Dynamic characterization of olfactory receptors in the fruit fly Drosophila melanogaster

Temporal changes in odor concentration are vitally important to many animals orienting and navigating in their environment. How are such temporal changes detected? Within the scope of the present work an accurate stimulation and analysis system was developed to examine the dynamics of physiological properties of Drosophila melanogaster olfactory receptor organs. Subsequently a new method for delivering odor stimuli was tested and used to present the first dynamic characterization of olfactory receptors at the level of single neurons. Initially, recordings of the whole antenna were conducted while stimulating with different odors. The odor delivery system allowed the dynamic characterization of the whole fly antenna, including its sensilla and receptor neurons. Based on the obtained electroantennogram data a new odor delivery method called digital sequence method was developed. In addition the degree of accuracy was enhanced, initially using electroantennograms, and later recordings of odorant receptor cells at the single sensilla level. This work shows for the first time that different odors evoked different responses within one neuron depending on the chemical structure of the odor. The present work offers new insights into the dynamic properties of olfactory transduction in Drosophila melanogaster and describes time dependent parameters underlying these properties.

Untersuchungen zur Bedeutung der PKA für die Spermatogenese in Drosophila melanogaster

Für die cAMP-abhängige Proteinkinase (Proteinkinase A, PKA) in Drosophila melanogaster sind zwei regulatorische Untereinheiten (R1 und R2) und drei katalytische Untereinheiten (C1, C2 und C3) beschrieben. Außerdem gibt es eine weitere mögliche katalytische Untereinheit mit einer auffälligen Ähnlichkeit zu C2, dementsprechend C2-like genannt. Für R2, C2 und C2-like konnte bereits gezeigt werden, dass sie im Hodengewebe synthetisiert werden. Die Expression der verbleibenden PKA-Untereinheiten im Hodengewebe wurde in dieser Arbeit mit Hilfe von RT-PCR, Northern-Hybridisierungen, GFP-Reporter- bzw. GFP-Fusionskonstrukten untersucht. So konnte gezeigt werden, dass alle PKA-Untereinheiten im Hoden exprimiert werden. Dabei wird von jeder Untereinheit mindestens eine Isoform in den Keimzellen synthetisiert. R2 und C1 treten außerdem in den die Keimzellen umschließenden Zystenzellen auf, wobei R2 während der gesamten Spermatogenese exprimiert wird, C1 jedoch nur am Ende des Prozesses während des Stadiums der elongierten Spermatiden. In BRET-Analysen sind die beiden Untereinheiten in der Lage, miteinander zu interagieren. Somit könnten sie zusammen eine Funktion in den Zystenzellen vermitteln, die während der Differenzierungsphase stattfindet. Die katalytischen Untereinheiten C2, C2-like und zwei Isoformen von C3 (B und B') werden keimzellspezifisch exprimiert. Die BRET-Analysen lassen darauf schließen, dass C2 und C3 B’ möglicherweise keine funktionellen PKA-Untereinheiten sind. Auch der Versuch, durch Antisense- und RNAi-Konstrukte einen mutanten Phänotyp zu erzeugen, schlug fehl. Das könnte ein Hinweis darauf sein, dass die beiden Untereinheiten C2 und C3 B’ gar keine oder zumindest keine essentielle Funktion während der Spermatogenese haben. Das C2-like as-Konstrukt führte hingegen zu einem starken Phänotyp. Schon eine geringe Reduktion der endogenen c2-like-mRNA führte zu einer starken Beeinträchtigung der männlichen Fertilität. Die elongierten Spermatiden zeigten einen Defekt in der Kernmorphologie und waren nicht in der Lage, Individualisierungskomplexe auszubilden. Dementsprechend fand keine Individualisierung statt und es konnten keine reifen Spermien in die Samenblase entlassen werden. Der mutante Phänotyp weist darauf hin, dass C2-like an mehreren Prozessen während der Keimzelldifferenzierung beteiligt ist. Gao et al. veröffentlichten 2008 Listen mit potentiellen PKA-Substraten für alle bekannten katalytischen Untereinheiten verschiedener Organismen. Zwei Substrat-Kandidaten für C2-like sind die testisspezifischen Serin/Threonin-Kinasen (TSSK) CG9222 und CG14305. Beide Proteine werden exklusiv im Hoden exprimiert. CG9222-GFP lokalisierte in die Individualisierungskomplexe (ICs) elongierter Spermatiden. Das entsprechende RNAi-Konstrukt zeigte allerdings keinen Effekt auf den Zusammenbau der ICs. Dagegen zeigte CG14305-GFP keine subzelluläre Lokalisierung, sondern war cytoplasmatisch über die gesamten Spermatiden verteilt. Das entsprechende RNAi-Konstrukt führte aber dazu, dass keine ICs ausgebildet werden. Beide Proteine spielen dementsprechend eine Rolle während der Individualisierung. Dies ist in Übereinstimmung mit dem Phänotyp der C2-like as-mutanten Männchen. So ist es vorstellbar, dass CG9222 und CG14305 von C2-like phosphoryliert werden müssen, um ihre Funktion während der Individualisierung der Spermatiden erfüllen zu können. Ein direkter Nachweis, dass C2-like die beiden Proteine tatsächlich phosphorylieren kann, steht allerdings noch aus.

Enterprise Modelling Approach based on Maturity and Business Scope perspectives

This paper introduces a framework that supports users to implement enterprise modelling within collaborative companies. These enterprise models are the basis for a holistic interoperability measurement and management methodology which will be presented in the second part of the paper. The discipline of enterprise modelling aims at capturing all dimensions of an enterprise in a simplified model. Thus enterprise models are the appropriate basis for managing collaborative enterprise as they reduce the complexity of interoperability problems. Therefore, a first objective of this paper is to present an approach that enables companies to get the most effect out of enterprise modelling in a collaborative environment based on the maturity of their organisation relative to modelling. Within this first step, the user will get recommendations e.g. for the correct modelling language as well as the right level of detail.

Organizational excellence through quality governance

This paper provides an overview of an Enterprise Engineering method called IEM (Integrated Enterprise Modeling) and it describes the usage of SIX SIGMA approach for performance measurement of an enterprise. Based on these two instruments a methodology including procedure and tools is developed, which allows enterprises to define their adequate quality criteria for performance, to measure performance and quality and to derive reasonable actions to take for optimization. Determination of adequate quality and performance criteria and reasonable measures for the enterprise organization means “Quality Governance”.

Zur Herstellung von chiralen α-Aminosäuren mit α-quartären Zentren und deren Verwendung als Synthone in der organischen Synthese

Ziel dieser Arbeit war, ausgehend von alpha-Aminoaldehyden eine kurze und effiziente Synthese zur Darstellung von Aminosäuren mit alpha-quartären Zentren in enantiomerenreiner Form und davon ableitbare wichtige Synthone in der organischen Synthese zu entwickeln. Der enantiomerenreine 2-tert-Butyl-4-methyl-1,3-oxazolidin-4-carbaldehyd ist via kupfer-katalysierter Aziridinierung des enantiomerenangereicherten 2-tert-Butyl-5-methyl-4H-1,3-dioxins mit der Nitrenquelle (N-Tosylimino)phenyliodinan zugänglich. Eine anschließende Oxidation mit Natriumhyperchlorid und Wasserstoffperoxid führt zur korrespondierenden Carbonsäure, die via sauer katalysierter Acetalspaltung und nachfolgender Abspaltung der Tosyl-Schutzgruppe in enantiomerenreines alpha-Methylserin in sehr guten Ausbeuten umgewandelt werden kann. Mit dem Einsatz von in C5-Position Ethyl-substituiertem 2-tert-Butyl-4H-1,3-dioxin ist analog das N-Tosyl geschützte alpha-Ethylserin darstellbar. Um die bestehende Lösungsmittelabhängigkeit in weniger polaren Losungsmitteln wie Dichlormethan oder Diethylether der Aziridinierung in Bezug auf ihre Diastereoselektivität und Reaktivität zu minimieren, wurden unterschiedliche Nitrenquellen untersucht. [N-(p-Methoxybenzolsulfonyl)imino]methoxyphenyliodinan stellte sich als die potenteste Nitrenquelle heraus und die Ausbeute konnte auf bis zu 70% gesteigert werden. Die Anwendbarkeit des N-Tosyl geschützten alpha-Methylserins konnte mit der Synthese des β-Lactons und 2-Carboxylethylether-2-aziridin unter Mitsunobu-Bedingungen gezeigt werden. Dabei ist die Reaktion durch einfache Variation des Lösungsmittels und der Reaktionstemperatur zu beiden Produkten in sehr guten Ausbeuten hin steuerbar. Das β-Lacton konnte anschließend erfolgreich in das N-Tosyl- und S-Acetyl- geschützte alpha-Methylcystein überführt werden.

Untersuchung zum Phosphorylierungsstatus der katalytischen Untereinheit der PKA mittels proteomischer Techniken

ZUSAMMENFASSUNG: Das Phosphorylierungsmuster eines Proteins ist kein statischer Zustand, sondern vielmehr ein dynamischer Status, den es in der modernen funktionellen (Phospho-) Proteomik und Analytik abzubilden gilt. Klassischerweise erfolgt der Nachweis der Proteinphosphorylierung auf Peptid-Ebene mittels MS/MS Sequenzierung. Diese Standardmethode der shotgun Phosphoproteomanalytik vernachlässigt jedoch wegen den in LC MS/MS Analysen oftmals schwer detektierbaren Phosphopeptiden gerade den variablen und oftmals nur geringen Phosphorylierungsgrad vieler Phosphorylierungsstellen (P-Stellen). Mittels phosphospezifischer Anreicherungsstrategien und MS/MS Sequenzierung konnten an der Modellkinase PKA-Cα nach rekombinanter Expression in E. coli insgesamt acht P-Stellen identifiziert werden. Der Phosphorylierungsgrad wurde in Kooperation mit Dr. J. Seidler über quantitative Signalintensitätsmessungen bestimmt und zeigte eine nahezu vollständige Phosphorylierung von pS10, pS139, pT197 und pS338, während der Phosphorylierungsgrad für pS34, pS53, pS65 und pS259 zwischen <5 und 45 % variierte. Neben der Quantifizierung der P-Stellen wurde auch das Auftreten und die Verteilung definierter Phosphoformen der PKA-Cα untersucht und deren Abhängigkeit von der primären Aminosäureabfolge, dem Auftreten von zusätzlichen Modifikationen sowie den gewählten Expressions- und Reinigungsbedingungen aufgezeigt. Endogene, aus Säugergewebe isolierte PKA-Cα wies nur eine einzige Phosphoform mit den P-Stellen pT197 und pS338 auf. Auch in vitro autophosphorylierte rekombinante PKA-Cα, die zuvor dephosphoryliert worden war, wies eine zweifach modifizierte Phosphoform auf. Im Vergleich zum endogenen Protein ließ sich dieses Protein an S10 und S338 exzessiv phosphorylieren, wohingegen an T197 keine Autophosphorylierung nachzuweisen war. Das Ausbleiben weiterer Phosphorylierungen stellt in Frage, ob die Hyperphosphorylierung in E. coli ausschließlich auf Autophosphorylierungsprozessen beruht, was anhand einer nicht phosphorylierten, katalytisch inaktiven Variante von PKA-Cα (PKA-Cα K72H) vermutet wurde. Im Hinblick auf die funktionellen P-Stellen pT197 und pS338 erfordert diese Entdeckung sowie der unabhängige Nachweis, dass zellfrei exprimierte PKA-Cα nur an S338 phosphoryliert ist, eine Modifizierung des sequenziellen Vorhersagemodells, wonach die Phosphorylierung an T197 eine zwingende Voraussetzung für die nachfolgende Phosphorylierung an S338 ist. Ferner konnte über phosphomimetische Mutagenese die Funktionalität der Phosphorylierung an S53 innerhalb der glycinreichen Schleife der PKA-Cα und somit ein potenzieller Weg zur Regulation der enzymatischen Aktivität gezeigt werden. Ein weiterer möglicher upstream Regulator von PKA-Cα ist die Proteinphosphatase 5, die in der Lage war, die bislang als phosphatasestabil beschriebene P Stelle pT197 in vitro zu dephosphorylieren. Die vorliegende Arbeit zeigt, dass der Phosphorylierungszustand eines Proteins von zahlreichen internen und externen Faktoren abhängt – eine Tatsache, die gerade für rekombinante Proteine, insbesondere enzymatisch aktive Kinasen, oft vernachlässigt wurde. Daher müssen auch in der shotgun Phosphoproteomanalytik P-Stellen nicht mehr nur identifiziert und quantifiziert werden, sondern die resultierenden Proteinphosphoformen differenziert auch in ihrem physiologischen Kontext beschrieben werden.

Selbstassemblierte Monolagen und magnetisch strukturierte Submonolagen mit dia- und paramagnetischen Molekülen sowie Einzelmolekülmagneten auf Phthalocyanin- und Subphthalocyanin-Basis

Mit dieser Arbeit wurde die Selbstassemblierung von dia- und paramagnetischen Molekülen sowie Einzelmolekülmagneten auf Goldsubstraten und magnetisch strukturierten Substraten untersucht. Dazu wurden drei verschiedene Klassen an Phthalocyaninderivaten verwendet: Diamagnetische Subphthalocyanine, paramagnetische Phthalocyaninatometalle und Diphthalocyaninatolanthanidkomplexe. Alle synthetisierten Verbindungen sind peripher thioethersubstituiert. Die Alkylketten (a: n-C8H17, b: n-C12H25) vermitteln die Löslichkeit in vielen organischen Solventien und sorgen für eine geordnete Assemblierung auf einer Oberfläche, wobei die Bindung auf Gold hauptsächlich über die Schwefelatome stattfindet. Die aus Lösung abgeschiedenen selbstassemblierten Monolagen wurden mit XPS, NEXAFS-Spektroskopie und ToF-SIMS untersucht. Bei der Selbstassemblierung auf magnetisch strukturierten Substraten stehen die Moleküle unter dem Einfluss magnetischer Streufelder und binden bevorzugt nur in bestimmten Bereichen. Die gebildeten Submonolagen wurden zusätzlich mit X-PEEM untersucht. Die erstmals dargestellten Manganphthalocyanine [MnClPc(SR)8] 1 wurden ausgehend von MnCl2 erhalten. Hier fand bei der Aufarbeitung an Luft eine Oxidation zu Mangan(III) statt; +III ist die stabilste Oxidationsstufe von Mangan in Phthalocyaninen. Der Nachweis des axialen Chloridoliganden erfolgte mit Massenspektrometrie und FIR- sowie Raman-Spektroskopie. SQUID-Messungen haben gezeigt, dass die Komplexe 1 vier ungepaarte Elektronen haben. Bei den Subphthalocyaninen [BClSubpc(SR)6] 2 wurde der axiale Chloridoligand mit dem stäbchenförmigen Phenolderivat 29-H substituiert und die erfolgreiche Ligandensubstitution durch NMR- und IR-Spektroskopie sowie Massenspektrometrie an den Produkten [BSubpc(SR)6(29)] 30 belegt. Der Radikalcharakter der synthetisierten Terbiumkomplexe [Tb{Pc(SR)8}2] 3 wurde spektroskopisch nachgewiesen; SQUID-Messungen ergaben, dass es sich um Einzelmolekülmagnete mit einer Energiebarriere U des Doppelpotentialtopfs von 880 K oder 610 cm-1 bei 3a handelt. Zunächst wurden die SAMs der Komplexverbindungen 1, 2, 30 und 3 auf nicht magnetisch strukturierten Goldsubstraten untersucht. Die Manganphthalocyanine 1 bilden geordnete SAMs mit größtenteils flach liegenden Molekülen, wie die XPS-, NEXAFS- und ToF-SIMS-Analyse zeigte. Die Mehrzahl der Thioether-Einheiten ist auf Gold koordiniert und die Alkylketten zeigen ungeordnet von der Oberfläche weg. Bei der Adsorption findet eine Reduktion zu Mangan(II) statt und der axiale Chloridoligand wird abgespalten. Das beruht auf dem sog. Oberflächen-trans-Effekt. Im vorliegenden Fall übt die Metalloberfläche einen stärkeren trans-Effekt als der axiale Ligand aus, was bisher experimentell noch nicht beobachtet wurde. Die thioethersubstituierten Subphthalocyanine 2 und 30 sowie die Diphthalocyaninatoterbium-Komplexe 3 sind ebenfalls für SAMs geeignet. Ihre Monolagen wurden mit XPS und NEXAFS-Spektroskopie untersucht, und trotz einer gewissen Unordnung in den Filmen liegen die Moleküle jeweils im Wesentlichen flach auf der Goldoberfläche. Vermutlich sind bei diesen Systemen auch die Alkylketten größtenteils parallel zur Oberfläche orientiert. Im Gegensatz zu den Manganphthalocyaninen 1 tritt bei 2b, 30a, 30b und 3b neben der koordinativen Bindung der Schwefelatome auf Gold auch eine für Thioether nicht erwartete kovalente Au–S-Bindung auf, die durch C–S-Bindungsbruch unter Abspaltung der Alkylketten ermöglicht wird. Der Anteil, zu dem dieser Prozess stattfindet, scheint nicht mit der Molekülstruktur zu korrelieren. Selbstassemblierte Submonolagen auf magnetisch strukturierten Substraten wurden mit dem diamagnetischen Subphthalocyanin 2b hergestellt. Der Nachweis der Submonolagen war schwierig und gelang schließlich durch eine Kombination von ToF-SIMS, NEXAFS Imaging und X-PEEM. Die Analyse der ToF-SIMS-Daten zeigte, dass tatsächlich eine Modulation der Verteilung der Moleküle auf einem unterwärts magnetisch strukturierten Substrat eintritt. Mit X-PEEM konnte die magnetische Struktur der ferromagnetischen Schicht des Substrats direkt der Verteilung der adsorbierten Moleküle zugeordnet werden. Die Subphthalocyanine 2b adsorbieren nicht an den Domänengrenzen, sondern vermehrt dazwischen. Auf Substraten mit abwechselnd 6.5 und 3.5 µm breiten magnetischen Domänen binden die Moleküle bevorzugt in den Bereichen geringster magnetischer Streufeldgradienten, also den größeren Domänen. Solche Substrate wurden für die ToF-SIMS- und X-PEEM-Messungen verwendet. Bei größeren magnetischen Strukturen mit ca. 400 µm breiten Domänen, wie sie aufgrund der geringeren Ortsauflösung dieser Methode für NEXAFS Imaging eingesetzt wurden, binden die Moleküle dann in allen Domänen. Die diamagnetischen Moleküle werden nach dieser Interpretation aus dem inhomogenen Magnetfeld über der Probenoberfläche heraus gedrängt und verhalten sich analog makroskopischer Diamagnete. Die eindeutige Detektion der Moleküle auf den magnetisch strukturierten Substraten konnte bisher nur für die diamagnetischen Subphthalocyanine 2b erfolgen. Um die Interpretation ihres Verhaltens bei der Selbstassemblierung in einem inhomogenen Magnetfeld weiter voranzutreiben, wurde das Subphthalocyanin 37b dargestellt, welches ein stabiles organisches TEMPO-Radikal in seinem axialen Liganden enthält. Das paramagnetische Subphthalocyanin 37b sollte auf den magnetisch strukturierten Substraten in Regionen starker magnetischer Streufelder binden und damit das entgegengesetzte Verhalten zu den diamagnetischen Subphthalocyaninen 2b zeigen. Aus Zeitgründen konnte dieser Nachweis im Rahmen dieser Arbeit noch nicht erbracht werden.

Die Ausbildung von Proteinaggregaten durch ektopisch lokalisierte, oligomerisierende, Aktin-bindende Proteine

Die ektopische Lokalisation des Aktin-bündelnden Proteins VASP an die späten Endosomen mittels VacuolinA-Myc (VAM) führt zur Ausbildung von Aktin-haltigen Aggregaten, die Ähnlichkeiten mit Hirano Bodies haben, welche neurodegenerativen Krankheiten in verschiedenen Organen entstehen. VAM-VASP-Aggregate haben neben Aktin noch einige Aktin-interagierende Proteine sequestriert und nehmen Einfluss auf unterschiedliche physiologische Prozesse der Zelle, wie z. B. das Wachstum, die Zytokinese oder den endozytotischen Transit. Mit dem Ziel, Ursachen für die Aggregatentstehung zu finden, wurden im Rahmen dieser Arbeit andere Aktin-interagierende Proteine an späte Endosomen lokalisiert. So führt VAM-Abp34 ebenfalls zur Ausbildung Aktin-haltiger Aggregate während VAM-α-Actinin und VAM-Filamin die Bildung Aktin-freier Aggregate zur Folge haben. Letztere sind hauptsächlich aus den Proteinhybriden und den jeweiligen endogenen Bindungspartnern aufgebaut und ähneln sogenannten Aggresomen. Dennoch führen die Aktin-freien VAM-α-Actinin- und VAM-Filamin-Aggregate zu vergleichbaren physiologischen Defekten in der Zelle wie die Aktin-haltigen VAM-VASP-Aggregate. Der Aktin-Gehalt der VAM-VASP-Aggregate ist auf das VASP-Protein zurückzuführen. Dieses Protein ist fähig, die Elongation von Aktin-Filamenten voranzutreiben und erreicht, ektopisch lokalisiert an Endosomen, Peroxisomen und Lipid Droplets eine Anreicherung von F-Aktin an diesen Organellen. Ein Vergleich der Proteine VASP, Abp34, α-Actinin und Filamin führt zu dem Schluss, dass die Fähigkeit der Proteine, Oligomere bilden zu können, einen relevanten Faktor in der Ausbildung der VAM-Aggregate spielt. Die VAM-Aggregate sind sehr kompakt und stabil. Die Untersuchungen in dieser Arbeit führen zu der Annahme, dass die Aggregate durch die Überlastung der zellulären Proteindegradationsmaschinerie entstehen.

Professionswissen von Lehrkräften der Naturwissenschaften im Kompetenzbereich Erkenntnisgewinnung

Die Ergebnisse internationaler Schulleistungsstudien wie TIMMS und PISA haben eine umfassende Diskussion zur Qualität, Struktur und Effizienz der Ausbildung und berufsbegleitenden Qualifizierung im deutschen Bildungssystem angestoßen. Die Kultusministerkonferenz der Länder (KMK) hat mit ihren Beschlüssen zu fachbezogenen Bildungsstandards für den mittleren Schulabschluss erstmalig ein funktionales und länderübergreifendes Konzept vorgelegt, in dem Bildung durch Kompetenzen beschrieben wird. Die von den Schülerinnen und Schülern zu erreichenden Kenntnisse und Fertigkeiten werden in Standards konkretisiert, die in den Bereichen Fachwissen, Erkenntnisgewinnung, Kommunikation und Bewertung als Regelstandards organisiert sind. Die ländergemeinsamen Anforderungen für die Fachwissenschaften und Fachdidaktiken und die Standards für die Lehrerbildung beschreiben ein auf die Bildungsstandards bezugnehmendes Anforderungsprofil auf Seiten der Lehrkräfte zur Sicherung der Qualität in der Aus-, Fort- und Weiterbildung in allen drei Phasen der Lehrerbildung, mit dem Ziel eine kompetente Berufsausübung zu gewährleisten. Durch die Einführung des Kompetenzbegriffs werden somit auch die Kenntnisse und Fertigkeiten von Lehrkräften der Naturwissenschaften beschrieben, die auf Lehr- und Lernsituationen im Kompetenzbereich Fachwissen und Erkenntnisgewinnung ausgerichtet sind. Diese Standards markieren den Einstieg in ein Qualitätsmanagement, in dem normativen Standards konkretisiert und fachbezogen operationalisiert werden. Deren Evaluation ermöglicht eine empirisch fundiertere Darstellung der Lehrerbildung, die somit auch einen Beitrag zu einer weitergehenden Beschreibung des Professionswissens von Lehrkräften leistet. Allerdings ist im deutschsprachigen Raum bislang noch kein umfassendes Modell zum Professionswissen von Lehrkräften der Naturwissenschaften und einer niveaubezogenen Differenzierung ausgewiesener Kompetenzen verfügbar. Erste Strukturierungsansätze weisen auf die besondere Bedeutung der Bereiche Fachwissen, Fachdidaktisches Wissen und Pädagogisches Wissen hin. Insbesondere das in diesen Bereichen organisierte Wissen und Können von Lehrkräften ist für eine professionelle Handlungskompetenz von besonderer Bedeutung, die einen bedeutsamen Prädiktor für die Unterrichtsqualität darstellt und den Erwerb von Kenntnissen und Fertigkeiten im naturwissenschaftlichen Unterricht maßgeblich beeinflusst. Wesentliche Elemente einer umfassenden naturwissenschaftlichen Grundbildung werden in den Standards der Kompetenzbereiche Fachwissen und Erkenntnisgewinnung konkretisiert, die auch im Focus der Standards der Lehrerbildung in den naturwissenschaftlichen Fächern stehen. Die Kompetenzkonstrukte und Standards der Erkenntnisgewinnung systematisieren prozessbezogen zentrale Kompetenzen Fachmethodischen Wissens im Kontext einer naturwissenschaftlichen Untersuchung. Das Rahmenkonzept wissenschaftsmethodischer Kompetenzen von Mayer (2007) weist die Standards der Erkenntnisgewinnung in den Teilkompetenzen, bezogen auf die Phasen einer naturwissenschaftlichen Untersuchung, aus. Die vorliegende Untersuchung ist auf die Erhebung und Beschreibung von Kenntnissen und Fertigkeiten von Lehrkräften in den Kompetenzkonstrukten und Standards der Erkenntnisgewinnung ausgerichtet. Es wird untersucht, in welcher Weise die in den Kompetenzkonstrukten und Standards der Erkenntnisgewinnung beschriebenen wissenschaftsmethodischen Kompetenzen bei der Anlage fachdidaktisch begründeter Lernprozesse von den Lehrkräften berücksichtigt werden. Zudem wird der Frage nachgegangen, welche Erwartungen die Lehrkräfte an die Wirksamkeit ihrer Unterrichtsgestaltung in Bezug auf den intendierten Kompetenzerwerb wissenschaftsmethodischer Kompetenzen im naturwissenschaftlichen Unterricht haben. Im Anschluss wird das auf Seiten der Lehrkräfte verfügbare Fachmethodische Wissen beschrieben, auf das bei der Konkretisierung der Standards der Erkenntnisgewinnung im naturwissenschaftlichen Fachunterricht zurückgegriffen werden kann. Begleitend werden die Fächerkombination und das Lehramt als relevante Prädiktorvariablen im Hinblick auf die ausgewiesenen Fragestellungen betrachtet. Als Instrument wurde ein Erhebungsbogen entwickelt, der im Kooperationsprojekt „Kompetenzorientiert unterrichten in Mathematik und Naturwissenschaften“ der Universitäten Kassel und Gießen mit dem Amt für Lehrerbildung in Frankfurt zur Datenerhebung eingesetzt wurde. Den an der hessenweiten Qualifizierung teilnehmenden Lehrkräften (N = 282) wurde ein Erhebungsbogen mit 3 Instrumenten zu Beginn der Qualifizierung vorgelegt. Im ersten Instrument wurden die Ziele des naturwissenschaftlichen Arbeitens durch 24 Items abgebildet, die eine Selbstauskunft der Lehrkräfte durch eine sechsstufige Likert Skala erheben. Acht offene Testaufgaben haben im zweiten Instrument die wissenschaftsmethodischen Kenntnisse der Lehrkräfte in den Kompetenzkonstrukten und Standards der Erkenntnisgewinnung erhoben. Im dritten Instrument konnten die Lehrkräfte in drei freien Antwortformaten ihre Erwartungen an eine Qualifizierung im Kooperationsprojekt angeben. Wie die statistische Bearbeitung der Daten ausweist, berücksichtigen die Lehrkräfte die Kompetenzkonstrukte und Standards der Erkenntnisgewinnung in der Facette „Kompetenzorientiert Unterrichten“ und ihrer Dimensionen durchgängig „oft“. Lehrkräfte mit zwei naturwissenschaftlichen Fächern berücksichtigen die Kompetenzkonstrukte zudem häufiger bei der Anlage fachbezogenen Lernens. Im Hinblick auf die Erwartungen an die Lernprogression der Schülerinnen und Schüler werden die kompetenzbezogenen Ziele im naturwissenschaftlichen Unterricht nach Selbstauskunft der Lehrkräfte in der Facette „Kompetenzbezogene Ziele erreichen“ und ihrer Dimensionen „oft“ erreicht. Nach der Selbstauskunft der Lehrkräfte gehen diese davon aus, dass die intendierte Lernprogression wissenschaftsmethodischer Kenntnisse und Fertigkeiten von den Lernenden „oft“ erreicht wird. Insbesondere der Dimension Arbeitstechniken wird von den Lehrkräften in beiden Facetten ein gleichermaßen hoher Stellenwert im naturwissenschaftlichen Unterricht beigemessen. Ein Vergleich der Facetten „Kompetenzorientiert Unterrichten“ und „Kompetenzbezogene Ziele erreichen“ und ihrer Dimensionen zeigt allerdings auch, dass die Lehrkräfte die intendierte Lernprogression der Lernenden im Kompetenzbereich Erkenntnisgewinnung schwächer einschätzen. Des Weiteren besteht ein belastbarer Zusammenhang zwischen der Planung von Lernprozessen und dem Erwerb von Kenntnissen und Fertigkeiten im Kompetenzbereich Erkenntnisgewinnung. Die mittleren bis hohen Korrelationen zwischen den Facetten „Kompetenzorientiert Unterrichten“ und „Kompetenzbezogene Ziele erreichen“ deuten darauf hin, dass die seitens der Lehrkräfte eingesetzten fachmethodischen Kenntnisse in einem unmittelbaren Zusammenhang mit der Lernprogression im naturwissenschaftlichen Unterricht gesehen werden. Die Kompetenzkonstrukte und Standards der Erkenntnisgewinnung werden von den Lehrkräften durchgängig berücksichtigt und als bedeutsam im naturwissenschaftlichen Fachunterricht erachtet. Bezüglich der Prädiktorvariablen Lehramt und Alter liegen keine statistisch bedeutsamen Befunde vor. Die Standards der KMK werden von den Lehrkräften im Bereich Fachwissen und Fachdidaktischem Wissen gleichermaßen, unabhängig von ihrer Berufspraxis, umgesetzt. Die von den Lehrkräften angegebenen Lösungen der offenen Aufgaben in den Teilkompetenzen einer naturwissenschaftlichen Untersuchung lassen sich weitgehend der Niveaustufe 1 zuordnen. Lehrkräfte mit dem Lehramt für Gymnasien lösen die Aufgaben auf einem höheren Niveau, das allerdings die Niveaustufe 2 noch nicht erreicht. Offenbar gelingt es diesen Lehrkräften umfassender Kenntnisse und Fertigkeiten in den Teilkompetenzen einer naturwissenschaftlichen Untersuchung zu aktivieren. Allerdings werden die mittleren Anforderungen, die national und international der Niveaustufe 3 zugeordnet werden, von den Lehrkräften durchgängig nicht erreicht. Zudem besteht zwischen den beiden Facetten „Kompetenzorientiert Unterrichten“ und „Kompetenzbezogene Ziele erreichen“ und den offenen Aufgaben kein statistisch bedeutsamer Zusammenhang. Die Lehrkräfte setzen ihre Kenntnisse und Fertigkeiten mit den Anforderungen eines kompetenzorientierten naturwissenschaftlichen Fachunterrichts nur unzureichend in Beziehung. Wie die Befunde der im dritten Instrument erhobenen Erwartungen und Ziele einer Qualifizierung zeigen, bringen die Lehrkräfte die Bereitschaft mit, sich aktiv in die Qualitätsentwicklung einzubringen. Sie erwarten von dem kumulativen Kompetenzerwerb in den Bereichen Fachwissen und Fachmethodisches Wissen einen wesentlichen Beitrag zur Gestaltung standardorientierter Lehr- und Lernsituationen.

Biologische Funktionsanalyse und Identifizierung neuer Substrate der Methyltransferase Dnmt2

Obwohl die DNA Methyltransferase 2 (Dnmt2) hoch konserviert ist und zu der am weitesten verbreiteten eukaryotischen MTase-Familie gehört, ist ihre biologische Funktion nach wie vor unklar. Nachdem lange Zeit keine DNA Methylierungsaktivität nachgewiesen werden konnte, wurde vor einigen Jahren über geringe Mengen an 5-Methylcytosin (5mC) in Retroelementen der “Dnmt2-only”-Organismen D. melanogaster, D. discoideum und E. histolytica berichtet (Kunert et al. 2003; Fisher et al. 2004; Kuhlmann et al. 2005; Phalke et al. 2009). Als kurze Zeit später robuste Methylierung der tRNAAsp durch humane Dnmt2 gezeigt wurde (Goll et al. 2006), wurde zunächst eine Dualspezifität des Enzyms vorgeschlagen (Jeltsch et al. 2006). Neuere Daten zum 5mC-Status verschiedener „Dnmt2-only“-Organismen bilden Anlass für kontroverse Diskussionen über Ausmaß und Bedeutung der DNA Methyltransferaseaktivität von Dnmt2 (Schaefer et al. 2010a; Krauss et al. 2011). Die vorliegende Arbeit konzentriert sich auf die Identifizierung neuer RNA Substrate des Dnmt2-Homologs DnmA aus D. discoideum sowie die biologische Bedeutung der tRNA-Methylierung durch Dnmt2. Wie in anderen Organismen beschrieben, fungiert auch DnmA als tRNAAsp(GUC) MTase in vitro und in vivo. Zusätzlich konnte in vitro tRNAGlu(UUC) als neues Substrat der Dnmt2-Homologe aus D. discoideum und dem Menschen identifiziert werden. In einem Kooperationsprojekt wurde außerdem auch tRNAAsp-Methylierungsaktivität für das Dnmt2-Homolog aus S. pombe (Pmt1) nachgewiesen. Crosslink-RNA-Immunopräzipitationen (RNA-CLIP) mit anschließender Next-Generation-Sequenzierung der mit DnmA assoziierten RNAs zeigen, dass DnmA mit tRNA Fragmenten interagiert, die sich vom Anticodonloop bis in den T-loop erstrecken. Neben der tRNAAsp(GUC) und tRNAGlu(UUC/CUC) sind Fragmente der tRNAGly(GCC) verstärkt angereichert. Inwiefern diese Fragmente eine biologische Funktion haben oder spezifische Degradationsprodukte darstellen, ist noch ungeklärt. Interessanterweise sind von einigen tRNAs wenige Sequenzen von antisense-Fragmenten in den RNA-CLIP Daten zu finden, die etwas kürzer, jedoch exakt komplementär zu den genannten sense-Fragmenten sind. Besonders stark sind diese Fragmente der tRNAGlu(UUC) vertreten. In einem weiteren RNA-CLIP Experiment wurden U-snRNAs, snoRNA und intergenische Sequenzen mit DnmA angereichert. Bei nachfolgenden in vitro Methylierungsstudien konnte ausschließlich die U2-snRNA als potentielles Nicht-tRNA-Substrat der hDnmt2 und DnmA identifiziert werden. Da tRNA Modifikationen im Anticodonloop die Codonerkennung beeinflussen können, wurde ein System etabliert um die Translationseffizienz eines GFP-Reportergens in Wildtyp- und dnmAKO-Zellen zu messen. In D. discoideum wird das Aspartat-Codon GAU ca. zehnmal häufiger genutzt als das GAC Codon, allerdings ist nur eine tRNAAsp(GUC) im Genom der Amöbe kodiert. Aus diesem Grund wurde zusätzlich die Frage adressiert, inwiefern die DnmA-abhängige Methylierung dieser tRNA das „Wobbling“ beeinflusst. Dazu wurde dem Reportergen jeweils eine (GAU)5- und (GAC)5-Leadersequenz vorgeschaltet. Entgegen der Annahme wurde der (GAC)5-Leader in beiden Stämmen etwas effizienter translatiert. Insgesamt zeigte der dnmAKO-Stamm eine leicht erhöhte Translationseffizienz der Reportergene. Vergleichende Analysen zur Aufnahme von Fremd-DNA zeigten signifikant reduzierte Transformationseffizienzen mit einem integrierenden Plasmid in dnmAKO-Zellen. Ein weiterer dnmAKO-Stamm zeigte diesen Effekt jedoch nicht, wobei bei derselben Mutante eine deutlich reduzierte Aufnahme eines extrachromosomalen Plasmids zu verzeichnen war. Untersuchungen zum Einfluss von DnmA auf die Regulation des Retroelements skipper ergaben keinen Zusammenhang zwischen der Generierung kleiner RNAs und der erhöhten Transkription des Retrotransposons in dnmAKO-Zellen (Kuhlmann et al. 2005). Durch Kompensationsversuche sowie Experimente mit einer weiteren dnmAKO-Mutante konnte die Mobilisierung des Retrotransposons nicht eindeutig als DnmA-Funktion eingeordnet werden. In einem weiteren Projekt wurden die Bindung des m5C-bindenden Proteins EhMLBP aus E. histolytica an DNA mittels Rasterkraftmikroskopie abgebildet (Lavi et al. 2006). Neben vermutlich unspezifischen Endbindungsereignissen konnte eine bevorzugte Bindungsstelle des Proteins an LINE DNA (long intersperesed nuclear element) identifiziert werden. Möglicherweise fällt diese mit einem von zwei A/T-reichen Bereichen der LINE DNA zusammen, von denen vermutet wird, dass diese für die Bindung von EhMLBP an DNA von Bedeutung sind. Insgesamt bestätigen die Ergebnisse dieser Arbeit die tRNAAsp Methylierungsaktivität als konservierte Dnmt2-Funktion. Darüber hinaus erweitern sie das Substratspektrum der Dnmt2-Methyltransferasen im Bereich der tRNA. Außerdem wird erstmals ein potentielles Nicht-tRNA Substrat vorgeschlagen. Zusätzlich geben neu entdeckte Phänotypen Hinweise auf vielfältige zelluläre Dnmt2-Funktionen.

Untersuchungen zur Rolle von Isoformen katalytischer Untereinheiten der PKA

ZUSAMMENFASSUNG: Proteinkinasen übernehmen zentrale Aufgaben in der Signaltransduktion höherer Zellen. Dabei ist die cAMP-abhängige Proteinkinase (PKA) bezüglich ihrer Struktur und Funktion eine der am besten charakterisierten Proteinkinasen. Trotzdem ist wenig über direkte Interaktionspartner der katalytischen Untereinheiten (PKA-C) bekannt. In einem Split-Ubiquitin basiertem Yeast Two Hybrid- (Y2H-)System wurden potenzielle Interaktionspartner der PKA-C identifiziert. Als Bait wurden sowohl die humane Hauptisoform Cα (hCα) als auch die Proteinkinase X (PrKX) eingesetzt. Nach der Bestätigung der Funktionalität der PKA-C-Baitproteine, dem Nachweis der Expression und der Interaktion mit dem bekannten Interaktionspartner PKI wurde ein Y2H-Screen gegen eine Mausembryo-cDNA-Expressionsbibliothek durchgeführt. Von 2*10^6 Klonen wurden 76 Kolonien isoliert, die ein mit PrKX interagierendes Preyprotein exprimierten. Über die Sequenzierung der enthaltenen Prey-Vektoren wurden 25 unterschiedliche, potenzielle Interaktionspartner identifiziert. Für hCα wurden über 2*10^6 S. cerevisiae-Kolonien untersucht, von denen 1.959 positiv waren (1.663 unter erhöhter Stringenz). Über die Sequenzierung von ca. 10% der Klone (168) konnten Sequenzen für 67 verschiedene, potenzielle Interaktionspartner der hCα identifiziert werden. 15 der Preyproteine wurden in beiden Screens identifiziert. Die PKA-C-spezifische Wechselwirkung der insgesamt 77 Preyproteine wurde im Bait Dependency Test gegen largeT, ein Protein ohne Bezug zum PKA-System, untersucht. Aus den PKA-C-spezifischen Bindern wurden die löslichen Preyproteine AMY-1, Bax72-192, Fabp3, Gng11, MiF, Nm23-M1, Nm23-M2, Sssca1 und VASP256-375 für die weitere in vitro-Validierung ausgewählt. Die Interaktion von FLAG-Strep-Strep-hCα (FSS-hCα) mit den über Strep-Tactin aus der rekombinanten Expression in E. coli gereinigten One-STrEP-HA-Proteinen (SSHA-Proteine) wurde über Koimmunpräzipitation für SSHA-Fabp3, -Nm23-M1, -Nm23-M2, -Sssca1 und -VASP256-375 bestätigt. In SPR-Untersuchungen, für die hCα kovalent an die Oberfläche eines CM5-Sensorchips gekoppelt wurde, wurden die ATP/Mg2+-Abhängigkeit der Bindungen sowie differentielle Effekte der ATP-kompetitiven Inhibitoren H89 und HA-1077 untersucht. Freie hCα, die vor der Injektion zu den SSHA-Proteinen gegeben wurde, kompetierte im Gegensatz zu FSS-PrKX die Bindung an die hCα-Oberfläche. Erste kinetische Analysen lieferten Gleichgewichtsdissoziationskonstanten im µM- (SSHA-Fabp3, -Sssca1), nM- (SSHA-Nm23-M1, –M2) bzw. pM- (SSHA-VASP256-375) Bereich. In funktionellen Analysen konnte eine Phosphorylierung von SSHA-Sssca1 und VASP256-375 durch hCα und FSS-PrKX im Autoradiogramm nachgewiesen werden. SSHA-VASP256-375 zeigte zudem eine starke Inhibition von hCα im Mobility Shift-Assay. Dieser inhibitorische Effekt sowie die hohe Affinität konnten jedoch auf eine Kombination aus der Linkersequenz des Vektors und dem N-Terminus von VASP256-375 zurückgeführt werden. Über die Wechselwirkungen der hier identifizierten Interaktionspartner Fabp3, Nm23-M1 und Nm23-M2 mit hCα können in Folgeuntersuchungen neue PKA-Funktionen insbesondere im Herzen sowie während der Zellmigration aufgedeckt werden. Sssca1 stellt dagegen ein neues, näher zu charakterisierendes PKA-Substrat dar.

Optimierung der aminozucker-spezifischen δ13C-Analyse in Böden- und Pflanzenmaterialien zur Erfassung des Umsatzes von mikrobiellen Residuen

In der vorliegenden Arbeit wurde eine LC-IRMS Methode zur aminozucker-spezifischen δ13C-Analyse in Pflanzenmaterialien optimiert und etabliert, um die Bildung und den Umsatz von mikrobiellen Residuen in Boden- und Pflanzenmaterialien mit hoher Genauigkeit erfassen zu können. Weiterhin wurde mit der etablierten Methode ein Pilzwachstumsexperiment durchgeführt. Der Fokus dieser Arbeit lag jedoch auf der Methodenentwicklung. Ziel des ersten Artikels war es eine HPLC-Umkehrphasen-Methode zur simultanen Bestimmung von Muraminsäure, Mannosamin, Galaktosamin und Glucosamin so hingehend zu verbessern, dass an verschieden HPLC-Systemen zuverlässige Ergebnisse für alle vier Aminozucker in Boden- und Pflanzenhydrolysaten erhalten werden. Dafür wurde zunächst die mobile Phase optimiert. So wurde der Tetrahydrofurananteil erhöht, was kürzere Retentionszeiten und eine bessere Trennung zwischen Muraminsäure und Mannosamin zur Folge hatte. Weiterhin wurde ein höheres Signal durch das Herabsetzen der Extinktionswellenlänge und der Anpassung der OPA-Derivatisierungsreaktionszeit erzielt. Nach Optimierung der genannten Parameter erfolgte die Validierung der Methode. Für Muraminsäure wurde eine Bestimmungsgrenze (LOQ) von 0,5 µmol l-1 was 0,13 µg ml -1 entspricht und für die drei anderen Aminozucker 5,0 µmol l-1 (entspricht 0,90 µg ml)erhalten. Weiterhin wurden Wasser und Phosphatpuffer als Probenlösungsmittel getestet, um den Einfluss des pH-Wertes auf die OPA-Reaktion zu testen. Zur aminozucker-spezifischen δ13C–Analyse am IRMS ist eine HPLC-Methode mit einer kohlenstofffreien mobilen Phase notwendig, andernfalls kann aufgrund des hohen Hintergrundrauschens kein vernünftiges Signal mehr detektiert werden. Da die im ersten Artikel beschriebene Umkehrphasenmethode einen kohlenstoffhaltigen Eluenten enthält, musste eine ebenso zuverlässige Methode, die jedoch keine organische Lösungsmittel benötigt, getestet und mit der schon etablierten Methode verglichen werden. Es gibt eine Reihe von HPLC-Methoden, die ohne organische Lösungsmittel auskommen, wie z. B. (1) Hochleistungsanionenaustauschchromatographie (HPAEC), (2) Hochleistungskationenaustauschchromatographie (HPCEC) und (3) die Hochleistungsanionenausschlusschromatographie (HPEXC). Ziele des zweiten Artikels waren (1) eine zuverlässige Purifikations- und Konzentrierungsmethode für Aminozucker in HCl-Hydrolysaten und (2) eine optimale HPLC-Methode zu finden. Es wurden fünf Aufarbeitungsmethoden zur Purifikation und Konzentrierung der Probenhydrolysate und vier HPLC-Methoden getestet. Schlussfolgernd kann zusammengefasst werden, dass für Detektoren mit geringer Empfindlichkeit (z.B. IRMS) eine Konzentrierung und Purifikation insbesondere von Muraminsäure über ein Kationenaustauscherharz sinnvoll ist. Eine Basislinientrennung für alle Aminozucker war nur mit der HPAEC möglich. Da mit dieser Methode gute Validierungsdaten erzielt wurden und die Aminozuckergehalte mit der Umkehrphasenmethode vergleichbar waren, stellt die HPAEC die Methode der Wahl zur aminozucker-spezifischen δ13C–Analyse am IRMS dar. Der dritte Artikel befasst sich mit der Optimierung der aminozucker-spezifischen δ13C–Analyse mittels HPAEC-IRMS in Pflanzenhydrolysaten sowie mit der Bestimmung des Umsatzes von saprotrophen Pilzen in verschieden Substraten. Die in der Literatur beschriebene HPAEC-IRMS- Methode ist für die aminozucker-spezifische δ13C–Analyse in Bodenhydrolysaten jedoch nicht in Pflanzenhydrolysaten geeignet. In Pflanzenhydrolysaten wird der Glucosaminpeak von Peaks aus der Matrix interferiert. Folglich war das erste Ziel dieses Artikels, die Methode so zu optimieren, dass eine aminozucker-spezifische δ13C–Analyse in Pflanzenhydrolysaten möglich ist. Weiterhin sollten mit der optimierten HPAEC-IRMS-Methode die Bildung und der Umsatz von saprotrophen Pilzen bestimmt werden. Durch Erhöhung der Säulentemperatur und durch Herabsetzung der NaOH-Konzentration konnte eine Basislinientrennung erzielt werden. Die Validierungsparameter waren gut und die bestimmten Aminozuckergehalte waren mit der Umkehrphasen-HPLC-Methode vergleichbar. Zur Bestimmung der Bildung und des Umsatzes von saprotrophen Pilzen auf verschiedenen Substraten wurden Lentinula edodes P., Pleurotus ostreatus K. und Pleurotus citrinopileatus S. auf Mais-Holz- und auf Weizen-Holz-Substrat für vier Wochen bei 24 °C kultiviert. Dieser Pilzwachstumsversuch zeigte, dass 80% des neu gebildeten pilzlichen Glucusamins maisbürtig und nicht holzbürtig waren. Weiterhin wurde der bevorzugte Abbau von Maissubstrat im Vergleich zu Weizensubstrat an diesem Versuch verdeutlicht. Außerdem lassen die Ergebnisse darauf schließen, dass die beobachtete zunehmende δ13C Anreicherung in dem neu gebildeten pilzlichen Glucosamin während der vier Wochen auf die Inkorporation des angereichten 13C aus dem Substrat und eher weniger auf kinetische Isotopeneffekte zurückzuführen ist.

Identifizierung und funktionelle Charakterisierung neuer A-Kinase-Ankerproteine (AKAPs) im Modellorganismus C. elegans

In dieser Arbeit sollten neue Interaktionspartner der regulatorischen Untereinheit (R-UE) der Proteinkinase A (PKA) und des Modellorganismus C. elegans identifiziert und funktionell charakterisiert werden. Im Gegensatz zu Säugern (vier Isoformen), exprimiert der Nematode nur eine PKA-R-Isoform. Mittels in silico Analysen und so genannten „Pulldown“ Experimenten, wurde insbesondere nach A Kinase Ankerproteinen (AKAP) in C. elegans gesucht. Aus in silico Recherchen resultiert das rgs5 Protein als mögliches Funktionshomolog des humanen AKAP10. Rgs5 enthält eine potenzielle, amphipathische Helix (AS 421-446, SwissProt ID A9Z1K0), die in Peptide-SPOT-Arrays (durchgeführt im Biotechnologie Zentrum in Oslo, AG Prof. K. Taskén) eine Bindung an RI und RII-UE zeigt. Eine ähnliche Lokalisation von rgs5 und hAKAP10 in der Zelle, sowie vergleichende BRET² Studien, weisen auf eine mögliche Funktionshomologie zwischen AKAP10 und rgs5 hin. Die hier durchgeführten Analysen deuten darauf hin, dass es sich bei rgs5 um ein neues, klassisches AKAP mit „RII bindender Domäne“ Motiv im Modellorganismus C. elegans handelt. Basierend auf so genannten „pulldown“ Versuchen können, neben „klassischen“ AKAPs (Interaktion über amphipathische Helices), auch Interaktionspartner ohne typische Helixmotive gefunden werden. Dazu gehört auch RACK1, ein multifunktionales Protein mit 7 WD40 Domänen, das ubiquitär exprimiert wird und bereits mehr als 70 Interaktionspartner in unterschiedlichsten Signalwegen komplexiert (Adams et al., 2011). Durch BRET² Interaktionsstudien und Oberflächenplasmonresonanz (SPR) Analysen konnten hRI und kin2 als spezifische Interaktionspartner von RACK1 verifiziert werden. Untersuchungen zur Identifikation der Interaktionsflächen der beiden Proteine RACK1 und hRI zeigten im BRET² System, dass RACK1 über die WD40 Domänen 1-2 und 6-7 interagiert. Die Analyse unterschiedlicher hRI-Deletionsmutanten deutet auf die DD-Domäne im N-Terminus und zusätzlich auf eine potenzielle BH3 Domäne im C-Terminus des Proteins als Interaktionsfläche mit RACK1 hin. Die Koexpression von hRI BH3 und RACK1 zeigt einen auffälligen ein Phänotyp in Cos7 Zellen. Dieser zeichnet sich unter anderem durch eine Degradation des Zellkerns, DNA Kondensation und eine starke Vakuolisierung aus, was beides als Anzeichen für einen programmierten Zelltod interpretiert werden könnte. Erste Untersuchungen zum Mechanismus des ausgelösten Zelltods deuten auf eine Caspase unabhängige Apoptose (Paraptose) hin und einen bislang unbekannten Funktionsmechanismus der PKA hin.

Translationskontrolle in der Spermatogenese von Drosophila: Charakterisierung eines regulatorischen mRNP-Komplexes

Während der Spermatogenese von Drosophila werden viele mRNAs zwar vor der Meiose transkribiert, dann aber durch Komplexbildung mit Proteinen stillgelegt und erst am Ende der Spermienentwicklung durch Veränderung desselben für die Translation freigegeben. Ein Beispiel hierfür ist die Mst87F mRNA. Während das cis-agierende Sequenzelement in der RNA seit langem bekannt ist, gestaltete sich die Suche nach den trans-agierenden RNA-bindenden Proteinen schwierig. In meiner Diplomarbeit (Stinski, 2007) waren mithilfe von präparativen Shift-Experimenten (Auftrennung von RNP-Komplexen im elektrischen Feld) zwei vielversprechende Kandidaten identifiziert worden, die Proteine Exuperantia (Exu) und Purity of Essence (Poe). Ziel der vorliegenden Dissertation war zum einen die Aufklärung der Funktion dieser Kandidatenproteine und zum anderen die Identifizierung weiterer Kandidaten, die an der Komplexbildung und damit an der Regulation beteiligt sind. Dabei war die Hoffnung, sowohl Proteine zu finden, die die Repression vermitteln, als auch solche, die am Ende die Aktivierung ermöglichen. Durch eine Affinitätsreinigung, in der Mst87F-RNA mit einem ms2-Tag versehen über das MS2-Maltose binding protein an eine Amylose-Matrix gebunden und schließlich die Komplexe mit Maltose wieder eluiert wurden, ließen sich erneut das Exu-Protein und drei neue Kandidaten identifizieren: CG3213, CG12470 und CG1898. Das Protein Exu hat eindeutig eine Funktion bei der Translationskontrolle: seine Abwesenheit führt zum Abbau der kontrollierten mRNAs. Die Inkubation mit exu-defizientem Protein-Extrakt (aus Hoden) unterstützt keine RNP-Komplexbildung und aufgereinigtes Exu-His Fusionsprotein kann auch nicht direkt an die Mst87F mRNA binden. Ein exu-defizienter Proteinextrakt lässt sich aber durch die Zugabe von rekombinantem Exu-His komplettieren und es entsteht wieder ein starker mRNP-Komplex. Dies beweist, dass das Experiment im Prinzip korrekt verläuft und dass Exu für die Komplexbildung entscheidend ist. Darüber hinaus konnten durch eine Co-Immunpräzipitation mit dem Exu-GFP Fusionsprotein sowohl interagierende Proteine als auch in die RNP-Komplexe einbezogene mRNAs nachgewiesen werden. Vielversprechende Kandidatenproteine stammen von den Genen CG3213, dfmr1 und CG12470. Die durch cDNA-Synthese in den Komplexen nachgewiesenen mRNAs sind in aller Regel solche, die der Translationskontrolle unterworfen sind. Damit ist gezeigt, dass Exu Teil eines großen Proteinkomplexes ist oder zumindest mit ihm assoziiert ist, der auf viele translationskontrollierte Transkripte Einfluss nimmt. Die Mst87F mRNA wird zum Zeitpunkt der Translationsaktivierung sekundär polyadenyliert, das heißt ihre Länge wird größer und heterogen. In einer Mutante für das Kandidatengen poe wurde diese sekundäre Polyadenylierung plötzlich nicht mehr beobachtet und die RNA blieb auch bei Translationsaktivierung so groß wie in den frühen Stadien. So ergab sich die Möglichkeit, endlich zu prüfen, ob die sekundäre Polyadenylierung für die Translationsaktivierung von essentieller Bedeutung ist. Eine Serie von Fusionskonstrukten mit funktionstüchtigem TCE verhielten sich alle gleich. Die sekundäre Polyadenylierung fand nicht statt, aber das Transkript des Fusionsgens wurde zum richtigen Zeitpunkt translatiert. Somit ist dieser Prozess zumindest nicht generell für eine Translation zu diesem späten Zeitpunkt in der Spermiogenese notwendig. Ein quantitativer Effekt kann allerdings nicht ausgeschlossen werden. Des Weiteren konnten mit antisense Konstrukten mutante Phänotypen erzeugt werden. Solche Männchen waren ausnahmslos steril, was die Wichtigkeit des Proteins Poe für den Prozess der Spermienreifung belegt. Die Defekte zeigen sich spät während der Individualisierung, was mit der vermuteten Funktion übereinstimmen würde. Das Kandidatenprotein dFMR1 bindet allein an die Mst87F RNA und trägt zur Stärke des beobachtbaren Komplexes bei. Die Komplexbildung zeigt Salzabhängigkeit, wie sie für dFMR1 in anderen Zusammenhängen dokumentiert wurde. Dies unterstützt die obige Aussage und suggeriert, dass dFMR1 die Basis für den Komplexaufbau bildet. Das CPEB-homologe Kandidatenprotein Orb2 bindet ebenfalls allein an die Mst87F mRNA, hat aber keinen Einfluss auf die Repression oder die sekundäre Polyadenylierung. Eine Beteiligung an der Regulation wäre demnach eindeutig unterschiedlich zu der in anderen Fällen dokumentierten Rolle. Die Expression der Kandidatengene CG1898, CG3213 und CG12470 ist konform mit einer unterschiedlichen Beteiligung an der Translationskontrolle. Das erste Protein ist nur in prämeiotischen Stadien, das zweite durchgängig und das dritte nur in postmeiotischen Stadien nachzuweisen, was einer Funktion bei der Stillegung, während der gesamten inaktiven Phase bzw. bei der Aktivierung entsprechen könnte. Die verschiedenen Experimente identifizieren in mehreren Fällen die gleichen Kandidatenproteine und untermauern damit deren Bedeutung. Sie lassen vielfach konkrete Schlüsse auf die Art der Interaktionen zu, welche in einem Schema zusammengefasst werden.