Untersuchungen zur Rolle von Isoformen katalytischer Untereinheiten der PKA

ZUSAMMENFASSUNG: Proteinkinasen übernehmen zentrale Aufgaben in der Signaltransduktion höherer Zellen. Dabei ist die cAMP-abhängige Proteinkinase (PKA) bezüglich ihrer Struktur und Funktion eine der am besten charakterisierten Proteinkinasen. Trotzdem ist wenig über direkte Interaktionspartner der katalytischen Untereinheiten (PKA-C) bekannt. In einem Split-Ubiquitin basiertem Yeast Two Hybrid- (Y2H-)System wurden potenzielle Interaktionspartner der PKA-C identifiziert. Als Bait wurden sowohl die humane Hauptisoform Cα (hCα) als auch die Proteinkinase X (PrKX) eingesetzt. Nach der Bestätigung der Funktionalität der PKA-C-Baitproteine, dem Nachweis der Expression und der Interaktion mit dem bekannten Interaktionspartner PKI wurde ein Y2H-Screen gegen eine Mausembryo-cDNA-Expressionsbibliothek durchgeführt. Von 2*10^6 Klonen wurden 76 Kolonien isoliert, die ein mit PrKX interagierendes Preyprotein exprimierten. Über die Sequenzierung der enthaltenen Prey-Vektoren wurden 25 unterschiedliche, potenzielle Interaktionspartner identifiziert. Für hCα wurden über 2*10^6 S. cerevisiae-Kolonien untersucht, von denen 1.959 positiv waren (1.663 unter erhöhter Stringenz). Über die Sequenzierung von ca. 10% der Klone (168) konnten Sequenzen für 67 verschiedene, potenzielle Interaktionspartner der hCα identifiziert werden. 15 der Preyproteine wurden in beiden Screens identifiziert. Die PKA-C-spezifische Wechselwirkung der insgesamt 77 Preyproteine wurde im Bait Dependency Test gegen largeT, ein Protein ohne Bezug zum PKA-System, untersucht. Aus den PKA-C-spezifischen Bindern wurden die löslichen Preyproteine AMY-1, Bax72-192, Fabp3, Gng11, MiF, Nm23-M1, Nm23-M2, Sssca1 und VASP256-375 für die weitere in vitro-Validierung ausgewählt. Die Interaktion von FLAG-Strep-Strep-hCα (FSS-hCα) mit den über Strep-Tactin aus der rekombinanten Expression in E. coli gereinigten One-STrEP-HA-Proteinen (SSHA-Proteine) wurde über Koimmunpräzipitation für SSHA-Fabp3, -Nm23-M1, -Nm23-M2, -Sssca1 und -VASP256-375 bestätigt. In SPR-Untersuchungen, für die hCα kovalent an die Oberfläche eines CM5-Sensorchips gekoppelt wurde, wurden die ATP/Mg2+-Abhängigkeit der Bindungen sowie differentielle Effekte der ATP-kompetitiven Inhibitoren H89 und HA-1077 untersucht. Freie hCα, die vor der Injektion zu den SSHA-Proteinen gegeben wurde, kompetierte im Gegensatz zu FSS-PrKX die Bindung an die hCα-Oberfläche. Erste kinetische Analysen lieferten Gleichgewichtsdissoziationskonstanten im µM- (SSHA-Fabp3, -Sssca1), nM- (SSHA-Nm23-M1, –M2) bzw. pM- (SSHA-VASP256-375) Bereich. In funktionellen Analysen konnte eine Phosphorylierung von SSHA-Sssca1 und VASP256-375 durch hCα und FSS-PrKX im Autoradiogramm nachgewiesen werden. SSHA-VASP256-375 zeigte zudem eine starke Inhibition von hCα im Mobility Shift-Assay. Dieser inhibitorische Effekt sowie die hohe Affinität konnten jedoch auf eine Kombination aus der Linkersequenz des Vektors und dem N-Terminus von VASP256-375 zurückgeführt werden. Über die Wechselwirkungen der hier identifizierten Interaktionspartner Fabp3, Nm23-M1 und Nm23-M2 mit hCα können in Folgeuntersuchungen neue PKA-Funktionen insbesondere im Herzen sowie während der Zellmigration aufgedeckt werden. Sssca1 stellt dagegen ein neues, näher zu charakterisierendes PKA-Substrat dar.

Identifizierung und funktionelle Charakterisierung neuer A-Kinase-Ankerproteine (AKAPs) im Modellorganismus C. elegans

In dieser Arbeit sollten neue Interaktionspartner der regulatorischen Untereinheit (R-UE) der Proteinkinase A (PKA) und des Modellorganismus C. elegans identifiziert und funktionell charakterisiert werden. Im Gegensatz zu Säugern (vier Isoformen), exprimiert der Nematode nur eine PKA-R-Isoform. Mittels in silico Analysen und so genannten „Pulldown“ Experimenten, wurde insbesondere nach A Kinase Ankerproteinen (AKAP) in C. elegans gesucht. Aus in silico Recherchen resultiert das rgs5 Protein als mögliches Funktionshomolog des humanen AKAP10. Rgs5 enthält eine potenzielle, amphipathische Helix (AS 421-446, SwissProt ID A9Z1K0), die in Peptide-SPOT-Arrays (durchgeführt im Biotechnologie Zentrum in Oslo, AG Prof. K. Taskén) eine Bindung an RI und RII-UE zeigt. Eine ähnliche Lokalisation von rgs5 und hAKAP10 in der Zelle, sowie vergleichende BRET² Studien, weisen auf eine mögliche Funktionshomologie zwischen AKAP10 und rgs5 hin. Die hier durchgeführten Analysen deuten darauf hin, dass es sich bei rgs5 um ein neues, klassisches AKAP mit „RII bindender Domäne“ Motiv im Modellorganismus C. elegans handelt. Basierend auf so genannten „pulldown“ Versuchen können, neben „klassischen“ AKAPs (Interaktion über amphipathische Helices), auch Interaktionspartner ohne typische Helixmotive gefunden werden. Dazu gehört auch RACK1, ein multifunktionales Protein mit 7 WD40 Domänen, das ubiquitär exprimiert wird und bereits mehr als 70 Interaktionspartner in unterschiedlichsten Signalwegen komplexiert (Adams et al., 2011). Durch BRET² Interaktionsstudien und Oberflächenplasmonresonanz (SPR) Analysen konnten hRI und kin2 als spezifische Interaktionspartner von RACK1 verifiziert werden. Untersuchungen zur Identifikation der Interaktionsflächen der beiden Proteine RACK1 und hRI zeigten im BRET² System, dass RACK1 über die WD40 Domänen 1-2 und 6-7 interagiert. Die Analyse unterschiedlicher hRI-Deletionsmutanten deutet auf die DD-Domäne im N-Terminus und zusätzlich auf eine potenzielle BH3 Domäne im C-Terminus des Proteins als Interaktionsfläche mit RACK1 hin. Die Koexpression von hRI BH3 und RACK1 zeigt einen auffälligen ein Phänotyp in Cos7 Zellen. Dieser zeichnet sich unter anderem durch eine Degradation des Zellkerns, DNA Kondensation und eine starke Vakuolisierung aus, was beides als Anzeichen für einen programmierten Zelltod interpretiert werden könnte. Erste Untersuchungen zum Mechanismus des ausgelösten Zelltods deuten auf eine Caspase unabhängige Apoptose (Paraptose) hin und einen bislang unbekannten Funktionsmechanismus der PKA hin.

Structural insights into the allosteric activation mechanism of cGMP-dependent protein kinase I

Cyclic GMP-dependent protein kinase (PKG) is a key transducer in the NO-cGMP signaling pathway. In this line, PKG has been considered an important drug target for treating hypertensive cardiovascular and pulmonary diseases. However, the investigation of PKG’s allosteric activation mechanism has been hampered by a lack of structural information. One of the fundamental questions on the cGMP-dependent activation of PKG is how the enzyme can distinguish cGMP over cAMP and selectively respond to cGMP. To ensure proper signaling, PKG must have developed unique features to ensure its activation upon the right activation signal. In this thesis, the cGMP-selective activation mechanism of PKG was studied through determining crystal structures of three truncated constructs of the regulatory domain [CNB-A (92-227), CNB-B (271-369), and CNB-A/B (92-351)] of PKG Iβ in the absence or presence of cyclic nucleotides. Herein, two individual CNB domain structures with biochemical data revealed that the C-terminal CNB domain (CNB-B) is responsible for cGMP selectivity, while the N-terminal CNB-domain (CNB-A) has a higher binding affinity for both cGMP and cAMP without showing any selectivity. Based on these crystal structures, mutagenesis studies were performed in which the critical residues for cyclic nucleotide selectivity and activation were identified. Furthermore, we discovered that the conformational changes of the C-terminal helix of the CNB-B that bridges between the regulatory and catalytic domains including the hydrophobic capping interaction are crucial for PKG activation. In addition, to observe the global conformation of the activated R-domain, I solved a co-crystal structure of the CNB-A/B with cGMP. Although a monomeric construct was crystallized, the structure displays a dimer. Strikingly, the CNB-A domain and its bound cGMP provide a key interface for this dimeric interaction. Using small angle X-ray scattering (SAXS), the existence of the cGMP-mediated dimeric interface within the CNB domains was confirmed. Furthermore, measuring cGMP-binding affinities (EC50) of the dimeric interface mutants as well as determining activation constants (Ka) revealed that the interface formation is important for PKG activation. To conclude, this thesis study provides a new mechanistic insight in PKG activation along with a newly found interface that can be targeted for designing PKG-specific activity modulators.