für beide dsRBDs konnte eine spezifische Bindung an ein pre-miRNA Substrat nachgewiesen werden (pre-let-7). Dieses Ergebnis legt nah, dass es zwei Bindestellen für die Proteine auf dem pre-miRNA Substrat gibt. Überdies hinaus konnte gezeigt werden, dass die dsRBDs beider Proteine eine siRNA bindende Aktivität besitzen. Die Affinität beider dsRBDs an das pre-let-7 Substrat wurde weiterhin mit Hilfe der Plasmon Oberflächen Resonanz untersucht. Hierbei konnte eine 9-fach höhere Bindeaffinität der Dicer-dsRBD im Vergleich zur HelF-dsRBD nachgewiesen werden. Während die Bindung der HelF-dsRBD an das pre-let-7 durch die Anwesenheit von Mg2+ beeinträchtigt war, zeigte sich kein Einfluß von Mg2+ auf das Bindeverhalten der Dicer-dsRBD. Mit Hilfe der in dieser Arbeit gewonnen Ergebnisse lässt sich ein Model für die Funktion von HelF postulieren. In diesem Model wirkt HelF durch Erkennen und Binden von dsRNA Substraten als Suppressor von der RNAi im Kern. Das Protein kann als Überwachungsystem gegen eine irrtümliche Auslösung von RNAi wirken, die durch zufällige dsRNA Faltungen oder eine zu geringe Häufigkeit der siRNAs hervorgerufen sein könnte. Falls das Protein eine Helikase-Aktivität besitzt, könnte es rückgefaltete RNA Strukturen im Kern auflösen, was sich in einer verringerten RNAi-Effizienz wiederspiegelt. Durch Ausschalten des helF-Gens würde nach diesem Modell eine erfolgreiche Auslösung von RNAi schon bei sehr geringer Mengen an dsRNA möglich werden. Das Modell erlaubt, die exakte molekulare Funktion des HelF-Proteins im RNAi-Mechanismus weiter zu untersuchen.

Artificial micro RNA system in Dictyostelium discoideum

Dictyostelium discoideum is a social amoeba that serves as a model system for RNA interference and related mechanisms. Its position between plants and animals enables evolutionary snapshot of mechanisms and protein machinery involved in investigated subjects. MiRNAs are small regulatory RNAs that are evolutionary conserved and present in animals, plants, viruses and some prokaryotes. They have roles in development, cell growth and differentiation, apoptosis and their miss-regulation is associated with many diseases such as cancer, neurodegenerative disorders and diabetes. Recently, through sequencing of DNA libraries miRNAs have been discovered in D. discoideum. In this work, it has been shown that heterologues miRNA let-7 can be expressed and processed in D. discoideum. Expression of let-7 miRNA in social amoeba resulted in a strong developmental phenotype suggesting an overload of the processing/silencing system or/and endogenous targets. The various effects on prel-7 strain have been observed and characterized, serving as a background for postulation of miRNA roles. An artificial miRNA system has been established and imposed to D. discoideum, showing that miRNAs in Dictyostelium could mediate gene expression on the level of mRNA stability and on the posttranscriptional level. Furthermore, presence of translational inhibition as a type of gene control was shown for the first time in this organism. Due to it new structures representing co-localities of miRNA and target mRNA have been detected. Taken together, this work shows functional artificial miRNA system and postulates roles of endogenous small RNA in social amoeba.

HelF und sein Interaktionspartner Xrn1: zwei Regulatoren der RNA-Interferenz in D. discoideum

Hauptziel dieser Arbeit ist die Identifizierung, Verifizierung und Charakterisierung von Interaktionspartnern von HelF, einem Negativregulator der RNA-Interferenz in Dictyostelium discoideum (Popova et al. 2006). Es ist gelungen, die Interaktion von HelF und der 5‘ 3‘ Exonuklease Xrn1 nachzu-weisen, aber alle anderen Versuchen, bisher unbekannte Protein-Interaktionspartner zu identifizieren, schlugen fehl. Xrn1 ist in den Organismen D. melanogaster (Orban und Izaurralde 2005), C. elegans (Newbury und Woollard 2004) und A. thaliana (Gazzani et al. 2004) bereits als Regulator der RNA-Interferenz bekannt. Mit Aufreinigungen nach der TAP-Methode und mit dem Nanotrap wurde ebenfalls versucht, RNA-Interaktionspartner von HelF zu identifizieren. Es konnten in einigen Aufreinigungen putative, für HelF spezifische RNAs identifiziert werden, doch entweder es handelte sich nachweislich nicht um RNA oder die Reproduktion der Daten schlug trotz mehrfacher Versuche fehl. Bezüglich der zellulären Lokalisation von HelF und Xrn1 konnte gezeigt werden, dass HelF zusätzlich zur bekannten Lokalisation in Foci im Nukleus (Popova et al. 2006) vermutlich auch im Cytoplasma und dort angeordnet in mehreren Granula zu finden ist. Xrn1 ist nahezu ausschließlich im Cytoplasma lokalisiert, wo es in mehreren Foci organisiert ist. Es wird vermutet, dass es sich bei diesen Foci um Processing-Bodies (P-Bodies) handelt und dass möglicherweise Xrn1 und HelF in eben diesen P-Bodies co-lokalisieren. In der Entwicklung vom Einzeller zum mehrzelligen Organismus zeigen die Xrn1KO- und die HelFKO-Mutante jeweils einen eindeutigen Phänotyp, der vom Wildtyp abweicht. Die Phänotypen der beiden Mutanten unterscheiden sich deutlich voneinander. Beim Mischen von HelF-Knockout-Zellen mit grün fluoreszierenden Wildtyp-Zellen zeigt sich, dass beide Stämme innerhalb des sich entwickelnden Organismus an definierten Stellen lokalisieren. Entgegen den Erwartungen befinden sich die Zellen der Mutante in den Stadien „Finger“ und „Slug“ nicht hauptsächlich im vorderen Teil des Organismus, sondern sind auch im hinteren Teil, der später die Sporenmasse bildet, vertreten. Dies lässt vermuten, dass HelF-Knockout-Mutanten in gleichem Maße wie Wildtypzellen als Sporen in die nächste Generation übergehen. Weitere Mix-Experimente, in denen HelFKO-Zellen und Xrn1KO-Zellen mit grün fluoreszierenden Wildtypzellen gemischt wurden, belegen eindeutig, dass beide Knockoutmutanten in Konkurrenz zum Wildtyp bei der Generierung von Sporen und somit beim Übergang in die nächste Generation benachteiligt sind. Dies steht im Gegensatz zu den Ergebnissen der vorher beschriebenen Mix-Experimente, in denen der Organismus als Ganzes betrachtet wurde. Weiterhin konnte herausgefunden werden, dass Xrn1 ebenso wie HelF (Popova et al. 2006) eine Rolle als Negativregulator in der RNA-Interferenz innehat. Fraglich ist aber, ob HelF wie bisher angenommen auch Einfluss auf den Weg der Generierung von miRNAs nimmt, da in HelFKO für keinen der beiden miRNA-Kandidaten eine Hoch- bzw. Runterregulierung der reifen miRNAs im Vergleich zum Wildtyp beobachtet werden kann. Im Xrn1KO hingegen ist die reife miRNA ddi-mir-1176 im Vergleich zum Wildtyp hochreguliert. In Bezug auf die Generierung von siRNAs konnte herausgefunden werden, dass Xrn1 und HelF im Fall der Generierung von Skipper siRNAs regulierend eingreifen, dass aber nicht alle siRNAs von der negativen Regulierung durch HelF und Xrn1betroffen sind, was am Beispiel der DIRS-1-siRNAs belegt werden kann. Das von B. Popova entwickelte Modell (Popova 2005) bezüglich der Rolle von HelF in der RNA-Interferenz wurde basierend auf den neu gewonnenen Daten weiterentwickelt und um Xrn1 ergänzt, um die Funktionen von HelF und Xrn1 als Antagonisten der RNA-Interferenz näher zu beleuchten. Literatur: Gazzani, S., T. Lawrenson, et al. (2004). "A link between mRNA turnover and RNA interference in Arabidopsis." Science 306(5698): 1046-8. Newbury, S. and A. Woollard (2004). "The 5'-3' exoribonuclease xrn-1 is essential for ventral epithelial enclosure during C. elegans embryogenesis." Rna 10(1): 59-65. Orban, T. I. and E. Izaurralde (2005). "Decay of mRNAs targeted by RISC requires XRN1, the Ski complex, and the exosome." Rna 11(4): 459-69. Popova, B. (2005). HelF, a suppressor of RNAi mediated gene silencing in Dictyostelium discoideum. Genetik. Kassel, Universität Kassel. PhD: 200. Popova, B., M. Kuhlmann, et al. (2006). "HelF, a putative RNA helicase acts as a nuclear suppressor of RNAi but not antisense mediated gene silencing." Nucleic Acids Res 34(3): 773-84.

Studies of cap-independent mRNA translation in Drosophila melanogaster

Control of protein synthesis is a key step in the regulation of gene expression during apoptosis and the heat shock response. Under such conditions, cap-dependent translation is impaired and Internal Ribosome Entry Site (IRES)-dependent translation plays a major role in mammalian cells. Although the role of IRES-dependent translation during apoptosis has been mainly studied in mammals, its role in the translation of Drosophila apoptotic genes has not been yet studied. The observation that the Drosophila mutant embryos for the cap-binding protein, the eukaryotic initiation factor eIF4E, exhibits increased apoptosis in correlation with up-regulated proapoptotic gene reaper (rpr) transcription constitutes the first evidence for the existence of a cap-independent mechanism for the translation of Drosophila proapoptotic genes. The mechanism of translation of rpr and other proapoptotic genes was investigated in this work. We found that the 5 UTR of rpr mRNA drives translation in an IRES-dependent manner. It promotes the translation of reporter RNAs in vitro either in the absence of cap, in the presence of cap competitors, or in extracts derived from heat shocked and eIF4E mutant embryos and in vivo in cells transfected with reporters bearing a non functional cap structure, indicating that cap recognition is not required in rpr mRNA for translation. We also show that rpr mRNA 5 UTR exhibits a high degree of similarity with that of Drosophila heat shock protein 70 mRNA (hsp70), an antagonist of apoptosis, and that both are able to conduct IRES-mediated translation. The proapoptotic genes head involution defective (hid) and grim, but not sickle, also display IRES activity. Studies of mRNA association to polysomes in embryos indicate that both rpr, hsp70, hid and grim endogenous mRNAs are recruited to polysomes in embryos in which apoptosis or thermal stress was induced. We conclude that hsp70 and, on the other hand, rpr, hid and grim which are antagonizing factors during apoptosis, use a similar mechanism for protein synthesis. The outcome for the cell would thus depend on which protein is translated under a given stress condition. Factors involved in the differential translation driven by these IRES could play an important role. For this purpose, we undertook the identification of the ribonucleoprotein (RNP) complexes assembled onto the 5 UTR of rpr mRNA. We established a tobramycin-affinity-selection protocol that allows the purification of specific RNP that can be further analyzed by mass spectrometry. Several RNA binding proteins were identified as part of the rpr 5 UTR RNP complex, some of which have been related to IRES activity. The involvement of one of them, the La antigen, in the translation of rpr mRNA, was established by RNA-crosslinking experiments using recombinant protein and rpr 5 UTR and by the analysis of the translation efficiency of reporter mRNAs in Drosophila cells after knock down of the endogenous La by RNAi experiments. Several uncharacterized proteins were also identified, suggesting that they might play a role during translation, during the assembly of the translational machinery or in the priming of the mRNA before ribosome recognition. Our data provide evidence for the involvement of La antigen in the translation of rpr mRNA and set a protocol for purification of tagged-RNA-protein complexes from cytoplasmic extracts. To further understand the mechanisms of translation initiation in Drosophila, we analyzed the role of eIF4B on cap-dependent and cap-independent translation. We showed that eIF4B is mostly involved in cap-, but not IRES-dependent translation as it happens in mammals.

On the function of the Dictyostelium Argonaute A protein (AgnA) in epigenetic gene regulation

With molecular biology methods and bioinformatics, the Argonaute proteins in Dictyostelium discoideum were characterized, and the function of the AgnA protein in RNAi and DNA methylation was investigated, as well as cellular features. Also interaction partners of the PAZ-Piwi domain of AgnA (PAZ-PiwiAgnA) were discovered. The Dictyostelium genome encodes five Argonaute proteins, termed AgnA/B/C/D/E. The expression level of Argonaute proteins was AgnB/D/E > AgnA > AgnC. All these proteins contain the characteristic conserved of PAZ and Piwi domains. Fluorescence microscopy revealed that the overexpressed C-terminal GFP-fusion of PAZ-PiwiAgnA (PPWa-GFP) localized to the cytoplasm. Overexpression of PPWa-GFP leaded to an increased gene silencing efficiency mediated by RNAi but not by antisense RNA. This indicated that PAZ-PiwiAgnA is involved in the RNAi pathway, but not in the antisense pathway. An analysis of protein-protein interactions by a yeast-two-hybrid screen on a cDNA library from vegetatively grown Dictyostelium revealed that several proteins, such as EF2, EF1-I, IfdA, SahA, SamS, RANBP1, UAE1, CapA, and GpdA could interact with PAZ-PiwiAgnA. There was no interaction between PAZ-PiwiAgnA and HP1, HelF and DnmA detected by direct yeast-two-hybrid analysis. The fluorescence microscopy images showed that the overexpressed GFP-SahA or IfdA fusion proteins localized to both cytoplasm and nuclei, while the overexpressed GFP-SamS localized to the cytoplasm. The expression of SamS in AgnA knock down mutants was strongly down regulated on cDNA and mRNA level in, while the expression of SahA was only slightly down regulated. AgnA knock down mutants displayed defects in growth and phagocytosis, which suggested that AgnA affects also cell biological features. The inhibition of DNA methylation on DIRS-1 and Skipper retroelements, as well as the endogenous mvpB and telA gene, observed for the same strains, revealed that AgnA is involved in the DNA methylation pathway. Northern blot analysis showed that Skipper and DIRS-1 were rarely expressed in Ax2, but the expression of Skipper was upregulated in AgnA knock down mutants, while the expression of DIRS-1 was not changed. A knock out of the agnA gene failed even though the homologous recombination of the disruption construct occurred at the correct site, which indicated that there was a duplication of the agnA gene in the genome. The same phenomenon was also observed in ifdA knock out experiments.

DNA methylation in Dictyostelium discoideum

DNA methyltransferases of type Dnmt2 are a highly conserved protein family with enigmatic function. The aim of this work was to characterize DnmA, the Dnmt2 methyltransferase in Dictyostelium discoideum, and further to investigate its implication in DNA methylation and transcriptional gene silencing. The genome of the social amoeba Dictyostelium encodes DnmA as the sole DNA methyltransferase. The enzyme bears all ten characteristic DNA methyltransferase motifs in its catalytic domain. The DnmA mRNA was found by RT-PCR to be expressed during vegetative growth and down regulated during development. Investigations using fluorescence microscopy showed that both DnmA-myc and DnmA-GFP fusions predominantly localised to the nucleus. The function of DnmA remained initially unclear, but later experiment revealed that the enzyme is an active DNA methyltransferase responsible for all DNA (cytosine) methylation in Dictyostelium. Neither in gel retardation assays, nor by the yeast two hybrid system, clues on the functionality of DnmA could be obtained. However, immunological detection of the methylation mark with an α - 5mC antibody gave initial evidence that the DNA of Dictyostelium was methylated. Furthermore, addition of 5-aza-cytidine as demethylating agent to the Dictyostelium medium and subsequent in vitro incubation of the DNA isolated from these cells with recombinant DnmA showed that the enzyme binds slightly better to this target DNA. In order to investigate further the function of the protein, a gene knock-out for dnmA was generated. The gene was successfully disrupted by homologous recombination, the knock-out strain, however, did not show any obvious phenotype under normal laboratory conditions. To identify specific target sequences for DNA methylation, a microarray analysis was carried out. Setting a threshold of at least 1.5 fold for differences in the strength of gene expression, several such genes in the knock-out strain were chosen for further investigation. Among the up-regulated genes were the ESTs representing the gag and the RT genes respectively of the retrotransposon skipper. In addition Northern blot analysis confirmed the up-regulation of skipper in the DnmA knock-out strain. Bisufite treatment and sequencing of specific DNA stretches from skipper revealed that DnmA is responsible for methylation of mostly asymmetric cytosines. Together with skipper, DIRS-1 retrotransposon was found later also to be methylated but was not present on the microarray. Furthermore, skipper transcription was also up-regulated in strains that had genes disrupted encoding components of the RNA interference pathway. In contrast, DIRS 1 expression was not affected by a loss of DnmA but was strongly increased in the strain that had the RNA directed RNA polymerase gene rrpC disrupted. Strains generated by propagating the usual wild type Ax2 and the DnmA knock-out cells over 16 rounds in development were analyzed for transposon activity. Northern blot analysis revealed activation for skipper expression, but not for DIRS-1. A large number of siRNAs were found to be correspondent to the DIRS-1 sequence, suggesting concerted regulation of DIRS-1 expression by RNAi and DNA methylation. In contrast, no siRNAs corresponding to the standard skipper element were found. The data show that DNA methylation plays a crucial role in epigenetic gene regulation in Dictyostelium and that different, partially overlapping mechanisms control transposon silencing for skipper and DIRS-1. To elucidate the mechanism of targeting the protein to particular genes in the Dictyostelium genome, some more genes which were up-regulated in the DnmA knock-out strain were analyzed by bisulfite sequencing. The chosen genes are involved in the multidrug response in other species, but their function in Dictyostelium is uncertain. Bisulfite data showed that two of these genes were methylated at asymmetrical C-residues in the wild type, but not in DnmA knock-out cells. This suggested that DNA methylation in Dictyostelium is involved not only in transposon regulation but also in transcriptional silencing of specific genes.

Das RNA-bindende Protein Orb2 und seine regulatorische Funktion in der Spermatogenese von Drosophila melanogaster

Das Protein Orb2, welches zum Xenopus CPEB homolog ist, erfüllt während der Spermatogenese von Drosophila melanogaster eine wesentliche Funktion. Das teilweise Ausschalten von orb2 führt zu Störungen in der Individualisierung der Spermatiden, Veränderung in der Morphologie und Lokalisation der Spermatidenkerne und damit verbunden zu männlicher Sterilität. Der weit gestreute Phänotyp spricht für eine regulatorische Funktion des Proteins, wie es aufgrund der Homologie zu CPEB zu erwarten ist. Orb2 mutante Weibchen zeigen dagegen keinen Phänotyp. Die Sterilität konnte mit spezifischen Rettungskonstrukten rückgängig gemacht werden, wobei die beiden Proteinformen in ihrer Funktion höchstwahrscheinlich äquivalent sind, da eine größere Menge an kleinem Protein das Fehlen des größeren ausgleichen kann. Beide Proteinformen lokalisieren in fast alle Stadien der Spermatogenese, wobei nur das kleinere auch in reifen Spermien persistiert. Zur Untersuchung der regulatorischen Funktion des Proteins Orb2 wurden zunächst drei mögliche Protein-Interaktionskandidaten analysiert. Obwohl ähnliche mutante Phänotypen in Gap und Cup ausgelöst wurden, lässt sich eine Interaktion bis jetzt mit diesen Kandidaten weder ausschließen noch bestätigen. Daneben zeigte das Protein Tob eine ähnliche Lokalisierung und einen deutlich ähnlicheren mutanten Phänotyp, wie er für Orb2 beschrieben wurde. Besonders auffällig ist die Lokalisation der Tob mRNA an die Spermatidenenden und die Verringerung der Transkriptmenge in der orb2-Mutante. Ob dieser Phänotyp durch den Verlust der regulatorischen Funktion von Orb2 hervorgerufen wird oder durch den späten Zeitpunkt der Transkription bedingt ist, muß in späteren Experimenten geklärt werden. Mit Hilfe eines Co-Immunpräzipitations-Experimentes wurde nach weiteren Proteininteraktionspartnern sowie nach Ziel-mRNAs gesucht, die durch Orb2 reguliert werden könnten. Dabei ergaben die massenspektrometrischen Analysen zwar Proteine, die mit der Translation selbst in Zusammenhang stehen, sowie einige regulatorische RNA-bindende Proteine, wiesen aber auch in Gestalt eines häufig nachgewiesenen Anhangsdrüsenproteins auf deutliche systematische Probleme hin. Auf genetischem Wege war bereits der Nachweis gelungen, dass die Protamine und mst77F, die strukturelle Komponenten der kompaktierten Kern-DNA sind, durch Orb2 in ihrer Translation reprimiert werden. Dieses Ergebnis wurde zum Teil bestätigt durch den Nachweis der Protamin mRNAs in den Eluaten aus dem Co-Immunpräzipitationsexperiment. Damit konnte zum ersten Mal in der Drosophila Spermatogenese das regulatorische Protein zu einer translationskontrollierten mRNA identifiziert werden.

Involvements of the Plant 3'-5' Exonuclease ERL1 in Chloroplast Ribosomal RNA Biogenesis and RNA Silencing Pathways

ERI-1 und ihm homologe Proteine sind 3‘-5‘ Exoribonukleasen mit konservierten Funktionen in der Regulation von RNA Silencing sowie der Prozessierung ribosomaler RNA. Caenorhabditis elegans ERI-1 (Enhanced RNAi 1) enthält eine konservierte ERI-1_3’hExo_like EXOIII-Domäne, die siRNAs in vitro bindet und degradiert, und deren Inaktivierung eine RNAi-Hypersensitivität zur Folge hat. ERI-1 ist phylogenetisch konserviert, und homologe Proteine wurden Reiche-übergreifend in einer Vielzahl von Modellorganismen identifiziert. RNA-Silencing-reprimierende Eigenschaften dieser Proteine wurden in einigen Fällen charakterisiert. Zusätzlich wurde für eine Untergruppe ERI-1-homologer Proteine eine Funktion in der Biogenese der 5.8S ribosomalen RNA aufgezeigt: Katalyse des letzten Prozessierungsschritts während der Reifung des 5.8S rRNA 3‘-Endes. Diese Doppelfunktion ERI-1-homologer Proteine schlägt eine interessante Brücke zwischen evolutionär weit entfernten auf nicht-codierender RNA basierenden Mechanismen. In dieser Arbeit werden Ergebnisse präsentiert, die Charakteristika des pflanzlichen ERI-1-Homologs ERL1 in verschiedenen regulatorischen Zusammenhängen zum Gegenstand haben. ERL1 lokalisiert in Chloroplasten und zeigt keinerlei messbare Aktivität in Bezug auf die Regulierung von RNA Silencing. Im Gegensatz dazu konnte gezeigt werden, dass ERL1 eine wichtige Rolle während der Reifung der chloroplastischen 5S rRNA spielt. ERL1-supprimierende bzw. -überexprimierende transgene Pflanzen, zeigen unterschiedliche phänotypische Aberrationen. Diese beinhalten vielfarbige Blätter, reduziertes Wachstum und Fruchtbarkeit, sowie den Verlust Photosynthese-kompetenter Chloroplasten in gebleichten Sektoren. Diese Defekte werden dadurch verursacht, dass die Plastid-Entwicklung in einem frühen Stadium blockiert wird. Dies führt zu defekten Plastiden, die keine kanonischen internen Strukturen, einschließlich Grana, bilden können. Die gestörte Plastid-Entwicklung ist ein Resultat fehlerhafter Prozessierung ribosomaler RNAs und dem daraus folgenden Verlust plastidärer Transkription und Translation. Wenn ERL1 runterreguliert oder überexprimiert ist, akkumulieren 3‘-elongierte 5S rRNA-Moleküle, was Störungen in der Produktion der Ribosomen hervorruft. Die Reifung der 5S rRNA ist leit langem als Prozess bekannt, der viele aufeinander folgende endonukleolytische Spaltungen sowie exonukleolytische Rezessionen beinhaltet. Bis dato war die Gesamtheit der Exonukleasen während dieser Reifung jedoch nur lückenhaft bekannt. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass ERL1 eine wichtige Rolle in der Plastid-Entwicklung spielt, indem ERL1 den finalen Reifungsschritt des 5S rRNA 3‘-Endes katalysiert.

Characterization of DnmA, the Dnmt2 homolog in Dictyostelium discoideum

Eukaryotic DNA m5C methyltransferases (MTases) play a major role in many epigenetic regulatory processes like genomic imprinting, X-chromosome inactivation, silencing of transposons and gene expression. Members of the two DNA m5C MTase families, Dnmt1 and Dnmt3, are relatively well studied and many details of their biological functions, biochemical properties as well as interaction partners are known. In contrast, the biological functions of the highly conserved Dnmt2 family, which appear to have non-canonical dual substrate specificity, remain enigmatic despite the efforts of many researchers. The genome of the social amoeba Dictyostelium encodes Dnmt2-homolog, the DnmA, as the only DNA m5C MTase which allowed us to study Dnmt2 function in this organism without interference by the other enzymes. The dnmA gene can be easily disrupted but the knock-out clones did not show obvious phenotypes under normal lab conditions, suggesting that the function of DnmA is not vital for the organism. It appears that the dnmA gene has a low expression profile during vegetative growth and is only 5-fold upregulated during development. Fluorescence microscopy indicated that DnmA-GFP fusions were distributed between both the nucleus and cytoplasm with some enrichment in nuclei. Interestingly, the experiments showed specific dynamics of DnmA-GFP distribution during the cell cycle. The proteins colocalized with DNA in the interphase and were mainly removed from nuclei during mitosis. DnmA functions as an active DNA m5C MTase in vivo and is responsible for weak but detectable DNA methylation of several regions in the Dictyostelium genome. Nevertheless, gel retardation assays showed only slightly higher affinity of the enzyme to dsDNA compared to ssDNA and no specificity towards various sequence contexts, although weak but detectable specificity towards AT-rich sequences was observed. This could be due to intrinsic curvature of such sequences. Furthermore, DnmA did not show denaturant-resistant covalent complexes with dsDNA in vitro, although it could form covalent adducts with ssDNA. Low binding and methyltransfer activity in vitro suggest the necessity of additional factor in DnmA function. Nevertheless, no candidates could be identified in affinity purification experiments with different tagged DnmA fusions. In this respect, it should be noted that tagged DnmA fusion preparations from Dictyostelium showed somewhat higher activity in both covalent adduct formation and methylation assays than DnmA expressed in E.coli. Thus, the presence of co-purified factors cannot be excluded. The low efficiency of complex formation by the recombinant enzyme and the failure to define interacting proteins that could be required for DNA methylation in vivo, brought up the assumption that post-translational modifications could influence target recognition and enzymatic activity. Indeed, sites of phosphorylation, methylation and acetylation were identified within the target recognition domain (TRD) of DnmA by mass spectrometry. For phosphorylation, the combination of MS data and bioinformatic analysis revealed that some of the sites could well be targets for specific kinases in vivo. Preliminary 3D modeling of DnmA protein based on homology with hDNMT2 allowed us to show that several identified phosphorylation sites located on the surface of the molecule, where they would be available for kinases. The presence of modifications almost solely within the TRD domain of DnmA could potentially modulate the mode of its interaction with the target nucleic acids. DnmA was able to form denaturant-resistant covalent intermediates with several Dictyostelium tRNAs, using as a target C38 in the anticodon loop. The formation of complexes not always correlated with the data from methylation assays, and seemed to be dependent on both sequence and structure of the tRNA substrate. The pattern, previously suggested by the Helm group for optimal methyltransferase activity of hDNMT2, appeared to contribute significantly in the formation of covalent adducts but was not the only feature of the substrate required for DnmA and hDNMT2 functions. Both enzymes required Mg2+ to form covalent complexes, which indicated that the specific structure of the target tRNA was indispensable. The dynamics of covalent adduct accumulation was different for DnmA and different tRNAs. Interestingly, the profiles of covalent adduct accumulation for different tRNAs were somewhat similar for DnmA and hDNMT2 enzymes. According to the proposed catalytic mechanism for DNA m5C MTases, the observed denaturant-resistant complexes corresponded to covalent enamine intermediates. The apparent discrepancies in the data from covalent complex formation and methylation assays may be interpreted by the possibility of alternative pathways of the catalytic mechanism, leading not to methylation but to exchange or demethylation reactions. The reversibility of enamine intermediate formation should also be considered. Curiously, native gel retardation assays showed no or little difference in binding affinities of DnmA to different RNA substrates and thus the absence of specificity in the initial enzyme binding. The meaning of the tRNA methylation as well as identification of novel RNA substrates in vivo should be the aim of further experiments.

Molekularbiologische Charakterisierung der Argonauten Proteine AgnA und AgnB innerhalb der RNA vermittelten Genregulation in D. discoideum

Argonauten Proteine übernehmen vielfältige Funktionen in RNA vermittelten Signalwegen zur Genregulation und sind in eukaryotischen Organismen hoch konserviert. Obwohl das Repertoire an kleinen regulatorischen RNAs in D. discoideum schon früh untersucht wurde und dabei sowohl siRNAs als auch miRNAs identifiziert werden konnten, war die Funktion der fünf kodierten Argonauten Proteine zu Beginn meiner Arbeit noch völlig unbekannt. Im Fokus meiner Untersuchung standen die zwei Homologe AgnA und AgnB. Die molekularbiologische Charakterisierung von AgnA hat gezeigt, dass das Protein eine essentielle Funktion bei der posttranskriptionellen Regulation des Retrotransposons DIRS-1 hat. AgnA wird für die Generierung von über 90 % der DIRS-1 siRNAs benötigt, wobei unklar ist, ob die Slicer-Aktivität des Proteins relevant ist oder ob AgnA andere Proteine zur Generierung der kleinen RNAs rekrutiert. Mit Hilfe der Deep Sequencing Analyse kleiner RNAs im AgnA KO konnte die Abreicherung der DIRS-1 siRNAs bestätigt werden. Die Anreicherung von DIRS-1 sense und antisense Transkripten weist deutlich auf eine Deregulation des Retrotransposons bei Abwesenheit von AgnA hin. Der Verlust der AgnA abhängigen Regulationsebene ist nicht nur auf RNA- sondern auch auf DNA-Ebene nachweisbar, da im AgnA Knockout einzelsträngige extrachromosomale DIRS-1 Intermediate nachweisbar sind. Die Analyse dieser Strukturen mit Hilfe von Rasterkraftmikroskopie zeigt, dass die extrachromosomale DNA mit Proteinen assoziiert ist. Das Erscheinungsbild legt die Vermutung nahe, dass es sich um Virus ähnliche Partikel handeln könnte. Die Transposition der DIRS-1 Elemente konnte nicht nachgewiesen werden. Sie schlägt vermutlich fehl, da der zur Integration notwendige DNA-Doppelstrang nicht gebildet wird. Auch wenn der genaue Mechanismus der AgnA abhängigen DIRS-1 Regulation nicht vollständig aufgeklärt werden konnte, weisen die Ergebnisse darauf hin, dass AgnA nicht nur an der Biogenese der kleinen DIRS-1 siRNAs beteiligt ist, sondern auch weiter downstream, vermutlich innerhalb von Effektorkomplexen, als Regulator aktiv ist. AgnB ist nicht an der negativen Regulation des DIRS-1 Retrotransposons beteiligt. Im Gegenteil haben Experimente gezeigt, dass das Protein die Transkription des Elementes und die Bildung von DNA-Intermediaten eher positiv beeinflusst. Im Fall des Retrotransposons Skipper ist unklar, ob die wenigen siRNAs, die identifiziert worden sind, tatsächlich für die Regulation dieses Elementes genutzt werden. Der Knockout von AgnA hat eine Anreicherung der Skipper siRNAs zur Folge, wobei diese sehr variabel ist. Es konnten Skipper Transkripte nachgewiesen werden (Hinas et al., 2007), die wahrscheinlich die Vorläufermoleküle der siRNAs darstellen. Die Menge dieser Transkripte unterscheidet sich allerdings im Wildtyp und den untersuchten Knockout-Stämmen nicht. Bei der Untersuchung der miRNAs zeigte sich eine signifikante Anreicherung dieser regulatorischen RNAs im AgnA Knockout. Die Akkumulation kann durch die Expression von rekombinantem AgnA wieder auf Wildtyp Niveau gebracht werden. Die genaue Funktion von AgnA im miRNA Signalweg konnte aber nicht näher spezifiziert werden. Im Fall der beiden miRNAs konnte im Rahmen dieser Arbeit nachgewiesen werden, dass sie keine 2‘-O Methylierung besitzen und fast ausschließlich im Cytoplasma der Zelle vorliegen. Letzteres weist darauf hin, dass die untersuchten miRNAs ihre Zielgene vermutlich posttranskriptionell regulieren. Die Akkumulation von miRNAs im AgnA KO konnte ebenfalls durch Deep Sequencing Analysen verifiziert werden. Weiterhin wurden tRNA Fragmente gefunden, die im AgnA KO wesentlich stärker vertreten sind. Northern Blot Analysen haben gezeigt, dass ein zusätzliches Fragment der tRNA Asp akkumuliert, wenn AgnA nicht exprimiert wird. Möglicherweise ist AgnA am Umsatz der tRNA beteiligt. Die biologische Funktion der tRNA Fragmente in D. discoideum ist jedoch bisher ungeklärt. Bei der Suche nach putativen Interaktionspartnern konnte im Fall von AgnA das Protein DDB_G0268914 mittels Massenspektrometrie als putativer Interaktionspartner identifiziert werden. Dieses Protein zeigt Homologien zu MOV10 aus H. sapiens, das ebenfalls mit Argonauten Proteinen interagiert (Hock et al., 2007) und die Replikation von Retroviren unterdrückt (Burdick et al., 2010). Die Interaktion zwischen AgnA und dem MOV10 Homolog konnte bisher nicht mit anderen Ansätzen bestätigt werden. Darüber hinaus bleibt zu klären, ob der putative Interaktionsparter ebenfalls an der Regulation des Retrotransposons DIRS-1 beteiligt ist.

A simple retroelement based knock-down system in Dictyostelium

Characteristics of DIRS-1 Mediated Knock-Downs __ We have previously shown that the most abundant Dictyostelium discoideum retroelement DIRS-1 is suppressed by RNAi mechanisms. Here we provide evidence that both inverted terminal repeats have strong promoter activity and that bidirectional expression apparently generates a substrate for Dicer. A cassette containing the inverted terminal repeats and a fragment of a gene of interest was sufficient to activate the RNAi response, resulting in the generation of ~21 nt siRNAs, a reduction of mRNA and protein expression of the respective endogene. Surprisingly, no transitivity was observed on the endogene. This was in contrast to previous observations, where endogenous siRNAs caused spreading on an artificial transgene. Knock-down was successful on seven target genes that we examined. In three cases a phenotypic analysis proved the efficiency of the approach. One of the target genes was apparently essential because no knock-out could be obtained; the RNAi mediated knock-down, however, resulted in a very slow growing culture indicating a still viable reduction of gene expression.