Genregulation in der Drosophila Spermatogenese am Beispiel der Mst(3)CGP-Genfamilie

In dieser Dissertation wird die Rolle des zentralen Kontrollelementes TCE auf unterschiedlichen Ebenen der Genexpression untersucht. Das TCE verhindert die Translation prämeiotisch gebildeter mRNAs in der Spermatogenese von Drosophila bis zu einem späten postmeiotischen Stadium. Gleichzeitig provoziert es Transkriptionsaktivität. Das TCE wurde zunächst in einer kleinen Genfamilie identifiziert und am Beispiel des Gens Mst87F detaillierter untersucht. In EMSA-Experimenten wurde die Komplexbildung mit regulatorischen Proteinen aus Proteinextrakten des Hodengewebes am TCE der Mst87F mRNA nachgewiesen. Massenspektrometrische Analysen ergaben u.a. die Kandidatenproteine Exuperantia (Exu), dFmr1 und CG3213. Die Komplexbildung an einem zweiten Mitglied der Genfamilie - Mst98Ca -, welches sich in der Genstruktur und dem Proteinaufbau von Mst87F unterscheidet, belegt die Allgemeingültigkeit dieser Interaktion. Beim Einsatz von veränderten TCE-Sequenzen ergibt sich ein abweichendes Erscheinungsbild der Komplexe, was mit dem Verlust der Funktion korreliert. Auch die Komplexbildung mit den rekombinanten Proteinen von exuperantia und dfmr1 erfolgt an beiden RNAs in gleicher Weise. In Kombination wird ein stärkerer Shift erzeugt. In einer Exu-defizienten Mutante beobachtet man drastische Veränderungen in der Lokalisation von einem Mst87F-GFP- bzw. CG3213-GFP-Fusionsprotein. Analysen mittels der qPCR zeigen eine drastische Verringerung der Mst87F mRNA Menge. Beides lässt vermuten, dass das Fehlen von Exu bereits in frühen Stadien zu molekularen Defekten führt. Um die Translationskontrolle zu umgehen, wurden Transgene mit einer IRES (aus dem Gen reaper) an verschiedenen Positionen des 5'UTRs erzeugt. Die erwartete Translationsinitiation durch die IRES blieb aus. Northern- und qPCR-Analysen zeigen eine starke Reduktion des mRNA-Niveaus. Somit kann aufgrund der drastischen Deregulation auf Transkriptionsebene der Effekt auf die Translationskontrolle nicht mehr analysiert werden. Überraschenderweise wurden durch die Verwendung einer anderen IRES (aus der Genkassette CG31311) die Expressionscharakteristika des Ursprungsgens auf Mst87F übertragen. Das Fusionsprotein lässt sich plötzlich in den Ommatidien der Komplexaugen nachweisen. Da aus früheren Arbeiten bereits eine Rolle des TCE auf Transkriptionsebene nachgewiesen ist, wurde die Komplexbildung auf Mst87F-DNA-Fragmente mit TCE ausgedehnt. Analysen unter Verwendung der rekombinanten Proteine Exu und dFmr1 verliefen negativ. Daraufhin sollten massenspektrometrische Experimente neue Kandidaten für regulatorische Proteine auf DNA-Ebene identifizieren. Von vier weiteren Kandidaten zeigen zwei unter RNAi-Einfluß komplette Sterilität und starke Defekte in der Spermienentwicklung.

Analysen der beiden cis-regulierenden Sequenzelemente translational control element (TCE) und cytoplasmic polyadenylation element (CPE) in der Drosophila-Spermatogenese

Ein essentieller Bestandteil in dem Mechanismus der Translationskontrolle sind RNA-Pro­tein-Wechselwirkungen. Solche Interaktionen konnten in Translationssystemen an zwei unabhängigen cis-regulierenden Elementen durch in vitro-Bindungsanalysen mit individu­ellen rekombinanten Proteinen dokumentiert werden. Im Fall des translational control elements (TCE), welches ein konserviertes Sequenz-Ele­ment in der Mst(3)CGP-Genfamilie darstellt, wird eine negative Translationskontrolle durch die Bindung der Proteine CG3213, CG12470, CG1898, dFMR1, Exuperantia und Orb2 an diese Sequenz vermittelt (Stinski, 2011). Neben den in Bindungsstudien positiv getesteten Kandidaten dFMR1 und Orb2 (Stinski, 2011) wurde in der vorliegenden Dis­sertation CG3213 als weiterer direkter Bindungspartner an das TCE dokumentiert. Ein Abgleich der genomweiten Zusammenstellung von Proteininteraktionen in der Datenbank InterologFinder lieferte zwei weitere potentielle Kandidaten: CG34404 und CG3727. Al­lerdings schließen Northern-Analysen und das Proteinexpressionsmuster eine zentrale Rolle in der Drosophila-Spermatogenese für diese nahezu aus. In Kolokalisationsstudien einiger TCE-Komplex-Kandidaten mit CG3213 als Referenz konnten eindeutige Überein­stimmungen der Fluoreszenzmuster mit CG12470 in der postmeiotischen Phase be­schrieben werden, wohingegen mit Orb2 (postmeiotisch) und CG1898 (prämeiotisch) nur eine geringe Kolokalisation erkannt wurde. Punktstrukturen in den Verteilungsmustern sowohl von CG3213 als auch von CG12470 ließen sich nicht mit ER- und mitochondrien­spezifischen Markern korrelieren. Im Anschluss der Meiose konnte eine deutliche Intensitätserhöhung des CG3213-Proteins beobachtet werden, was eventuell durch eine veränderte Translationseffizienz zustande kommen könnte. Exuperantia (Exu) stellt einen bekannten Regulator für eine Reihe von translationskontrollierten mRNAs dar (Wang und Hazelrigg, 1994). Die Quantifizierungen der CG3213-mRNA in exu-mutantem Hintergrund bestätigen, dass auch die Transkript­menge der CG3213-mRNA durch Exu reguliert wird, was die obige Interpretation stützen würde. Für das zweite cis-regulierende Element, das cytoplasmic polyadenylation element (CPE), konnte eine direkte Bindung mit dem CPEB-Homolog in Drosophila (Orb2) gezeigt wer­den, welches auch eine Komponente des mst87F-RNP-Komplexes ist. Ein vermuteter Interaktionspartner dieses CPEBs ist Tob, weshalb die Verteilung beider Proteine in einem Kombinationsstamm verglichen wurde. In dem teilweise übereinstimmenden Fluoreszenz­muster ist Tob an den distalen Spermatidenenden auffallend konzentriert. Das gesamte Tob-Muster jedoch legt eine Verteilung in den Mitochondrien nahe, wie die MitoTracker®-Färbung belegt. Somit wurde erstmals ein Mitglied der Tob/BTG-Genfamilie in der Droso­phila-Spermatogenese mit Mitochondrien in Verbindung gebracht. Die Lokalisierung die­ser Proteine ist bislang unklar, jedoch konnte eine Kernlokalisation trotz der N-terminalen NLS-Sequenz mit Hilfe einer Kernfärbung ausgeschlossen werden.

Variationelle Zeitdiskretisierungen höherer Ordnung der Konvektions-Diffusions-Reaktions-Gleichungen in zeitabhängigen Gebieten

Wir betrachten zeitabhängige Konvektions-Diffusions-Reaktions-Gleichungen in zeitabhängi- gen Gebieten, wobei die Bewegung des Gebietsrandes bekannt ist. Die zeitliche Entwicklung des Gebietes wird durch die ALE-Formulierung behandelt, die die Nachteile der klassischen Euler- und Lagrange-Betrachtungsweisen behebt. Die Position des Randes und seine Geschwindigkeit werden dabei so in das Gebietsinnere fortgesetzt, dass starke Gitterdeformationen verhindert werden. Als Zeitdiskretisierungen höherer Ordnung werden stetige Galerkin-Petrov-Verfahren (cGP) und unstetige Galerkin-Verfahren (dG) auf Probleme in zeitabhängigen Gebieten angewendet. Weiterhin werden das C 1 -stetige Galerkin-Petrov-Verfahren und das C 0 -stetige Galerkin- Verfahren vorgestellt. Deren Lösungen lassen sich auch in zeitabhängigen Gebieten durch ein einfaches einheitliches Postprocessing aus der Lösung des cGP-Problems bzw. dG-Problems erhalten. Für Problemstellungen in festen Gebieten und mit zeitlich konstanten Konvektions- und Reaktionstermen werden Stabilitätsresultate sowie optimale Fehlerabschätzungen für die nachbereiteten Lösungen der cGP-Verfahren und der dG-Verfahren angegeben. Für zeitabhängige Konvektions-Diffusions-Reaktions-Gleichungen in zeitabhängigen Gebieten präsentieren wir konservative und nicht-konservative Formulierungen, wobei eine besondere Aufmerksamkeit der Behandlung der Zeitableitung und der Gittergeschwindigkeit gilt. Stabilität und optimale Fehlerschätzungen für die in der Zeit semi-diskretisierten konservativen und nicht-konservativen Formulierungen werden vorgestellt. Abschließend wird das volldiskretisierte Problem betrachtet, wobei eine Finite-Elemente-Methode zur Ortsdiskretisierung der Konvektions-Diffusions-Reaktions-Gleichungen in zeitabhängigen Gebieten im ALE-Rahmen einbezogen wurde. Darüber hinaus wird eine lokale Projektionsstabilisierung (LPS) eingesetzt, um der Konvektionsdominanz Rechnung zu tragen. Weiterhin wird numerisch untersucht, wie sich die Approximation der Gebietsgeschwindigkeit auf die Genauigkeit der Zeitdiskretisierungsverfahren auswirkt.