Physiological analysis of central and peripheral insect circadian pacemaker neurons

Alle bisher untersuchten Lebewesen besitzen (circadiane) innere Uhren, die eine endogene Perioden-länge von ungefähr 24 Stunden generieren. Eine innere Uhr kann über Zeitgeber mit der Umwelt synchronisiert werden und ermöglicht dem Organismus, rhythmische Umweltveränderungen vorweg zu nehmen. Neben einem zentralen Schrittmacher, der Physiologie und Verhalten des Organismus steuert, gibt es in unterschiedlichen Organen auch periphere Uhren, die die zeitlichen Abläufe in der spezifischen Funktion dieser Organe steuern. In dieser Arbeit sollten zentrale und periphere Schrittmacherneurone von Insekten physiologisch untersucht und verglichen werden. Die Neurone der akzessorischen Medulla (AME) von Rhyparobia maderae dienten als Modellsystem für zentrale Schrittmacher, während olfaktorische Rezeptorneurone (ORNs) von Manduca sexta als Modellsystem für periphere Schrittmacher dienten. Die zentralen Schrittmacherneurone wurden in extrazellulären Ableitungen an der isolierten AME (Netzwerkebene) und in Patch-Clamp Experimenten an primären AME Zellkulturen (Einzelzellebene) untersucht. Auf Netzwerkebene zeigten sich zwei charakteristische Aktivitätsmuster: regelmäßige Aktivität und Wechsel zwischen hoher und niedriger Aktivität (Oszillationen). Es wurde gezeigt, dass Glutamat ein Neurotransmitter der weitverbreiteten inhibitorischen Synapsen der AME ist, und dass in geringem Maße auch exzitatorische Synapsen vorkommen. Das Neuropeptid pigment-dispersing factor (PDF), das von nur wenigen AME Neuronen exprimiert wird und ein wichtiger Kopplungsfaktor im circadianen System ist, führte zu Hemmungen, Aktivierungen oder Oszillationen. Die Effekte waren transient oder langanhaltend und wurden wahrscheinlich durch den sekundären Botenstoff cAMP vermittelt. Ein Zielmolekül von cAMP war vermutlich exchange protein directly activated by cAMP (EPAC). Auf Einzelzellebene wurde gezeigt, dass die meisten AME Neurone depolarisiert waren und deshalb nicht feuerten. Die Analyse von Strom-Spannungs-Kennlinien und pharmakologische Experimente ergaben, dass unterschiedliche Ionenkanäle vorhanden waren (Ca2+, Cl-, K+, Na+ Kanäle sowie nicht-spezifische Kationenkanäle). Starke, bei hohen Spannungen aktivierende Ca2+ Ströme (ICa) könnten eine wichtige Rolle bei Ca2+-abhängiger Neurotransmitter-Ausschüttung, Oszillationen, und Aktionspotentialen spielen. PDF hemmte unterschiedliche Ströme (ICa, IK und INa) und aktivierte nicht-spezifische Kationenströme (Ih). Es wurde angenommen, dass simultane PDF-abhängige Hyper- und Depolarisationen rhythmische Membranpotential-Oszillationen verursachen. Dieser Mechanismus könnte eine Rolle bei PDF-abhängigen Synchronisationen spielen. Die Analyse peripherer Schrittmacherneurone konzentrierte sich auf die Charakterisierung des olfaktorischen Corezeptors von M. sexta (MsexORCO). In anderen Insekten ist ORCO für die Membran-Insertion von olfaktorischen Rezeptoren (ORs) erforderlich. ORCO bildet Komplexe mit den ORs, die in heterologen Expressionssystemen als Ionenkanäle fungieren und Duft-Antworten vermitteln. Es wurde die Hypothese aufgestellt, dass MsexORCO in pheromonsensitiven ORNs in vivo nicht als Teil eines ionotropen Rezeptors sondern als Schrittmacherkanal fungiert, der unterschwellige Membranpotential-Oszillationen generiert. MsexORCO wurde mit vermeintlichen Pheromonrezeptoren in human embryonic kidney (HEK 293) Zellen coexprimiert. Immuncytochemie und Ca2+ Imaging Experimente zeigten sehr schwache Expressionsraten. Trotzdem war es möglich zu zeigen, dass MsexORCO wahrscheinlich ein spontan-aktiver, Ca2+-permeabler Ionenkanal ist, der durch den ORCO-Agonisten VUAA1 und cyclische Nucleotide aktiviert wird. Außerdem wiesen die Experimente darauf hin, dass MsexOR-1 offensichtlich der Bombykal-Rezeptor ist. Eine weitere Charakterisierung von MsexORCO in primären M. sexta ORN Zellkulturen konnte nicht vollendet werden, weil die ORNs nicht signifikant auf ORCO-Agonisten oder -Antagonisten reagierten.

Interferometrische Sensoren mit Modulation der optischen Weglänge für die Fertigungsmesstechnik

Ziel dieser Dissertation ist es, eine Klasse interferometrischer Messgeräte zu charakterisieren und weiter zu entwickeln. Die Modulation der optischen Weglänge (OPLM) im Referenzarm eines interferometrischen Messsystems ist ein anpassungsfähiger Ansatz. Sie ist zur Messung von Oberflächenprofilen mit einer Auflösung bis in den sub-nm-Bereich bei einem Messbereich von bis zu 100 Mikrometer geeignet. Wird ein statisches Messobjekt gemessen, tritt durch die Modulation im Referenzarm am Detektor ein periodisches Interferenzmuster auf. Dies ist in der unten stehenden Abbildung schematisch dargestellt. Bei einer Veränderung des Abstandes zwischen Objekt und Messgerät kann aus der Phasen- und/oder Hüllkurvenverschiebung im Interferenzmuster die Abstandsänderung abgeleitet werden.Im Rahmen der Arbeit sind zwei funktionsfähige OPLM-Messsysteme entwickelt, aufgebaut und getestet worden. Diese demonstrieren, dass der OPLM-Ansatz ein breites Spektrum an Anwendungen durch eine optische Messung abdecken kann. Allerdings zeigen sich an den Messsystemen auch die Limitierungen des OPLM-Ansatzes. Die Systeme basieren auf einer Punktmessung mittels einer fasergekoppelten Sonde sowie auf einer linienförmigen Messung durch eine Zeilenkamera. Um eine hohe laterale Auflösung zu erzielen, wird die Zeilenkamera mit einem Mikroskop kombiniert. Damit flächenhaft gemessen werden kann, ist es notwendig, Messobjekt und Sensor zueinander zu verschieben. Daher wird eine Theorie entwickelt, unter welchen Randbedingungen bewegte Objekte von einem OPLM-Messsystem aufgelöst werden können. Die Theorie wird anschließend experimentell überprüft und bestätigt. Für die Auswertung der bei der Modulation der optischen Weglänge entstehenden Interferenzen existieren bereits einige erprobte Algorithmen, welche auf ihre Eignung hin untersucht und mit selbst entwickelten Algorithmen verglichen werden. Auch wird darauf eingegangen, welches die zentralen Herausforderungen bei der Planung von OPLM-Interferometern sind und wie sich insbesondere die Wahl des Aktors für die OPLM auf das gesamte Messsystem auswirkt. Bei den beiden Messsystemen werden jeweils wichtige Komponenten wie analoge Elektronik und Aktorik sowie ihre Funktionsweise erläutert. Es wird detailliert beschrieben, wie ein OPLM-Messsystem charakterisiert und kalibriert werden muss, um möglichst zuverlässige Messwerte zu liefern. Abschließend werden die Möglichkeiten der beiden entwickelten Systeme durch Beispielmessungen demonstriert, sowie ihre Messgenauigkeit charakterisiert.