Die Rolle des Zelladh��sionsmolek��ls L1 in der Tumorprogression

Das neuronale Adh��sionsmolek��l L1 wird neben den Zellen des Nervensystems auf vielen humanen Tumoren exprimiert und ist dort mit einer schlechten Prognose f��r die betroffenen Patienten assoziiert. Zus��tzlich zu seiner Funktion als Oberfl��chenmolek��l kann L1 durch membranproximale Spaltung in eine l��sliche Form ��berf��hrt werden. In der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss von L1 auf die Motilit��t von Tumorzellen untersucht. L��sliches L1 aus Asziten f��hrte zu einer Integrin-vermittelten Zellmigration auf EZM-Substraten. Derselbe Effekt wurde durch ��berexpression von L1 in Tumorlinien beobachtet. Weiterhin f��hrt die L1-Expression zu einer erh��hten Invasion, einem verst��rkten Tumorwachstum in NOD/SCID M��usen und zur konstitutiven Aktivierung der MAPK ERK1/2. Eine Mutation in der zytoplasmatischen Dom��ne von hL1 (Thr1247Ala/Ser1248Ala)(hL1mut) f��hrte hingegen zu einer Blockade dieser Funktionen. Dies weist daraufhin, dass nicht nur l��sliches L1, sondern auch die zytoplasmatische Dom��ne von L1 funktionell aktiv ist. Im zweiten Teil der Arbeit wurde der Mechanismus, der L1-vermittelten Signaltransduktion untersucht. Die zytoplasmatische Dom��ne von L1 gelangt nach sequenzieller Proteolyse durch ADAM und Presenilin-abh��ngiger ��-Sekretase Spaltung in den Zellkern. Diese Translokation im Zusammenspiel mit der Aktivierung der MAPK ERK1/2 durch L1-Expression f��hrt zu einer L1-abh��ngigen Genregulation. Die zytoplasmatische Dom��ne von hL1mut konnte ebenfalls im Zellkern detektiert werden, vermittelte jedoch keine Genregulation und unterdr��ckte die ERK1/2 Phosphorylierung. Die L1-abh��ngige Induktion von ERK1/2-abh��ngigen Genen wie Cathepsin B, ��3 Integrin und IER 3 war in Zellen der L1-Mutante unterdr��ckt. Die Expression des Retins��ure-bindenden Proteins CRABP-II, welches in hL1 Zellen supprimiert wird, wurde in der L1-Mutante nicht ver��ndert. Weitere biochemische Untersuchungen zeigen, dass die zytoplasmatische Dom��ne von L1 Komplexe mit Transkriptionsfaktoren bilden kann, die an Promoterregionen binden k��nnen. Die dargestellten Ergebnisse belegen, dass L1-Expression in Tumoren an drei Funktionen beteiligt ist; (i) L1 erh��ht Zellmotilit��t, (ii) f��rdert Tumorprogression durch Hochregulation von pro-invasiven und proliferationsf��rdernden Genen nach Translokation in den Nukleus und (iii) sch��tzt die Zellen mittels Regulation pro- bzw. anti-apoptotischer Gene vor Apoptose. Die mutierte Phosphorylierungsstelle im L1-Molek��l ist essentiell f��r diese Prozesse. Die Anwendung neuer Therapien f��r Patienten mit L1-positiven Karzinomen kann mit Hinblick auf die guten Erfolge der Antik��rper-basierenden Therapie mit dem mAk L1-11A diskutiert werden.

Studies of cap-independent mRNA translation in Drosophila melanogaster

Control of protein synthesis is a key step in the regulation of gene expression during apoptosis and the heat shock response. Under such conditions, cap-dependent translation is impaired and Internal Ribosome Entry Site (IRES)-dependent translation plays a major role in mammalian cells. Although the role of IRES-dependent translation during apoptosis has been mainly studied in mammals, its role in the translation of Drosophila apoptotic genes has not been yet studied. The observation that the Drosophila mutant embryos for the cap-binding protein, the eukaryotic initiation factor eIF4E, exhibits increased apoptosis in correlation with up-regulated proapoptotic gene reaper (rpr) transcription constitutes the first evidence for the existence of a cap-independent mechanism for the translation of Drosophila proapoptotic genes. The mechanism of translation of rpr and other proapoptotic genes was investigated in this work. We found that the 5 UTR of rpr mRNA drives translation in an IRES-dependent manner. It promotes the translation of reporter RNAs in vitro either in the absence of cap, in the presence of cap competitors, or in extracts derived from heat shocked and eIF4E mutant embryos and in vivo in cells transfected with reporters bearing a non functional cap structure, indicating that cap recognition is not required in rpr mRNA for translation. We also show that rpr mRNA 5 UTR exhibits a high degree of similarity with that of Drosophila heat shock protein 70 mRNA (hsp70), an antagonist of apoptosis, and that both are able to conduct IRES-mediated translation. The proapoptotic genes head involution defective (hid) and grim, but not sickle, also display IRES activity. Studies of mRNA association to polysomes in embryos indicate that both rpr, hsp70, hid and grim endogenous mRNAs are recruited to polysomes in embryos in which apoptosis or thermal stress was induced. We conclude that hsp70 and, on the other hand, rpr, hid and grim which are antagonizing factors during apoptosis, use a similar mechanism for protein synthesis. The outcome for the cell would thus depend on which protein is translated under a given stress condition. Factors involved in the differential translation driven by these IRES could play an important role. For this purpose, we undertook the identification of the ribonucleoprotein (RNP) complexes assembled onto the 5 UTR of rpr mRNA. We established a tobramycin-affinity-selection protocol that allows the purification of specific RNP that can be further analyzed by mass spectrometry. Several RNA binding proteins were identified as part of the rpr 5 UTR RNP complex, some of which have been related to IRES activity. The involvement of one of them, the La antigen, in the translation of rpr mRNA, was established by RNA-crosslinking experiments using recombinant protein and rpr 5 UTR and by the analysis of the translation efficiency of reporter mRNAs in Drosophila cells after knock down of the endogenous La by RNAi experiments. Several uncharacterized proteins were also identified, suggesting that they might play a role during translation, during the assembly of the translational machinery or in the priming of the mRNA before ribosome recognition. Our data provide evidence for the involvement of La antigen in the translation of rpr mRNA and set a protocol for purification of tagged-RNA-protein complexes from cytoplasmic extracts. To further understand the mechanisms of translation initiation in Drosophila, we analyzed the role of eIF4B on cap-dependent and cap-independent translation. We showed that eIF4B is mostly involved in cap-, but not IRES-dependent translation as it happens in mammals.

Characterization of the role of Drosophila JAK/STAT signalling in cellular proliferation

Der Janus Kinase / signal transducer and activator of transcription (JAK/STAT) Signal- transduktionsweg wird f��r viele Entwicklungsvorg��nge ben��tigt und spielt eine zentrale Rolle bei der H��matopoese und bei der Immunantwort. Obwohl der JAK/STAT-Signalweg in den vergangenen Jahren Gegenstand intensiver Forschung war, erschwert die Redundanz des Signalwegs bei Wirbeltieren genetische Untersuchungen zur Identifizierung derjenigen Mechanismen, die den JAK/STAT-Signalweg regulieren. Der JAK/STAT-Signaltransduktionsweg ist evolution��r konserviert und ebenfalls bei der Taufliege Drosophila melanogaster vorhanden. Im Gegensatz zu Wirbeltieren ist der Signaltransduktionsweg von Drosophila weniger redundant und beinhaltet folgende Hauptkomponenten: den Liganden Unpaired (Upd), den Transmembranrezeptor Domeless (Dome), die einzige JAK-Tyrosinkinase Hopscotch (hop), sowie den Transkriptionsfaktor STAT92E. In der vorliegenden Arbeit wird die Rolle des JAK/STAT-Signalwegs bei der zellul��ren Proliferation mithilfe der Modellsysteme der Fl��gel- und der Augen-Imaginalscheiben von Drosophila charakterisiert. "Loss-of-function"- und "Gain-of-function"-Experimente zur Verminderung beziehungs-weise Erh��hung der Signalaktivit��t zeigten, dass der JAK/STAT-Signalweg eine Rolle bei der zellul��ren Proliferation der Fl��gel-Imaginalscheiben spielte, ohne die Zellgr����e oder Apoptose zu ver��ndern. Bei der Fl��gelentwicklung w��hrend des zweiten und des fr��hen dritten Larvalstadiums war die Aktivit��t des JAK/STAT-Signalwegs sowohl notwendig f��r die zellul��re Proliferation als auch hinreichend, um ��berproliferation anzutreiben. Allerdings ��nderte sich w��hrend der sp��ten dritten Larvalstadien die JAK/STAT-Signalaktivit��t, sodass endogene STAT92E-Mengen einen anti-proliferativen Effekt im gleichen Gewebe aufwiesen. Weiterhin reichte die ektopische Aktivierung des JAK/STAT-Signalwegs zu diesem sp��ten Entwicklungszeitpunkt aus, um die Mitose zu inhibieren und die Zellen in der Phase G2 des Zellzyklus zu arretieren. Diese Ergebnisse legen den Schluss nahe, dass der JAK/STAT-Signalweg sowohl pro-proliferativ in fr��hen Fl��gelscheiben als auch anti-proliferativ zu sp��ten Stadien der Fl��gelscheiben-Entwicklung wirken kann. Dieser sp��te anti-proliferative Effekt wurde durch einen nicht-kanonischen Mechanismus der STAT92E-Aktivierung vermittelt, da sp��te hop defiziente Zellverb��nde im Vergleich zu Wildtyp-Zellen keine Ver��nderungen im Ausma�� der zellul��ren Proliferation aufwiesen. Ferner konnte gezeigt werden, dass eine w��hrend der Larvalstadien exprimierte dominant-negative und im N-Terminus deletierte Form von STAT92E (?NSTAT92E) nicht f��r den anti-proliferativen Effekt verantwortlich ist. Diese Tatsache ist ein weiteres Indiz daf��r, dass das vollst��ndige STAT92E den sp��ten anti-proliferativen Effekt verursacht. Um Modulatoren f��r die von JAK/STAT vermittelte zellul��re Proliferation zu identifieren, wurde ein P-Element-basierter genetischer Interaktions-Screen in einem sensibilisierten genetischen Hintergrund durchgef��hrt. Insgesamt wurden dazu 2267 unabh��ngige P-Element-Insertionen auf ihre Wechselwirkung mit der JAK/STAT-Signalaktivit��t untersucht und 24 interagierende Loci identifiziert. Diese Kandidaten k��nnen in folgende Gruppen eingeordnet werden: Zellzyklusproteine, Transkriptionsfaktoren, DNA und RNA bindende Proteine, ein Mikro-RNA-Gen, Komponenten anderer Signaltransduktionswege und Zelladh��sionsproteine. In den meisten F��llen wurden mehrere Allele der interagierenden Kandidatengene getestet. 18 Kandidatengene mit ��bereinstimmend interagierenden Allelen wurden dann zur weiteren Analyse ausgew��hlt. Von diesen 18 Kandidaten-Loci wurden 7 m��gliche JAK/STAT-Signalwegskomponenten und 6 neue Zielgene des Signalwegs gefunden. Zusammenfassend wurde das Verst��ndnis um STAT92E verbessert. Dieses Protein hat die gleiche Funktion wie das STAT3-Protein der Wirbeltiere und treibt die zellul��re Proliferation voran. Analog zu STAT1 hat STAT92E aber auch einen anti-proliferativen Effekt. Ferner wurden 24 m��gliche Modulatoren der JAK/STAT-Signalaktivit��t identifiziert. Die Charakterisierung dieser Wechselwirkungen er��ffnet vielversprechende Wege zu dem Verst��ndnis, wie JAK/STAT die zellul��re Proliferation reguliert und k��nnte bei der Entwicklung von neuartigen therapeutischen Targets zur Behandlung von Krebskrankheiten und Entwicklungsst��rungen beitragen.

Identifizierung und funktionelle Charakterisierung neuer A-Kinase-Ankerproteine (AKAPs) im Modellorganismus C. elegans

In dieser Arbeit sollten neue Interaktionspartner der regulatorischen Untereinheit (R-UE) der Proteinkinase A (PKA) und des Modellorganismus C. elegans identifiziert und funktionell charakterisiert werden. Im Gegensatz zu S��ugern (vier Isoformen), exprimiert der Nematode nur eine PKA-R-Isoform. Mittels in silico Analysen und so genannten ���Pulldown��� Experimenten, wurde insbesondere nach A Kinase Ankerproteinen (AKAP) in C. elegans gesucht. Aus in silico Recherchen resultiert das rgs5 Protein als m��gliches Funktionshomolog des humanen AKAP10. Rgs5 enth��lt eine potenzielle, amphipathische Helix (AS 421-446, SwissProt ID A9Z1K0), die in Peptide-SPOT-Arrays (durchgef��hrt im Biotechnologie Zentrum in Oslo, AG Prof. K. Task��n) eine Bindung an RI und RII���-UE zeigt. Eine ��hnliche Lokalisation von rgs5 und hAKAP10 in der Zelle, sowie vergleichende BRET�� Studien, weisen auf eine m��gliche Funktionshomologie zwischen AKAP10 und rgs5 hin. Die hier durchgef��hrten Analysen deuten darauf hin, dass es sich bei rgs5 um ein neues, klassisches AKAP mit ���RII bindender Dom��ne��� Motiv im Modellorganismus C. elegans handelt. Basierend auf so genannten ���pulldown��� Versuchen k��nnen, neben ���klassischen��� AKAPs (Interaktion ��ber amphipathische Helices), auch Interaktionspartner ohne typische Helixmotive gefunden werden. Dazu geh��rt auch RACK1, ein multifunktionales Protein mit 7 WD40 Dom��nen, das ubiquit��r exprimiert wird und bereits mehr als 70 Interaktionspartner in unterschiedlichsten Signalwegen komplexiert (Adams et al., 2011). Durch BRET�� Interaktionsstudien und Oberfl��chenplasmonresonanz (SPR) Analysen konnten hRI��� und kin2 als spezifische Interaktionspartner von RACK1 verifiziert werden. Untersuchungen zur Identifikation der Interaktionsfl��chen der beiden Proteine RACK1 und hRI��� zeigten im BRET�� System, dass RACK1 ��ber die WD40 Dom��nen 1-2 und 6-7 interagiert. Die Analyse unterschiedlicher hRI���-Deletionsmutanten deutet auf die DD-Dom��ne im N-Terminus und zus��tzlich auf eine potenzielle BH3 Dom��ne im C-Terminus des Proteins als Interaktionsfl��che mit RACK1 hin. Die Koexpression von hRI��� BH3 und RACK1 zeigt einen auff��lligen ein Ph��notyp in Cos7 Zellen. Dieser zeichnet sich unter anderem durch eine Degradation des Zellkerns, DNA Kondensation und eine starke Vakuolisierung aus, was beides als Anzeichen f��r einen programmierten Zelltod interpretiert werden k��nnte. Erste Untersuchungen zum Mechanismus des ausgel��sten Zelltods deuten auf eine Caspase unabh��ngige Apoptose (Paraptose) hin und einen bislang unbekannten Funktionsmechanismus der PKA hin.