Digital image analysis as a tool to estimate legume contributions in legume-grass swards

Summary: Productivity and forage quality of legume-grass swards are important factors for successful arable farming in both organic and conventional farming systems. For these objectives the botanical composition of the swards is of particular importance, especially, the content of legumes due to their ability to fix airborne nitrogen. As it can vary considerably within a field, a non-destructive detection method while doing other tasks would facilitate a more targeted sward management and could predict the nitrogen supply of the soil for the subsequent crop. This study was undertaken to explore the potential of digital image analysis (DIA) for a non destructive prediction of legume dry matter (DM) contribution of legume-grass mixtures. For this purpose an experiment was conducted in a greenhouse, comprising a sample size of 64 experimental swards such as pure swards of red clover (Trifolium pratense L.), white clover (Trifolium repens L.) and lucerne (Medicago sativa L.) as well as binary mixtures of each legume with perennial ryegrass (Lolium perenne L.). Growth stages ranged from tillering to heading and the proportion of legumes from 0 to 80 %. Based on digital sward images three steps were considered in order to estimate the legume contribution (% of DM): i) The development of a digital image analysis (DIA) procedure in order to estimate legume coverage (% of area). ii) The description of the relationship between legume coverage (% area) and legume contribution (% of DM) derived from digital analysis of legume coverage related to the green area in a digital image. iii) The estimation of the legume DM contribution with the findings of i) and ii). i) In order to evaluate the most suitable approach for the estimation of legume coverage by means of DIA different tools were tested. Morphological operators such as erode and dilate support the differentiation of objects of different shape by shrinking and dilating objects (Soille, 1999). When applied to digital images of legume-grass mixtures thin grass leaves were removed whereas rounder clover leaves were left. After this process legume leaves were identified by threshold segmentation. The segmentation of greyscale images turned out to be not applicable since the segmentation between legumes and bare soil failed. The advanced procedure comprising morphological operators and HSL colour information could determine bare soil areas in young and open swards very accurately. Also legume specific HSL thresholds allowed for precise estimations of legume coverage across a wide range from 11.8 - 72.4 %. Based on this legume specific DIA procedure estimated legume coverage showed good correlations with the measured values across the whole range of sward ages (R2 0.96, SE 4.7 %). A wide range of form parameters (i.e. size, breadth, rectangularity, and circularity of areas) was tested across all sward types, but none did improve prediction accuracy of legume coverage significantly. ii) Using measured reference data of legume coverage and contribution, in a first approach a common relationship based on all three legumes and sward ages of 35, 49 and 63 days was found with R2 0.90. This relationship was improved by a legume-specific approach of only 49- and 63-d old swards (R2 0.94, 0.96 and 0.97 for red clover, white clover, and lucerne, respectively) since differing structural attributes of the legume species influence the relationship between these two parameters. In a second approach biomass was included in the model in order to allow for different structures of swards of different ages. Hence, a model was developed, providing a close look on the relationship between legume coverage in binary legume-ryegrass communities and the legume contribution: At the same level of legume coverage, legume contribution decreased with increased total biomass. This phenomenon may be caused by more non-leguminous biomass covered by legume leaves at high levels of total biomass. Additionally, values of legume contribution and coverage were transformed to the logit-scale in order to avoid problems with heteroscedasticity and negative predictions. The resulting relationships between the measured legume contribution and the calculated legume contribution indicated a high model accuracy for all legume species (R2 0.93, 0.97, 0.98 with SE 4.81, 3.22, 3.07 % of DM for red clover, white clover, and lucerne swards, respectively). The validation of the model by using digital images collected over field grown swards with biomass ranges considering the scope of the model shows, that the model is able to predict legume contribution for most common legume-grass swards (Frame, 1992; Ledgard and Steele, 1992; Loges, 1998). iii) An advanced procedure for the determination of legume DM contribution by DIA is suggested, which comprises the inclusion of morphological operators and HSL colour information in the analysis of images and which applies an advanced function to predict legume DM contribution from legume coverage by considering total sward biomass. Low residuals between measured and calculated values of legume dry matter contribution were found for the separate legume species (R2 0.90, 0.94, 0.93 with SE 5.89, 4.31, 5.52 % of DM for red clover, white clover, and lucerne swards, respectively). The introduced DIA procedure provides a rapid and precise estimation of legume DM contribution for different legume species across a wide range of sward ages. Further research is needed in order to adapt the procedure to field scale, dealing with differing light effects and potentially higher swards. The integration of total biomass into the model for determining legume contribution does not necessarily reduce its applicability in practice as a combined estimation of total biomass and legume coverage by field spectroscopy (Biewer et al. 2009) and DIA, respectively, may allow for an accurate prediction of the legume contribution in legume-grass mixtures.

Biologische Funktionsanalyse und Identifizierung neuer Substrate der Methyltransferase Dnmt2

Obwohl die DNA Methyltransferase 2 (Dnmt2) hoch konserviert ist und zu der am weitesten verbreiteten eukaryotischen MTase-Familie gehört, ist ihre biologische Funktion nach wie vor unklar. Nachdem lange Zeit keine DNA Methylierungsaktivität nachgewiesen werden konnte, wurde vor einigen Jahren über geringe Mengen an 5-Methylcytosin (5mC) in Retroelementen der “Dnmt2-only”-Organismen D. melanogaster, D. discoideum und E. histolytica berichtet (Kunert et al. 2003; Fisher et al. 2004; Kuhlmann et al. 2005; Phalke et al. 2009). Als kurze Zeit später robuste Methylierung der tRNAAsp durch humane Dnmt2 gezeigt wurde (Goll et al. 2006), wurde zunächst eine Dualspezifität des Enzyms vorgeschlagen (Jeltsch et al. 2006). Neuere Daten zum 5mC-Status verschiedener „Dnmt2-only“-Organismen bilden Anlass für kontroverse Diskussionen über Ausmaß und Bedeutung der DNA Methyltransferaseaktivität von Dnmt2 (Schaefer et al. 2010a; Krauss et al. 2011). Die vorliegende Arbeit konzentriert sich auf die Identifizierung neuer RNA Substrate des Dnmt2-Homologs DnmA aus D. discoideum sowie die biologische Bedeutung der tRNA-Methylierung durch Dnmt2. Wie in anderen Organismen beschrieben, fungiert auch DnmA als tRNAAsp(GUC) MTase in vitro und in vivo. Zusätzlich konnte in vitro tRNAGlu(UUC) als neues Substrat der Dnmt2-Homologe aus D. discoideum und dem Menschen identifiziert werden. In einem Kooperationsprojekt wurde außerdem auch tRNAAsp-Methylierungsaktivität für das Dnmt2-Homolog aus S. pombe (Pmt1) nachgewiesen. Crosslink-RNA-Immunopräzipitationen (RNA-CLIP) mit anschließender Next-Generation-Sequenzierung der mit DnmA assoziierten RNAs zeigen, dass DnmA mit tRNA Fragmenten interagiert, die sich vom Anticodonloop bis in den T-loop erstrecken. Neben der tRNAAsp(GUC) und tRNAGlu(UUC/CUC) sind Fragmente der tRNAGly(GCC) verstärkt angereichert. Inwiefern diese Fragmente eine biologische Funktion haben oder spezifische Degradationsprodukte darstellen, ist noch ungeklärt. Interessanterweise sind von einigen tRNAs wenige Sequenzen von antisense-Fragmenten in den RNA-CLIP Daten zu finden, die etwas kürzer, jedoch exakt komplementär zu den genannten sense-Fragmenten sind. Besonders stark sind diese Fragmente der tRNAGlu(UUC) vertreten. In einem weiteren RNA-CLIP Experiment wurden U-snRNAs, snoRNA und intergenische Sequenzen mit DnmA angereichert. Bei nachfolgenden in vitro Methylierungsstudien konnte ausschließlich die U2-snRNA als potentielles Nicht-tRNA-Substrat der hDnmt2 und DnmA identifiziert werden. Da tRNA Modifikationen im Anticodonloop die Codonerkennung beeinflussen können, wurde ein System etabliert um die Translationseffizienz eines GFP-Reportergens in Wildtyp- und dnmAKO-Zellen zu messen. In D. discoideum wird das Aspartat-Codon GAU ca. zehnmal häufiger genutzt als das GAC Codon, allerdings ist nur eine tRNAAsp(GUC) im Genom der Amöbe kodiert. Aus diesem Grund wurde zusätzlich die Frage adressiert, inwiefern die DnmA-abhängige Methylierung dieser tRNA das „Wobbling“ beeinflusst. Dazu wurde dem Reportergen jeweils eine (GAU)5- und (GAC)5-Leadersequenz vorgeschaltet. Entgegen der Annahme wurde der (GAC)5-Leader in beiden Stämmen etwas effizienter translatiert. Insgesamt zeigte der dnmAKO-Stamm eine leicht erhöhte Translationseffizienz der Reportergene. Vergleichende Analysen zur Aufnahme von Fremd-DNA zeigten signifikant reduzierte Transformationseffizienzen mit einem integrierenden Plasmid in dnmAKO-Zellen. Ein weiterer dnmAKO-Stamm zeigte diesen Effekt jedoch nicht, wobei bei derselben Mutante eine deutlich reduzierte Aufnahme eines extrachromosomalen Plasmids zu verzeichnen war. Untersuchungen zum Einfluss von DnmA auf die Regulation des Retroelements skipper ergaben keinen Zusammenhang zwischen der Generierung kleiner RNAs und der erhöhten Transkription des Retrotransposons in dnmAKO-Zellen (Kuhlmann et al. 2005). Durch Kompensationsversuche sowie Experimente mit einer weiteren dnmAKO-Mutante konnte die Mobilisierung des Retrotransposons nicht eindeutig als DnmA-Funktion eingeordnet werden. In einem weiteren Projekt wurden die Bindung des m5C-bindenden Proteins EhMLBP aus E. histolytica an DNA mittels Rasterkraftmikroskopie abgebildet (Lavi et al. 2006). Neben vermutlich unspezifischen Endbindungsereignissen konnte eine bevorzugte Bindungsstelle des Proteins an LINE DNA (long intersperesed nuclear element) identifiziert werden. Möglicherweise fällt diese mit einem von zwei A/T-reichen Bereichen der LINE DNA zusammen, von denen vermutet wird, dass diese für die Bindung von EhMLBP an DNA von Bedeutung sind. Insgesamt bestätigen die Ergebnisse dieser Arbeit die tRNAAsp Methylierungsaktivität als konservierte Dnmt2-Funktion. Darüber hinaus erweitern sie das Substratspektrum der Dnmt2-Methyltransferasen im Bereich der tRNA. Außerdem wird erstmals ein potentielles Nicht-tRNA Substrat vorgeschlagen. Zusätzlich geben neu entdeckte Phänotypen Hinweise auf vielfältige zelluläre Dnmt2-Funktionen.

The Role of Epistemic Monitoring in Language Comprehension

In der psycholinguistischen Forschung ist die Annahme weitverbreitet, dass die Bewertung von Informationen hinsichtlich ihres Wahrheitsgehaltes oder ihrer Plausibilität (epistemische Validierung; Richter, Schroeder & Wöhrmann, 2009) ein strategischer, optionaler und dem Verstehen nachgeschalteter Prozess ist (z.B. Gilbert, 1991; Gilbert, Krull & Malone, 1990; Gilbert, Tafarodi & Malone, 1993; Herbert & Kübler, 2011). Eine zunehmende Anzahl an Studien stellt dieses Zwei-Stufen-Modell von Verstehen und Validieren jedoch direkt oder indirekt in Frage. Insbesondere Befunde zu Stroop-artigen Stimulus-Antwort-Kompatibilitätseffekten, die auftreten, wenn positive und negative Antworten orthogonal zum aufgaben-irrelevanten Wahrheitsgehalt von Sätzen abgegeben werden müssen (z.B. eine positive Antwort nach dem Lesen eines falschen Satzes oder eine negative Antwort nach dem Lesen eines wahren Satzes; epistemischer Stroop-Effekt, Richter et al., 2009), sprechen dafür, dass Leser/innen schon beim Verstehen eine nicht-strategische Überprüfung der Validität von Informationen vornehmen. Ausgehend von diesen Befunden war das Ziel dieser Dissertation eine weiterführende Überprüfung der Annahme, dass Verstehen einen nicht-strategischen, routinisierten, wissensbasierten Validierungsprozesses (epistemisches Monitoring; Richter et al., 2009) beinhaltet. Zu diesem Zweck wurden drei empirische Studien mit unterschiedlichen Schwerpunkten durchgeführt. Studie 1 diente der Untersuchung der Fragestellung, ob sich Belege für epistemisches Monitoring auch bei Informationen finden lassen, die nicht eindeutig wahr oder falsch, sondern lediglich mehr oder weniger plausibel sind. Mithilfe des epistemischen Stroop-Paradigmas von Richter et al. (2009) konnte ein Kompatibilitätseffekt von aufgaben-irrelevanter Plausibilität auf die Latenzen positiver und negativer Antworten in zwei unterschiedlichen experimentellen Aufgaben nachgewiesen werden, welcher dafür spricht, dass epistemisches Monitoring auch graduelle Unterschiede in der Übereinstimmung von Informationen mit dem Weltwissen berücksichtigt. Darüber hinaus belegen die Ergebnisse, dass der epistemische Stroop-Effekt tatsächlich auf Plausibilität und nicht etwa auf der unterschiedlichen Vorhersagbarkeit von plausiblen und unplausiblen Informationen beruht. Das Ziel von Studie 2 war die Prüfung der Hypothese, dass epistemisches Monitoring keinen evaluativen Mindset erfordert. Im Gegensatz zu den Befunden anderer Autoren (Wiswede, Koranyi, Müller, Langner, & Rothermund, 2013) zeigte sich in dieser Studie ein Kompatibilitätseffekt des aufgaben-irrelevanten Wahrheitsgehaltes auf die Antwortlatenzen in einer vollständig nicht-evaluativen Aufgabe. Die Ergebnisse legen nahe, dass epistemisches Monitoring nicht von einem evaluativen Mindset, möglicherweise aber von der Tiefe der Verarbeitung abhängig ist. Studie 3 beleuchtete das Verhältnis von Verstehen und Validieren anhand einer Untersuchung der Online-Effekte von Plausibilität und Vorhersagbarkeit auf Augenbewegungen beim Lesen kurzer Texte. Zusätzlich wurde die potentielle Modulierung dieser Effeke durch epistemische Marker, die die Sicherheit von Informationen anzeigen (z.B. sicherlich oder vielleicht), untersucht. Entsprechend der Annahme eines schnellen und nicht-strategischen epistemischen Monitoring-Prozesses zeigten sich interaktive Effekte von Plausibilität und dem Vorhandensein epistemischer Marker auf Indikatoren früher Verstehensprozesse. Dies spricht dafür, dass die kommunizierte Sicherheit von Informationen durch den Monitoring-Prozess berücksichtigt wird. Insgesamt sprechen die Befunde gegen eine Konzeptualisierung von Verstehen und Validieren als nicht-überlappenden Stufen der Informationsverarbeitung. Vielmehr scheint eine Bewertung des Wahrheitsgehalts oder der Plausibilität basierend auf dem Weltwissen – zumindest in gewissem Ausmaß – eine obligatorische und nicht-strategische Komponente des Sprachverstehens zu sein. Die Bedeutung der Befunde für aktuelle Modelle des Sprachverstehens und Empfehlungen für die weiterführende Forschung zum Vehältnis von Verstehen und Validieren werden aufgezeigt.