Molekulare Mechanismen der cAMP-vermittelten Signaltransduktion

Zusammenfassung - Der sekund��re Botenstoff zyklisches Adenosinmonophosphat (cAMP) reguliert viele fundamentale zellul��re Prozesse wie Zellproliferation, Differenzierung, Energiemetabolismus und Genexpression. In eukaryotischen Zellen vermittelt die cAMP-abh��ngige Proteinkinase (PKA) die meisten biologischen Funktionen von cAMP. Die PKA besteht aus jeweils zwei regulatorischen (R) und katalytischen (C) Untereinheiten, die zusammen einen inaktiven Holoenzymkomplex bilden, der durch cAMP aktiviert wird. In dieser Arbeit wurde die Bindung von cAMP und cAMP-Analoga an die R Untereinheit der PKA unter funktionellen und mechanistischen Aspekten untersucht. Eine neue, auf Fluoreszenzpolarisation basierende Methode wurde entwickelt, um die Affinit��t von cAMP-Analoga in einem homogenen Ansatz schnell, reproduzierbar und nicht radioaktiv zu quantifizieren. Zur detaillierten Untersuchung des Bindungsmechanismus von cAMP und cAMP Analoga (Agonisten und Antagonisten) wurden thermodynamische Studien im direkten Vergleich mittels isothermaler Titrationskalorimetrie und kinetischen Analysen (Oberfl��chenplasmonresonanz, SPR) durchgef��hrt, wodurch thermodynamische Signaturen f��r das Bindungsverhalten der Nukleotide an die R Untereinheit der PKA erhalten werden konnten. Durch Interaktionsstudien an mutagenisierten R Untereinheiten wurde der intramolekulare Aktivierungsmechanismus der PKA in Bezug auf cAMP-Bindung, Holoenzymkomplex-Formierung und -Aktivierung untersucht. Die dabei erhaltenen Ergebnisse wurden mit zwei Modellen der cAMP-induzierten Konformations��nderung verglichen, und ein Aktivierungsmechanismus postuliert, der auf konservierten hydrophoben Aminos��uren basiert. F��r in vivo Untersuchungen wurden zusammen mit Kooperationspartnern membranpermeable, fluoreszierende cAMP Analoga entwickelt, die Einblicke in die Dynamik der cAMP-Verteilung in Zellen erlauben. Neu entwickelte, Festphasen gebundene cAMP-Analoga (Agonisten und Antagonisten) wurden in einem (sub)proteomischen Ansatz dazu genutzt, nat��rliche Komplexe der R Untereinheit und des PKA-Holoenzyms aus Zelllysaten zu isolieren und zu identifizieren. Diese Untersuchungen flie��en letztlich in einem systembiologischen Ansatz zusammen, der neue Einblicke in die vielschichtigen cAMP gesteuerten Netzwerke und Regulationsprozesse erlaubt.

Regulation und Koordination der Proteinkinase A im cAMP-vermittelten Signalweg

Die cAMP-abh��ngige Proteinkinase ist an der Regulation grundlegender zellul��rer Prozesse, wie Entwicklung und Differenzierung, sowie Stoffwechselprozessen, beteiligt. Das Holoenzym bestehend aus einem Dimer regulatorischer (R) und zwei katalytischer C (C) Untereinheiten wird durch den sekund��ren Botenstoff cAMP reguliert. Die molekulare Grundlage der Holoenzymdynamik, sowie die r��umliche und zeitliche Koordination der Holoenzyme in der cAMP-vermittelten Signaltransduktion sind zentrale Themen der aktuellen Forschung. Die Dynamik wird in erster Linie durch die cAMP-Konzentration, die Isoenzymzusammensetzung und die Verf��gbarkeit von Kinasesubstraten bestimmt. Klassischerweise wurde die Holoenzymdynamik auf Grundlage der Phosphotransferaseaktivit��t der C Untereinheit untersucht. Der Effekt von Substrat auf die apparenten Aktivierungskonstanten (cAMP) konnte aber so nicht bestimmt werden, sodass in dieser Arbeit eine alternative Methode entwickelt werden musste, die unabh��ngig von der Messung der Substratphosphorylierung ist. Eine Validierung dieser SPR-basierten Methode erfolgte mit Typ-I��� Holoenzym, wobei eine leichtere Aktivierung in Gegenwart von Substrat best��tigt werden konnte. ��berraschenderweise wurde mit dieser Methode der umgekehrte Effekt von Substratpeptid auf die Aktivierung des Typ-II��� Holoenzyms gemessen, wobei mit steigender Substratkonzentration gr����ere apparente Aktivierungskonstanten bestimmt wurden. Durch gerichtete Mutationen der P0-Stelle in der Autoinhibitionsdom��ne konnte diese Position als eine Hauptdeterminante f��r die Dynamik der Holoenzyme identifiziert werden. Im Allgemeinen f��hren Pseudosubstratinhibitoren (RI���, RII���S99A) in Abh��ngigkeit von der Substratkonzentration zu einer Verkleinerung, und Substratinhibitoren (RII���, RI���A99S) zu einer Vergr����erung der apparenten Aktivierungskonstanten der entsprechenden Holoenzyme. Bei Untersuchungen zum Phosphostatus der hRII��� im Holoenzymkomplex sowie w��hrend der Dissoziation in Gegenwart oder Abwesenheit von Substrat, konnte mit Serin 58 eine zweite Autophosphorylierungsstelle in der Linkerregion identifiziert werden, die ein deutlich langsameres Laufverhalten in der SDS PAGE hervorruft. Allerdings konnte dieser Stelle keine Funktion im Bezug auf die Interaktion mit der katalytischen Untereinheit sowie ausgew��hlten AKAPs zugesprochen werden. In dieser Arbeit konnte ein gegens��tzlicher Mechanismus zur Feinregulation der Dynamik des Typ-I��� und ���II��� Holoenzyms durch Substrat gezeigt und die molekulare Grundlage aufgekl��rt werden. Diese bisher nicht beschriebene Autophosphorylierungsstelle k��nnte eine wichtige Rolle in der Konformationskontrolle des N-Terminus spielen, oder als Plattform zur Wechselwirkung mit bisher unbekannten Interaktionspartnern der hRII��� dienen.