Die Masse macht's!

Die biochemische Beschreibung funktioneller Proteininteraktionsnetzwerke hat in den letzten Jahren einen starken Wandel erfahren. Mittels hochauflösender biologischer Massenspektrometrie(MS) ist es möglich Netzwerkkomponenten, wie Proteine schnell und zuverlässig zu identifizieren und auf ihre Modifikationen hin zu untersuchen. Innerhalb des Promotionskollegs (PK) Proteomics der Universität Kassel bietet die MS neue Ansatzpunkte für die Beantwortung molekularbiologischer Fragestellungen und liefert Ergänzungen zu den bislang genutzten klassischen Methoden der Biochemie.

Proteomics Day 2008 in Rotenburg an der Fulda

Dieses Projekt wurde innerhalb des Graduiertenkollegs „Proteomics“ der Universität Kassel gefördert.

Untersuchung zum Phosphorylierungsstatus der katalytischen Untereinheit der PKA mittels proteomischer Techniken

ZUSAMMENFASSUNG: Das Phosphorylierungsmuster eines Proteins ist kein statischer Zustand, sondern vielmehr ein dynamischer Status, den es in der modernen funktionellen (Phospho-) Proteomik und Analytik abzubilden gilt. Klassischerweise erfolgt der Nachweis der Proteinphosphorylierung auf Peptid-Ebene mittels MS/MS Sequenzierung. Diese Standardmethode der shotgun Phosphoproteomanalytik vernachlässigt jedoch wegen den in LC MS/MS Analysen oftmals schwer detektierbaren Phosphopeptiden gerade den variablen und oftmals nur geringen Phosphorylierungsgrad vieler Phosphorylierungsstellen (P-Stellen). Mittels phosphospezifischer Anreicherungsstrategien und MS/MS Sequenzierung konnten an der Modellkinase PKA-Cα nach rekombinanter Expression in E. coli insgesamt acht P-Stellen identifiziert werden. Der Phosphorylierungsgrad wurde in Kooperation mit Dr. J. Seidler über quantitative Signalintensitätsmessungen bestimmt und zeigte eine nahezu vollständige Phosphorylierung von pS10, pS139, pT197 und pS338, während der Phosphorylierungsgrad für pS34, pS53, pS65 und pS259 zwischen <5 und 45 % variierte. Neben der Quantifizierung der P-Stellen wurde auch das Auftreten und die Verteilung definierter Phosphoformen der PKA-Cα untersucht und deren Abhängigkeit von der primären Aminosäureabfolge, dem Auftreten von zusätzlichen Modifikationen sowie den gewählten Expressions- und Reinigungsbedingungen aufgezeigt. Endogene, aus Säugergewebe isolierte PKA-Cα wies nur eine einzige Phosphoform mit den P-Stellen pT197 und pS338 auf. Auch in vitro autophosphorylierte rekombinante PKA-Cα, die zuvor dephosphoryliert worden war, wies eine zweifach modifizierte Phosphoform auf. Im Vergleich zum endogenen Protein ließ sich dieses Protein an S10 und S338 exzessiv phosphorylieren, wohingegen an T197 keine Autophosphorylierung nachzuweisen war. Das Ausbleiben weiterer Phosphorylierungen stellt in Frage, ob die Hyperphosphorylierung in E. coli ausschließlich auf Autophosphorylierungsprozessen beruht, was anhand einer nicht phosphorylierten, katalytisch inaktiven Variante von PKA-Cα (PKA-Cα K72H) vermutet wurde. Im Hinblick auf die funktionellen P-Stellen pT197 und pS338 erfordert diese Entdeckung sowie der unabhängige Nachweis, dass zellfrei exprimierte PKA-Cα nur an S338 phosphoryliert ist, eine Modifizierung des sequenziellen Vorhersagemodells, wonach die Phosphorylierung an T197 eine zwingende Voraussetzung für die nachfolgende Phosphorylierung an S338 ist. Ferner konnte über phosphomimetische Mutagenese die Funktionalität der Phosphorylierung an S53 innerhalb der glycinreichen Schleife der PKA-Cα und somit ein potenzieller Weg zur Regulation der enzymatischen Aktivität gezeigt werden. Ein weiterer möglicher upstream Regulator von PKA-Cα ist die Proteinphosphatase 5, die in der Lage war, die bislang als phosphatasestabil beschriebene P Stelle pT197 in vitro zu dephosphorylieren. Die vorliegende Arbeit zeigt, dass der Phosphorylierungszustand eines Proteins von zahlreichen internen und externen Faktoren abhängt – eine Tatsache, die gerade für rekombinante Proteine, insbesondere enzymatisch aktive Kinasen, oft vernachlässigt wurde. Daher müssen auch in der shotgun Phosphoproteomanalytik P-Stellen nicht mehr nur identifiziert und quantifiziert werden, sondern die resultierenden Proteinphosphoformen differenziert auch in ihrem physiologischen Kontext beschrieben werden.

Schauder – Zur Dekonstruktion eines Spürens

Zusammenfassung: Ziel der Arbeit ist den Sinn von Schauder philosophisch zu erhellen. An einem Einzelphänomen, wie es so bisher nicht behandelt wurde, wird zugleich das Geflecht von Affekt/Emotion/Gefühl, gestützt auf Hegel, Heidegger, Husserl, Freud und Lacan, in immer neuen Ansätzen kritisch reflektiert und Zug um Zug mit Derrida dekonstruiert. In einem Textverfahren, das sich auch grafisch durch gegenübergestellte Kolumnen auszeichnet, werden heterogene Ansätze zum Sinn von Schauder mit dekonstruktivistischen Einsichten konfrontiert. Die Ansätze, Schauder über Datum, Begriff, Phänomen oder Strukturelement bestimmen zu wollen, durchdringen sich dabei mit denjenigen, die sich einer solchen Bestimmung entziehen (Hegels Negativität, Heideggers Seinsentzug oder Lacans Signifikantenmangel). Am Fokus Schauder, an dem sich das Fiktive einer mit sich selbst identischen Präsenz besonders eindringlich darstellt, werden so spezifische Aporien der Metaphysik der Präsenz entfaltet und die Geschlossenheit logozentristischer Systeme in die Bewegung einer anderen Öffnung und Schließung im Sinn der Schrift bzw. des allgemeinen Textes transformiert. Neben der différance, dem Entzug der Metapher, dem Supplement und dem Gespenstischen stützt sich die Arbeit auf die Iterabilität, bei der im selben Zug die Identität des Sinns gestiftet und zerstreut wird (Dissemination). Im Kapitel Piloerection werden Ambivalenzen und Paradoxien des Schauders am Beispiel von computergestützten empirisch-psychologischen Studien aufgezeigt. Im Kapitel Atopologie des Schauders prädikative, propositionale und topologische Bedingungen zum Sinn von Schauder analysiert und dekonstruiert. Ebenso, im Folgekapitel Etymon, etymologische und technisch-mediale Bedingungen. Im Schlußkapitel Maß, Anmaß, Unmaß der Empfindung des Schauders wird am Beispiel der konkreten Beiträge zum Schauder von Aristoteles, Kant, Fechner, Otto, Klages, Lorenz und Adorno aufgezeigt, dass (1) ein Schauder nicht von einem Außen aus an-gemessen werden kann, (2) sich im Schauder die metaphysische Opposition von Fiktion und Realität in einer Unentscheidbarkeit zerstreut, (3) dass trotz der Heterogenität der Ansätze in diesen Beiträgen eine Komplizenschaft zum Ausdruck kommt: ein Begehren nach Präsenz, das durch den Ausschluß des Anderen zugleich die Gewalt des Einen produziert, (4) dass der Signifikant Schauder, der selbst in Abwesenheit eines Referenten, eines bestimmten Signifikats, einer aktuellen Bedeutungs­intention, eines Sen­ders oder Empfängers funktioniert, als verändertes Zu­rückbleiben eines differenzieller Zeichens betrachtet werden muss, als Effekt von Spuren, die sich nur in ihrem eige­nen Auslöschen ereignen. Die Arbeit schließt mit dem Vorschlag, Spüren jenseits von Arché, Telos oder Eschaton, jenseits eines Phallogozentrismus in der derridaschen Spur zu denken. Nicht zuletzt über diese Pfropfung, wie sie im Französischen [trace] so nicht möglich ist, schließt sie als deutschsprachiger Beitrag an sein Werk an.