Vergleichende Untersuchungen Methicillin-resistenter Staphylococcus aureus des Klinikums Kassel der Jahre 1999 bis 2004

Die vorliegende Arbeit liefert erstmals einen umfassenden Überblick über die molekulare Epidemiologie von Methicillin resistenten Staphylococcus aureus (MRSA) eines nordhessischen Krankenhauses inklusive seines Umfeldes und deren Entwicklung in einem Zeitraum von fünf Jahren. Von besonderer Bedeutung ist, dass die MRSA-Stämme hierfür nicht nur anhand ihrer SCCmec-Region (staphylococcal cassette chromosome) typisiert wurden, sondern eine weitergehende Charakterisierung auf Grund der Bestimmung des Vorkommens von Antibiotikaresistenz- und Toxingenen, sowie Plasmiden erfolgte. Dabei wurde ein neuer SCCmec-Typ entdeckt und charakterisiert und weitere noch unbekannte SCCmec-Elemente beschrieben. Bei der Charakterisierung der MRSA-Kollektive konnten bzgl. aller untersuchten Eigenschaften im Laufe der Zeit signifikante Veränderungen beobachtet werden. Am deutlichsten waren diese Unterschiede zwischen dem ältesten Kollektiv aus 1999 und allen nachfolgenden Kollektiven. Die Kollektive aus 2001, 2002, 2003 und 2004 zeigten untereinander größere Ähnlichkeiten, aber dennoch gleichzeitig eine tendenziell divergente Entwicklung einzelner Eigenschaften. Besonders auffallend war das dominante Auftreten von SCCmecIV mit 63-87% der Isolate eines Kollektivs ab 2001, gegenüber 16% in 1999. Weiterhin erfolgte eine markante Veränderung im Vorkommen einzelner Antibiotikaresistenzgene von 1999 bis 2004. So waren aacA-aphD und ermA bei MRSA aus 1999 mit 84% bzw. 90% deutlich häufiger als in allen Kollektiven der folgenden Jahre (aacA-aphD: max. 32%, ermA: max. 40%). Wohingegen ermC ein stets zunehmendes Vorkommen von 3% auf 67% über den Untersuchungszeitraum zeigte. Unkontinuierliches aber statistisch relevant vermehrtes Auftreten von tetM konnte bei Isolaten aus 1999 (40%) und 2004 (74%) nachgewiesen werden. Auch bei Toxingenen zeigten sich deutliche Unterschiede in der zeitlichen Verteilung. Ab 2001 zeigten alle Isolate wesentlich höhere Anteile an sec, seg und sei verglichen mit den MRSA aus 1999. So konnte sec im Kollektiv aus 1999 gar nicht nachgewiesen werden, in denen der Folgejahre mit 54-77%. Die Werte für seg und sei stiegen von 48% bzw. 41% in 1999 kontinuierlich auf über 90% in 2004. Die Häufigkeit von MRSA sowohl mit mehreren Resistenzgenen als auch die mit mehreren Toxingenen nahm im Laufe der Zeit zu und korrelierte mit dem Vorkommen von Plasmiden. Bezüglich seiner Korrelation mit den vorkommenden Plasmiden zeigte SCCmecIV im Erhebungszeitraum besonders deutlich eine Veränderung. So nahm über den Zeitraum der Beobachtung die Anzahl der Stämme die zusätzlich zu einem großen Plasmid ein weiteres kleines Plasmid besaßen signifikant zu. Auch beim Vergleich der SCCmec-Typen der MRSA-Isolate konnten Unterschiede bzgl. aller weiteren untersuchten Eigenschaften dargestellt werden. So zeigten z.B. alle SCCmecIIIA das sea-Gen, während dies bei allen anderen in der vorliegenden Arbeit untersuchten SCCmec-Typen nur vereinzelt vorkam. SCCmecII-Stämme wiesen sowohl die meisten Antibiotikaresistenz- als auch Toxingene auf. Es wurde ferner gezeigt, dass Stämme mit vielen Resistenzgenen auch eine hohe Anzahl Toxingene besaßen und dies im Zusammenhang mit einem erhöhten Plasmidgehalt stehen könnte. Aus den MRSA-Kollektiven isolierte Plasmide konnten aufgrund von Restriktionsanalysen als verwandt zu β-Laktamase-Plasmiden des Grundtyps pI524 und pI258 beschrieben werden. Der in vorliegender Arbeit gezeigte Zusammenhang zwischen der Anzahl von direct repeat units (dru) in der Hypervariablen Region (HVR) und dem SCCmec-Typ half den Unterschied zwischen SCCmecIV und SCCmecIVA, sowie die Sonderstellung des in vorliegender Arbeit erstmalig beschriebenen SCCmecIA/II darzustellen. Nicht alle Isolate konnten einem bekannten SCCmec-Typ zugeordnet werden, es handelt sich bei diesen Ausnahmen um weitere noch unbekannte und hier erstmalig beschriebene SCCmec-Typen. Aufgrund der vorliegenden Arbeit konnte ein neuer SCCmec-Typ definiert werden, namentlich der Typ SCCmecIA/II, der seit 1999 in der Region gehäuft vorkommt Die vorliegenden Untersuchungen zeigten somit, dass die Epidemiologie von MRSA der Region Nordhessen trotz bestehender Gemeinsamkeiten zur MRSA-Situation in ganz Deutschland auch Besonderheiten aufweist. Diese nun zu kennen kann einen Beitrag zur gezielten Verbesserung bisheriger Maßnahmen zur Ausbreitungskontrolle von MRSA in der nordhessischen Region leisten.

HelF und sein Interaktionspartner Xrn1: zwei Regulatoren der RNA-Interferenz in D. discoideum

Hauptziel dieser Arbeit ist die Identifizierung, Verifizierung und Charakterisierung von Interaktionspartnern von HelF, einem Negativregulator der RNA-Interferenz in Dictyostelium discoideum (Popova et al. 2006). Es ist gelungen, die Interaktion von HelF und der 5‘ 3‘ Exonuklease Xrn1 nachzu-weisen, aber alle anderen Versuchen, bisher unbekannte Protein-Interaktionspartner zu identifizieren, schlugen fehl. Xrn1 ist in den Organismen D. melanogaster (Orban und Izaurralde 2005), C. elegans (Newbury und Woollard 2004) und A. thaliana (Gazzani et al. 2004) bereits als Regulator der RNA-Interferenz bekannt. Mit Aufreinigungen nach der TAP-Methode und mit dem Nanotrap wurde ebenfalls versucht, RNA-Interaktionspartner von HelF zu identifizieren. Es konnten in einigen Aufreinigungen putative, für HelF spezifische RNAs identifiziert werden, doch entweder es handelte sich nachweislich nicht um RNA oder die Reproduktion der Daten schlug trotz mehrfacher Versuche fehl. Bezüglich der zellulären Lokalisation von HelF und Xrn1 konnte gezeigt werden, dass HelF zusätzlich zur bekannten Lokalisation in Foci im Nukleus (Popova et al. 2006) vermutlich auch im Cytoplasma und dort angeordnet in mehreren Granula zu finden ist. Xrn1 ist nahezu ausschließlich im Cytoplasma lokalisiert, wo es in mehreren Foci organisiert ist. Es wird vermutet, dass es sich bei diesen Foci um Processing-Bodies (P-Bodies) handelt und dass möglicherweise Xrn1 und HelF in eben diesen P-Bodies co-lokalisieren. In der Entwicklung vom Einzeller zum mehrzelligen Organismus zeigen die Xrn1KO- und die HelFKO-Mutante jeweils einen eindeutigen Phänotyp, der vom Wildtyp abweicht. Die Phänotypen der beiden Mutanten unterscheiden sich deutlich voneinander. Beim Mischen von HelF-Knockout-Zellen mit grün fluoreszierenden Wildtyp-Zellen zeigt sich, dass beide Stämme innerhalb des sich entwickelnden Organismus an definierten Stellen lokalisieren. Entgegen den Erwartungen befinden sich die Zellen der Mutante in den Stadien „Finger“ und „Slug“ nicht hauptsächlich im vorderen Teil des Organismus, sondern sind auch im hinteren Teil, der später die Sporenmasse bildet, vertreten. Dies lässt vermuten, dass HelF-Knockout-Mutanten in gleichem Maße wie Wildtypzellen als Sporen in die nächste Generation übergehen. Weitere Mix-Experimente, in denen HelFKO-Zellen und Xrn1KO-Zellen mit grün fluoreszierenden Wildtypzellen gemischt wurden, belegen eindeutig, dass beide Knockoutmutanten in Konkurrenz zum Wildtyp bei der Generierung von Sporen und somit beim Übergang in die nächste Generation benachteiligt sind. Dies steht im Gegensatz zu den Ergebnissen der vorher beschriebenen Mix-Experimente, in denen der Organismus als Ganzes betrachtet wurde. Weiterhin konnte herausgefunden werden, dass Xrn1 ebenso wie HelF (Popova et al. 2006) eine Rolle als Negativregulator in der RNA-Interferenz innehat. Fraglich ist aber, ob HelF wie bisher angenommen auch Einfluss auf den Weg der Generierung von miRNAs nimmt, da in HelFKO für keinen der beiden miRNA-Kandidaten eine Hoch- bzw. Runterregulierung der reifen miRNAs im Vergleich zum Wildtyp beobachtet werden kann. Im Xrn1KO hingegen ist die reife miRNA ddi-mir-1176 im Vergleich zum Wildtyp hochreguliert. In Bezug auf die Generierung von siRNAs konnte herausgefunden werden, dass Xrn1 und HelF im Fall der Generierung von Skipper siRNAs regulierend eingreifen, dass aber nicht alle siRNAs von der negativen Regulierung durch HelF und Xrn1betroffen sind, was am Beispiel der DIRS-1-siRNAs belegt werden kann. Das von B. Popova entwickelte Modell (Popova 2005) bezüglich der Rolle von HelF in der RNA-Interferenz wurde basierend auf den neu gewonnenen Daten weiterentwickelt und um Xrn1 ergänzt, um die Funktionen von HelF und Xrn1 als Antagonisten der RNA-Interferenz näher zu beleuchten. Literatur: Gazzani, S., T. Lawrenson, et al. (2004). "A link between mRNA turnover and RNA interference in Arabidopsis." Science 306(5698): 1046-8. Newbury, S. and A. Woollard (2004). "The 5'-3' exoribonuclease xrn-1 is essential for ventral epithelial enclosure during C. elegans embryogenesis." Rna 10(1): 59-65. Orban, T. I. and E. Izaurralde (2005). "Decay of mRNAs targeted by RISC requires XRN1, the Ski complex, and the exosome." Rna 11(4): 459-69. Popova, B. (2005). HelF, a suppressor of RNAi mediated gene silencing in Dictyostelium discoideum. Genetik. Kassel, Universität Kassel. PhD: 200. Popova, B., M. Kuhlmann, et al. (2006). "HelF, a putative RNA helicase acts as a nuclear suppressor of RNAi but not antisense mediated gene silencing." Nucleic Acids Res 34(3): 773-84.