Electrophysiological analysis of the olfactory signal transduction cascade in the hawkmoth Manduca sexta

Neben der Verbreitung von gefährlichen Krankheiten sind Insekten für enorme agrarwirtschaftliche Schäden verantwortlich. Ein Großteil der Verhaltensweisen bei Insekten wird über den Geruchssinn gesteuert, der somit einen möglichen Angriffspunkt zur Bekämpfung von Schadinsekten darstellt. Hierzu ist es allerdings nötig, die Mechanismen der olfaktorischen Signalübertragung im Detail zu verstehen. Neben den duftstoffbindenden olfaktorischen Rezeptoren spielt hier auch ein konservierter Korezeptor (Orco) eine entscheidende Rolle. Inwieweit bei diesen Proteinen ionotrope bzw. metabotrope Prozesse involviert sind ist bislang nicht vollständig aufgeklärt. Um weitere Einzelheiten aufzuklären wurden daher Einzelsensillenableitungen am Tabakschwärmer Manduca sexta durchgeführt. Orco-Agonisten und Antagonisten wurden eingesetzt, um die Funktion des Korezeptors besser zu verstehen. Bei dem Einsatz des Orco-Agonisten VUAA1 konnte keine Verstärkung der Pheromonantworten bzw. eine Sensitivierung beobachtet werden, wie im Falle einer ionotropen Signalweiterleitung zu erwarten gewesen wäre. Ein ionotroper Signalweg über den OR/Orco-Komplex in M. sexta ist daher unwahrscheinlich. Der Orco-Antagonist OLC15 beeinflusste die gleichen Parameter wie VUAA1 und konnte die von VUAA1 generierte Spontanaktivität blocken. Daher ist es wahrscheinlich, dass dieser einen spezifischen Orco-Blocker darstellt. Sowohl VUAA1 als auch OLC15 hatten großen Effekt auf die langanhaltende Pheromonantwort, welches die Vermutung nahelegt, dass Orco modulierend auf die Sensitivität der Nervenzelle einwirkt. Von OLC15 abweichende Effekte durch die getesteten Amiloride HMA und MIA auf die Pheromonantwort lassen nicht auf eine spezifische Wirkung dieser Agenzien auf Orco schließen und zusätzliche Wirkorte sind anzunehmen. Um die These eines metabotropen Signalwegs zu überprüfen wurde ebenfalls der G-Protein-Blocker GDP-β-S eingesetzt. Alle Parameter der Pheromonantwort die innerhalb der ersten Millisekunden analysiert wurden wiesen eine Reduktion der Sensitivität auf. Im Gegensatz dazu hatte GDP-β-S keinen Effekt auf die langanhaltende Pheromonantwort. Somit scheint ausschließlich die schnelle Pheromonantwort über einen Ligand-bindenden G-Protein-gesteuerten Rezeptor gesteuert zu werden.

Synthese, Struktur und Eigenschaften mehrfach funktionalisierter Alkinylsilane

Die vorgelegte Arbeit beschäftigt sich mit der Synthese alkinsubstituierter Silane. Die dafür erforderliche Gratwanderung zwischen organischer und anorganischer Chemie bringt Herausforderungen in der gezielten Synthese mehrfachalkinierter Silane mit sich. Hauptgebiet der vorgestellten neuen Synthesewege stellt die Darstellung relativ kleiner Polyethinylsilane dar. Angefangen bei der Etablierung allgemein gültiger Synthesevorschriften für die bisher noch sehr gering erforschten Oligochlorethinylsilane wird in weiterer Folge Wert darauf gelegt, aus diesen neuen Verbindungen über Derivatisierung weitere wertvolle Synthone der Synthesechemie zu gewinnen. Über die vorgestellten Verfahren wird so der Zugang zu Polyethinylsilanen auf neuem Wege mit deutlich verbesserter Anwendbarkeit und Ausbeute ebenso etabliert, wie die ersten Vertreter der Oligobromethinylsilane und Polyphosphanoethinylsilane. Diese Verbindungen wurden sowohl bezüglich ihrer NMR-spektroskopischen, vibronischen und strukturellen Eigenschaften charakterisiert und der weiteren Verwendung zugänglich gemacht. Ein direkter Vergleich der neu dargestellten Verbindungen untereinander als auch mit anderen Alkinylsilanen wird ebenfalls beschrieben. Neben der Synthese von Polyalkinylsilanen wurden zusätzlich anderweitige Alkinylsilane vorgestellt. So wurde eine Methode zur zielgerichteten Kupplung sterisch gehinderter Chlorsilane etabliert, aber auch ein möglicher Zugang zu verschiedenen, alkinverbrückten Chlorsilanen unter gezielter Phenolatsubstitution dargelegt.

Transport magnetischer Partikel durch maßgeschneiderte magnetische Feldlandschaften zur Anwendung in mikrofluidischen Mischprozessen

Die Miniaturisierung von konventioneller Labor- und Analysetechnik nimmt eine zentrale Rolle im Bereich der allgemeinen Lebenswissenschaften und medizinischen Diagnostik ein. Neuartige und preiswerte Technologieplattformen wie Lab-on-a-Chip (LOC) oder Mikrototalanalysesysteme (µTAS) versprechen insbesondere im Bereich der Individualmedizin einen hohen gesellschaftlichen Nutzen zur frühzeitigen und nichtinvasiven Diagnose krankheitsspezifischer Indikatoren. Durch den patientennahen Einsatz preiswerter und verlässlicher Mikrochips auf Basis hoher Qualitätsstandards entfallen kostspielige und zeitintensive Zentrallaboranalysen, was gleichzeitig Chancen für den globalen Einsatz - speziell in Schwellen- und Entwicklungsländern - bietet. Die technischen Herausforderungen bei der Realisierung moderner LOC-Systeme sind in der kontrollierten und verlässlichen Handhabung kleinster Flüssigkeitsmengen sowie deren diagnostischem Nachweis begründet. In diesem Kontext wird der erfolgreichen Integration eines fernsteuerbaren Transports von biokompatiblen, magnetischen Mikro- und Nanopartikeln eine Schlüsselrolle zugesprochen. Die Ursache hierfür liegt in der vielfältigen Einsetzbarkeit, die durch die einzigartigen Materialeigenschaften begründet sind. Diese reichen von der beschleunigten, aktiven Durchmischung mikrofluidischer Substanzvolumina über die Steigerung der molekularen Interaktionsrate in Biosensoren bis hin zur Isolation und Aufreinigung von krankheitsspezifischen Indikatoren. In der Literatur beschriebene Ansätze basieren auf der dynamischen Transformation eines makroskopischen, zeitabhängigen externen Magnetfelds in eine mikroskopisch veränderliche potentielle Energielandschaft oberhalb magnetisch strukturierter Substrate, woraus eine gerichtete und fernsteuerbare Partikelbewegung resultiert. Zentrale Kriterien, wie die theoretische Modellierung und experimentelle Charakterisierung der magnetischen Feldlandschaft in räumlicher Nähe zur Oberfläche der strukturierten Substrate sowie die theoretische Beschreibung der Durchmischungseffekte, wurden jedoch bislang nicht näher beleuchtet, obwohl diese essentiell für ein detailliertes Verständnis der zu Grunde liegenden Mechanismen und folglich für einen Markteintritt zukünftiger Geräte sind. Im Rahmen der vorgestellten Arbeit wurde daher ein neuartiger Ansatz zur erfolgreichen Integration eines Konzepts zum fernsteuerbaren Transport magnetischer Partikel zur Anwendung in modernen LOC-Systemen unter Verwendung von magnetisch strukturierten Exchange-Bias (EB) Dünnschichtsystemen verfolgt. Die Ergebnisse zeigen, dass sich das Verfahren der ionenbe-schussinduzierten magnetischen Strukturierung (IBMP) von EB-Systemen zur Herstellung von maßgeschneiderten magnetischen Feldlandschaften (MFL) oberhalb der Substratoberfläche, deren Stärke und räumlicher Verlauf auf Nano- und Mikrometerlängenskalen gezielt über die Veränderung der Materialparameter des EB-Systems via IBMP eingestellt werden kann, eignet. Im Zuge dessen wurden erstmals moderne, experimentelle Verfahrenstechniken (Raster-Hall-Sonden-Mikroskopie und rastermagnetoresistive Mikroskopie) in Kombination mit einem eigens entwickelten theoretischen Modell eingesetzt, um eine Abbildung der MFL in unterschiedlichen Abstandsbereichen zur Substratoberfläche zu realisieren. Basierend auf der quantitativen Kenntnis der MFL wurde ein neuartiges Konzept zum fernsteuerbaren Transport magnetischer Partikel entwickelt, bei dem Partikelgeschwindigkeiten im Bereich von 100 µm/s unter Verwendung von externen Magnetfeldstärken im Bereich weniger Millitesla erzielt werden können, ohne den magnetischen Zustand des Substrats zu modifizieren. Wie aus den Untersuchungen hervorgeht, können zudem die Stärke des externen Magnetfelds, die Stärke und der Gradient der MFL, das magnetfeldinduzierte magnetische Moment der Partikel sowie die Größe und der künstlich veränderliche Abstand der Partikel zur Substratoberfläche als zentrale Einflussgrößen zur quantitativen Modifikation der Partikelgeschwindigkeit genutzt werden. Abschließend wurde erfolgreich ein numerisches Simulationsmodell entwickelt, das die quantitative Studie der aktiven Durchmischung auf Basis des vorgestellten Partikeltransportkonzepts von theoretischer Seite ermöglicht, um so gezielt die geometrischen Gegebenheiten der mikrofluidischen Kanalstrukturen auf einem LOC-System für spezifische Anwendungen anzupassen.

Mechanismen kleiner regulatorischer RNAs in Dictyostelium discoideum: Charakterisierung und Anwendung

Die RNA-Interferenz (RNAi) ist ein in Eukaryoten weit verbreiteter Mechanismus, der die transkriptionelle oder posttranskriptionelle Stilllegung von Genen beschreibt. Die Spezifität wird dabei durch die Sequenz einer kleinen, nicht-kodierenden RNA gewährleistet. Diese RNA leitet einen Effektorkomplex, dessen Zentrum immer von einem Argonautenprotein gebildet wird, üblicherweise zu einer komplementären mRNA. In der Folge kommt es zum Abbau des Transkripts oder zur Inhibierung der Translation. Aktuelle Veröffentlichungen konnten zudem das Aktivitätsprofil der Argonautenproteine beträchtlich erweitern: Im Zellkern vorkommende Argonautenproteine wurden beispielsweise mit Spleißvorgängen, der Promotorkontrolle von Genen und der DNA-Reparatur in Verbindung gebracht. In den letzten Jahren konnten weitreichende Kenntnisse bezüglich der Kontrolle einiger transposabler Elemente durch RNAi sowie der Biogenese kleiner regulatorischer RNAs in Dictyostelium discoideum und anderen Organismen gewonnen werden. Ein Fokus dieser Arbeit lag zunächst auf der Charakterisierung des Argonautenproteins AgnB und der Identifikation von Interaktionspartnern. Es konnte gezeigt werden, dass AgnB zumindest partiell im Zellkern der Amöbe lokalisiert und dort vermutlich regulatorische Aufgaben wahrnimmt. Gestützt wurde diese Annahme durch die massenspektrometrische und Western Blot basierte Detektion nukleärer Bindungspartner. Weiterführende Analysen konnten AgnB zudem als positiven Regulator für drei entwicklungsregulierte Gene beschreiben und so die Verbindung zum Prozess der RNA activation in der Amöbe herstellen. Identifizierte posttranslationale Modifikationen könnten diesbezüglich die Aktivität des Argonauten steuern. Mit Hilfe von Crosslink-RNA-Immunopräzipitation und anschließender Hochdurchsatz-sequenzierung oder der Northern Blot basierten Auswertung konnte eine Assoziation von AgnB und der Class I RNAs gezeigt werden. Diese Klasse umfasst nicht-kodierende RNAs mit einer Länge von etwa 42 bis 65 Nukleotiden und wurde bisher nicht als Substrat für die RNAi-Maschinerie in D. discoideum angesehen. Ein weiterer Teil dieser Arbeit beschäftigte sich mit dem Einfluss von AgnA und AgnB auf die Promotorbereiche des D. discoideum Retrotransposons DIRS-1. Im Verlauf der Untersuchungen konnte beobachtet werden, dass die Anordnung entgegengesetzt operierender DIRS-1 Promotor-sequenzen für die Stilllegung eines Reportergens ausreichend war. Darauf aufbauend konnte ein DIRS-1 basiertes knockdown System etabliert werden. Mit Hilfe dieses Systems konnten die Proteinmengen ausgewählter Zielgene so effektiv reduziert werden, dass die entsprechenden Stämme den Phänotyp des korrespondierenden knockout Stammes zeigten. Darüber hinaus war es möglich die Proteinreduktion zu modulieren, um so beispielsweise dosisabhängige Effekte zu registrieren. Vorangegangene Arbeiten zur Biogenese von micro (mi)RNAs konnten das RNA-bindende Protein RbdB als eine Hauptkomponente für die Prozessierung maturer miRNAs identifizieren. Der miRNA defiziente RbdB- Stamm wurde in dieser Arbeit zur Identifikation putativer miRNA Ziele genutzt. Dazu wurde sowohl das Transkriptom des D. discoideum Wildtyps als auch des rbdB knockout Stammes in hohem Durchsatz sequenziert, um so differentiell exprimierte Gene zu detektieren. Vielversprechende Kandidaten wurden mittels qRT-PCR verifiziert. Dabei wurde unter anderem ein putativer Transkriptionsfaktor als miRNA target identifiziert, der eine Vielzahl weiterer Gene regulieren könnte. Abschließend konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass RbdB ebenfalls für die Generierung von small interfering (si)RNAs aus strukturierten Loci von Bedeutung ist. Dies weist auf mindestens zwei unterschiedliche Mechanismen zur siRNA Prozessierung in D. discoideum hin.

Intrakavitäts-Absorptionsspektroskopie von Spurengasen mit hoher Sensitivität und Selektivität auf Basis konkurrierender Moden eines Halbleiterlasers

Die Validität des Sensorkonzeptes aus dem Patent von Prof. H. Hillmer wird unter Verwendung einer gasförmigen Testsubstanz gezeigt. Zu diesem Zweck wird ein bestehender Messaufbau durch zahlreiche Verbesserungen optimiert. Die optischen Eigenschaften der verwendeten Komponenten und der resultierenden modifizierten Aufbauten werden dargelegt. Die bisherigen faserbasierter Messaufbauten werden zu einem symmetrischen Messaufbau mit verbesserter spektraler Auflösung und vereinfachter Handhabung erweitert. Die Vorlaufzeiten, die zuvor ein maßgebliches Problem darstellte, wurde deutlich reduziert. Die spektralen Eigenschaften des überarbeiteten Lasersystems werden detailliert erfasst und dargestellt. Der asymmetrische Messaufbau erreicht minimale Halbwertsbreiten von 0,04 ± 0,02 nm, bei einem Seitenmodenunterdrückungsverhältnis von 26,9 ± 0,9 dB und weist einen Schwellstrom von 361,55 mA auf. Der symmetrische Aufbau erreicht Halbwertsbreiten von 0,04 ± 0,02 nm, ein Seitenmodenunterdrückungsverhältnis von 49,45 ± 0,05 nm und weist einen Schwellstrom von 261,25 mA auf. Durch die Erweiterung des Systems zum symmetrischen Messaufbau wird es möglich, die Positionen der Wellenlängen frei zu wählen, wohingegen im asymmetrischen Messaufbau die Wellenlänge der äußeren Kavität immer näher am Maximum der Verstärkungskurve des SOA gewählt werden muss. Mit beiden System werden Messungen mit unterschiedlichen Stoffmengen von Acetylen mit unterschiedlichen Abständen zwischen den Laserlinien durchgeführt. Obwohl eine vergleichsweise schwache Absorptionslinie von Acetylen für die Messungen gewählt wurde, zeigen beide Systeme eine instantane Änderung der Intensitäten der Laserlinien bei einer Änderung der Stoffmenge im Resonator. Die Laserlinie, die von der Absorption von Acetylen betroffen ist, nimmt ab, wohingegen die Intensität der zweiten Laserlinie zunimmt. Es wird erstmals gezeigt, dass eine Leistungsübertragung zwischen den Laserlinien stattfindet. Die Reaktion beider Systeme ist stark vom Abstand der Laserlinien zueinander abhängig, wodurch eine genaue Bestimmung der Sensitivität nicht durchgeführt wird.

Story Driven Web Applications

Kern der vorliegenden Arbeit ist die Modellierung komplexer Webapplikationen mit dem Story-Driven-Modeling Ansatz.Ziel ist es hierbei,die komplette Applikation allein durch die Spezifikation von Modellen zu entwickeln. Das händische Erstellen von Quelltext ist nicht notwendig. Die vorliegende Arbeit zeigt sowohl den Forschungsweg, der die angestrebte Modellierung von Webapplikationen ermöglicht, als auch die resultierenden Ergebnisse auf. Zur Unterstützung des Entwicklungsprozesses wird weiterhin ein modellgetriebener Softwareentwicklungsprozess vorgestellt, der die Modellierung einer Webapplikation von der Aufnahme der Anforderungen, bis zur abschließenden Erzeugung des Quelltextes durch Codegenerierung aus den spezifizierten Modellen, abdeckt. Für den definierten Prozess wird ferner Werkzeugunterstützung innerhalb der Fujaba Toolsuite bereitgestellt. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde die bestehede Toolsuite hierzu um alle zur Prozessunterstützung notwendigen Werkzeuge erweitert. Darüber hinaus wurden im Rahmen der vorliegenden Arbeit die in Fujaba bestehenden Werkzeuge erweitert, um neben den klassischen Möglichkeiten zur Modellierung komplexer Java-Applikationen auch die Erzeugung von Webapplikationen zu ermöglichen. Neben der genauen Beschreibung des Entwicklungsprozesses werden im Rahmen dieser Arbeit die entstehenden Webapplikationen mit ihren spezifischen Eigenschaften genau beschrieben. Zur Erzeugung dieser Applikationen wird neben dem Entwicklungsprozess die Diagrammart der Workflowdiagramme eingeführt und beschrieben. Diese Diagramme dienen der Abbildung des intendierten Userworkflows der Applikation im Rahmen der Anforderungsanalyse und stellen im weiteren Entwicklungsverlauf ein dediziertes Entwicklungsartefakt dar. Basierend auf den Workflowdiagrammen werden sowohl die grafische Benutzerschnittstelle der Webapplikation beschrieben, als auch ein Laufzeitsystem initialisiert, welches basierend auf den im Workflowdiagramm abgebildeten Abläufen die Anwendung steuert. Dieses Laufzeitsystem wurde im Rahmen der vorliegenden Arbeit entwickelt und in der Prozessunterstützung verankert. Alle notwendigen Änderungen und Anpassungen und Erweiterungen an bereits bestehenden Teilen der Fujaba Toolsuite werden unter dem Aspekt der Erstellung clientseitiger Datenmodelle einer Webapplikation genau beschrieben und in Verbindung mit den zu erfüllenden Voraussetzungen erläutert. In diesem Zusammenhang wird ebenfalls beschrieben, wie Graphtransformationen zur Umsetzung von Businesslogik auf der Clientseite einer Webapplikation eingesetzt werden können und auf welche Weise Datenmodelländerungen zwischen unterschiedlichen Clients synchronisiert werden können. Insgesamt zeigt die vorliegende Arbeit einen Weg auf, den bestehenden Ansatz des StoryDriven-Modeling für die Erzeugung von Webapplikationen einzusetzen. Durch die im Rahmen dieser Arbeit beschriebene Herangehensweise werden hierbei gleichzeitig Webbrowser zu einer neuen Klasse von Graphersetzungs-Engines erweitert, indem Graphtransformationen innerhalb der Ajax-Engine des Browsers ausgeliefert und ausgeführt werden.