Untersuchungen über die Redoxregulation der Glutathionsynthese und Charakterisierung von Glutaredoxinen in Spinat

Die an der Glutathionsynthese im Chloroplasten von Spinatblättern beteiligten Enzyme sind auf eine lichtabhängige Regulation durch Thioredoxine (Trx) und Glutaredoxine (Grx) hin untersucht worden. Dazu wurde eine neue, vereinfachte Methode zur Aktivitätsbestimmung für die gamma-Glutamylcystein- und Glutathionsynthetase auf der Kapillarelektrophorese entwickelt. Untersuchungen mit den homologen Thioredoxinen Trx m und Trx f aus Spinatchloroplasten und mit dem E.coli Trx und E.coli Grx 1 zeigten, dass bei beiden Enzymen keine Redoxmodulation durch diese Proteine stattfindet. Weitere Untersuchungen mit der Glutathionsynthetase zeigten keinen Einfluss von Dithiothreit, Sulfit-Ionen und Ascorbat auf die Enzymaktivität. Nur H2O2, in unphysiologischen Konzentrationen, bewirkte eine leichte Abnahme der Ausgangsaktivität. Im Fall der gamma-Glutamylcysteinsynthetase konnten verschiedene Einflüsse ausgemacht werden. So war mit Dithiothreit und H2O2 bei niedrigen Konzentrationen eine Stimulation und bei höheren Konzentration eine Inhibition der Enzymaktivität festzustellen: Sulfit-Ionen zeigten eine starke Stimulierung der gamma-Glutamylcysteinsynthetase über einen weiten Konzentrationsbereich, wobei eine starke pH-Wert-Abhängigkeit der Stimulation zu beobachten war. Ascorbat zeigte, wie bei der Glutathionsynthetase, keinen Einfluss auf die Enzymaktivität der gamma-Glutamyl-cysteinsynthetase. In einem zweiten Teil der Arbeit über die Glutaredoxine des Spinats konnte ein 12,4 kDa Protein mit Thioltransferase-Aktivität, das bisher als cytosolisches Glutaredoxin beschrieben wurde, aufgereinigt und mittels N-terminaler Sequenzierung eindeutig als ein Glutaredoxin identifiziert werden. Überdies konnte ein noch nicht beschriebenes 12,8 kDa Protein mit Thioltransferase-Aktivität aus Spinatchloroplasten aufgereinigt werden. Durch Peptid-Sequenzierung gelang es dieses Protein auch als ein Glutaredoxin zu identifizieren. Beide pflanzlichen Glutaredoxine zeigten keine Modulation der Aktivitäten der chloroplastidären Fructosebisphosphatase (FbPase) und NADPH-Malatdehydrogenase (NADPH-MDH). Auch war mit beiden Glutaredoxinen keine Dehydroascorbatreduktase-Aktivität, oder eine Stimulation der Ribonucleotidreduktase aus Lactobacillus leichmannii festzustellen.

Untersuchungen zur Eliminierung und Resorption von Zink aus Säugerspermatozoen während der Nebenhodenpassage

Während der Spermatogenese wird das Element Zink an die Sulfhydrylreste der Cysteine in den Mantelfaserproteinen der Spermienflagellen gebunden. So kann in den noch unreifen Mantelfasern die ungerichtete Ausbildung von Disulfidbrücken verhindert werden. Im Zuge der Spermatozoenreifung während der Nebenhodenpassage wird dieses Zink androgenabhängig zu einem hohen Prozentsatz wieder eliminiert. Die nun gerichtete Ausbildung von Disulfidbrücken ermöglicht die Versteifung der Mantelfasern. Diese Rigidität stellt die Voraussetzung zur progressiven Motilität dar, ohne die eine Fertilisierung der Eizelle im weiblichen Genitaltrakt nicht möglich ist. Da eine negative Korrelation zwischen dem Zinkgehalt von Flagellen und ihrer Motilität besteht (Henkel et al., 1999), hat die Zinkeliminierung während der Nebenhodenpassage eine entscheidende Bedeutung in der Entwicklung der Spermatozoen. Die vorliegende Arbeit untersucht die Mechanismen der epididymalen Zinkeliminierung sowie die an diesem Prozess beteiligten Komponenten und den Verbleib des eliminierten Zinks am System des Bullen, der Ratte und des Menschen. Mittels proteinchemischer Verfahren kann im bovinen System ein zinkbindendes 60 kDa-Protein als Albumin identifiziert werden. Ein 80 kDa-Protein mit zinkbindenden Eigenschaften bleibt unidentifiziert. Die Zinkbindungskapazität der fraktionierten Proteine ist dabei im Caput epididymidis am stärksten ausgeprägt. Atomabsorptionsspektralphotometrische Untersuchungen zeigen die höchsten flagellären Zinkwerte in den Spermien des Rete testis und eine Abnahme des Zinkgehalts zwischen Nebenhodenkopf und -körper. Durch Autometallographie kann eine epitheliale Zinkresorption im Nebenhodenschwanz nachgewiesen werden. Dort erfolgt auch die basale Anreicherung des Zinks. Am Zinkstoffwechsel scheint auch der Macrophage Migration Inhibitory Factor (MIF) beteiligt zu sein. Dieser ist ein Zytokin mit Oxidoreduktasecharakter und kommt unter anderem im Nebenhodenepithel sowie in den Vesikeln des Nebenhoden-Fluids der Ratte vor. MIF zeigt in den hier durchgeführten Untersuchungen sowohl in systemhomologer, als auch in rekombinanter Form in vitro eine Zink-eliminierende Wirkung auf Rattenspermatozoen des Caputs und der Cauda epididymidis und hat somit möglicherweise Einfluss auf den Reifungsprozess der Spermien im Nebenhoden. Lit.: Henkel R, Bittner J, Weber R, Hüther F, Miska W (1999). Relevance of zinc in human sperm flagella and its relation to motility. Fertil Steril 71: 1138-1143

Das OEE-Protein 1 des Photosystem II (oxygen evolving enhancer) der Grünalge Scenedesmus obliquus besitzt Thioredoxin-Aktivität

Die Aminosäure-Sequenzierung an dem als "28 kDa-Thioredoxin f" beschriebenen Protein aus der Grünalge Scenedesmus obliquus hat gezeigt, dass dieses Protein mit dem als OEE bekannten Protein 1 aus dem Photosystem II identisch ist. Die früher postulierte Möglichkeit einer Fusion eines Thioredoxins mit einem Protein unbekannter Natur oder Insertion eines Thioredoxinfragments mit der typischen -Trp-Cys-Gly-Pro-Cys-Sequenz in ein solches Protein hat sich nicht bestätigt. Durch Anwendung einer auf das 33 kDa OEE-Protein ausgerichteten Präparationsmethode konnte gezeigt werden, dass das "28 kDa-Trx f" tatsächlich in den Thylakoidmembranen lokalisiert ist. Das Protein kann so innerhalb eines Tages in hoher Reinheit aus den Thylakoidmembranfragmenten eines Algenrohhomogenats isoliert werden; dabei bleibt die Fähigkeit des OEE-Proteins das chloroplastidäre Enzym Fructosebisphosphatase (FbPase) zu stimulieren erhalten. Mit gleichen Methoden wurden die Grünalgen Chlorella vulgaris und Chlamydomonas reinhardtii auf außergewöhnliche Proteine mit Trx-f Aktivität untersucht. Die hitze- und säurestabile Proteinfraktion aus Chlorella vulgaris enthält ein Protein mit vergleichbarer Molmasse von 26 kDa, das ähnlich wie in Scenedesmus eine Stimulation der chloroplastidären Fructosebisphosphatase zeigt. In dem hitze- und säurestabilen Proteinextrakt aus Chlamydomonas reinhardtii wird solche Aktivität nicht beobachtet. Eine Probe des rekombinanten, homogenen OEE-Proteins aus Spinat wurde auf Stimulation der chloroplastidären FbPase und NADPH-abhängigen Malatdehydrogenase (MDH) untersucht. Das Spinat OEE-Protein 1 zeigt mit diesen Enzymen keine Aktivität. Da das OEE-Protein 1 in Scenedesmus starke FbPase-Stimulation zeigt, die anderen Scenedesmus-Thioredoxine mit Molmassen von 12 kDa (Trx I und II) jedoch hohe Aktivität mit der zellulären Ribonucleotidreduktase zeigen, wird postuliert, dass das OEE-Protein die Funktion des Trx-f in vivo ersetzt.

Das ER-lokalisierte Protein Farinelli und seine möglichen Interaktionspartner in der Spermatogenese von Drosophila melanogaster

Dem Farinelli-Protein wird eine Funktion als hodenspezifisches VAP-Protein zugesprochen (Renner, 2001). Mit Hilfe des ER-Markers PDI konnte Fan eindeutig dem ER zugeordnet werden. Fan stellt dabei ein integrales Membranprotein dar, welches nur durch Detergenz- Behandlung in Lösung zu bringen war. Durch den Einsatz zweier Fragment-Konstrukte (fan∆MSP-GFP und fanMSP-GFP) von Fan wurde die Relevanz der MSP-Domäne für die männliche Fertilität dokumentiert. Das Fusionsprotein Fan∆MSP-GFP lag aufgrund der verbliebenen Transmembrandomäne weiterhin im ER vor. Dennoch konnte der sterile Phänotyp der fanJo-Männchen, die keinerlei Fan-Protein enthalten, durch das Einbringen des Fusionskonstrukts nicht gerettet werden. MSP-GFP für sich allein konnte keine Verbindung mit dem ER eingehen und zeigte eine diffuse Fluoreszenz. Im Rahmen der Dissertation wurden mehrere, durch das yeast two hybrid-System ermittelte, mögliche Interaktionspartner von Fan analysiert. Das Protein CG5194 konnte als einziges wie Fan dem ER zugeordnet werden. Seine Expression beschränkte sich aber auf die Spermatocytenphase und ist somit kürzer als die von Farinelli. Nach Einkreuzen der GFP-Fusionskonstrukte in die fan-Nullmutante konnte CG5194 nicht mehr am ER der Spermatocyten beobachtet werden, sondern lag innerhalb des Cytoplasmas diffus verteilt vor. Auch bei der Western Blot-Analyse konnte das Protein von CG5194 nur noch in der Überstand-Fraktion mit den ungebundenen Proteinen nachgewiesen werden. Lag in der fan-Nullmutante ausschließlich das Fan∆MSP-GFP-Fusionsprotein vor, konnte die ER-Lokalisation von CG5194 ebenfalls nicht beibehalten werden. Mit Hilfe einer Fragment-Analyse konnte gezeigt werden, dass in den männlichen Gonaden das erste Exon von CG5194 für die Interaktion mit Fan entscheidend ist. Innerhalb der Ovarien dagegen ist das zweite Exon für die Lokalisation im ER notwendig. Demzufolge ist neben einem anderen Interaktionspartner als Fan auch eine andere Domäne im Protein für die ER-Lokalisation in der weiblichen Keimbahn entscheidend. Durch den Einsatz von antisense- und RNAi-Konstrukten konnte ein steriler Phänotyp bei den Männchen erzeugt werden. Überraschenderweise zeigten die Tiere erst einen Defekt während der Spermatiden-Differenzierung. Bereits während der Diplomarbeit wurde 98A im Kopfbereich der elongierten Spermatiden nachgewiesen. Mittels einer DNA-Färbung sowie durch die Colokalisation mit dem Akrosom-Protein Sneaky wurde 98A dem Bereich des Akrosoms zugeordnet. Sneaky taucht jedoch bereits früher als 98A in den Keimzellen auf. Die Erzeugung eines sterilen Phänotyps durch den Einfluss eines RNAi-Konstrukts gelang nicht. Entweder ist 98A für die Fertilität von Drosophila nicht relevant oder aber seine Funktion kann von anderen Proteinen übernommen werden.