Die Masse macht's!

Die biochemische Beschreibung funktioneller Proteininteraktionsnetzwerke hat in den letzten Jahren einen starken Wandel erfahren. Mittels hochauflösender biologischer Massenspektrometrie(MS) ist es möglich Netzwerkkomponenten, wie Proteine schnell und zuverlässig zu identifizieren und auf ihre Modifikationen hin zu untersuchen. Innerhalb des Promotionskollegs (PK) Proteomics der Universität Kassel bietet die MS neue Ansatzpunkte für die Beantwortung molekularbiologischer Fragestellungen und liefert Ergänzungen zu den bislang genutzten klassischen Methoden der Biochemie.

Proteomics Day 2008 in Rotenburg an der Fulda

Dieses Projekt wurde innerhalb des Graduiertenkollegs „Proteomics“ der Universität Kassel gefördert.

Enzymkinetik in der Schule

Urease ist ein Enzym, das Harnstoff spaltet und dessen Reaktionsgeschwindigkeit leicht mittels Leitfähigkeitsmessungen bestimmt werden kann. Dieses Experiment kann, als Schüler- oder Demonstrationsversuch, im Biologie- und Chemieunterricht der Oberstufe von qualitativen Betrachtungen bis hin zur Ermittlung komplexer kinetischer Beschreibungen (Michaelis-Menten-Kinetik) ausgewertet werden.

Die Rolle von Fibronektin in der Leber und im Knochen

In der vorliegenden Arbeit sollten der Einfluss des Fibronektins auf eine Leberfibrose und die Wirkung veränderter Fibronektin-Isoformen auf den Knochen experimentell untersucht werden. Dazu wurden konditionelle Fibronektin Knockout-Mäuse verwendet. Die spezifische Ausschaltung in hepatischen Sternzellen konnte sowohl auf der Ebene der DNA und RNA als auch anhand der gebildeten Proteinmenge bewiesen werden. Fehlendes Fibronektin hatte bereits bei gesunden Mäusen einen leichten Anstieg der Kollagenmenge zur Folge. Durch die Induktion einer Fibrose mit der Chemikalie DMN kam es zu einer auffällig starken Akkumulation von Kollagen in den konditionellen Knockout-Mäusen. Zusätzlich ließ sich eine Häufung des Fibronektins in fibrotischen Bereichen erkennen. Nachfolgend konnte die erhöhte Kollagenmenge auf eine vermehrte Aktivierung der hepatischen Sternzellen zurückgeführt werden, außerdem kam es zu einer erhöhten Proliferation dieser Zellen. In vitro Untersuchungen bestätigten eine Grundaktivierung der konditionellen Knockout-Sternzellen, welche sich durch eine Stimulation mit TGF-β noch erheblich verstärkte. Diese verstärkte Aktivierung ließ sich auf eine erhöhte Menge von TGF-β Rezeptor Typ II auf der Zellmembran zurückführen, was eine zunehmende Aktivierung der Signalmoleküle im Inneren der Sternzellen zur Folge hatte. Dabei konnte anhand von Untersuchungen des Smad4 und der p38 Kinase bewiesen werden, dass beide Wege zu einer verstärkten Kollagen Typ I Expression in den konditionellen Knockout-Sternzellen beitrugen. Letztlich zeigte sich, dass es durch fehlendes Fibronektin zu einer verstärkten Freisetzung von aktivem TGF-β kam, wodurch sich die oben beschriebenen profibrotischen Effekte erklären lassen. Durch eine Leberfibrose kommt es zur Bildung veränderter Fibronektin-Isoformen, welche über den Blutstrom andere Organe erreichen und ihre Funktion beeinflussen könnten. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Differenzierungsfähigkeit kultivierter muriner Osteoblasten durch die Gegenwart des Fibronektins oFN, einer Isoform, die in Patienten mit der Lebererkrankung primäre biliäre Zirrhose erhöht ist, nahezu vollständig inhibiert wurde. Dies wurde anhand der Knotenbildung sowie durch die Prüfung der Differenzierungsmarker Osteokalzin und alkalische Phosphatase belegt. Außerdem konnte eine Rolle der EDA-Domäne des Fibronektins zusätzlich ausgeschlossen werden. Desweiteren führte die Injektion von amniotischem Fibronektin, das oFN enthielt in gesunde Mäuse zu einer erheblichen Beeinträchtigung des Knochens, was an einer Verminderung der Knochendichte erkennbar war. Die histomorphometrische Auswertung der Knochen ergab, dass die Gegenwart von aFN eine starke Reduktion der Knochenneubildung verursachte, die durch eine drastisch verminderte Zahl von Osteoblasten hervorgerufen wurde. Zusammenfassend zeigte sich, dass fehlendes Fibronektin die Entwicklung einer Leberfibrose verstärkt und dass eine Isoform die von der erkrankten Leber vermehrt produziert wird eine schädigende Wirkung auf den Knochen ausübt.

Nuclear organisation and epigenetic regulation of gene expression in Dictyostelium discoideum

A series of vectors for the over-expression of tagged proteins in Dictyostelium were designed, constructed and tested. These vectors allow the addition of an N- or C-terminal tag (GFP, RFP, 3xFLAG, 3xHA, 6xMYC and TAP) with an optimized polylinker sequence and no additional amino acid residues at the N or C terminus. Different selectable markers (Blasticidin and gentamicin) are available as well as an extra chromosomal version; these allow copy number and thus expression level to be controlled, as well as allowing for more options with regard to complementation, co- and super-transformation. Finally, the vectors share standardized cloning sites, allowing a gene of interest to be easily transfered between the different versions of the vectors as experimental requirements evolve. The organisation and dynamics of the Dictyostelium nucleus during the cell cycle was investigated. The centromeric histone H3 (CenH3) variant serves to target the kinetochore to the centromeres and thus ensures correct chromosome segregation during mitosis and meiosis. A number of Dictyostelium histone H3-domain containing proteins as GFP-tagged fusions were expressed and it was found that one of them functions as CenH3 in this species. Like CenH3 from some other species, Dictyostelium CenH3 has an extended N-terminal domain with no similarity to any other known proteins. The targeting domain, comprising α-helix 2 and loop 1 of the histone fold is required for targeting CenH3 to centromeres. Compared to the targeting domain of other known and putative CenH3 species, Dictyostelium CenH3 has a shorter loop 1 region. The localisation of a variety of histone modifications and histone modifying enzymes was examined. Using fluorescence in situ hybridisation (FISH) and CenH3 chromatin-immunoprecipitation (ChIP) it was shown that the six telocentric centromeres contain all of the DIRS-1 and most of the DDT-A and skipper transposons. During interphase the centromeres remain attached to the centrosome resulting in a single CenH3 cluster which also contains the putative histone H3K9 methyltransferase SuvA, H3K9me3 and HP1 (heterochromatin protein 1). Except for the centromere cluster and a number of small foci at the nuclear periphery opposite the centromeres, the rest of the nucleus is largely devoid of transposons and heterochromatin associated histone modifications. At least some of the small foci correspond to the distal telomeres, suggesting that the chromosomes are organised in a Rabl-like manner. It was found that in contrast to metazoans, loading of CenH3 onto Dictyostelium centromeres occurs in late G2 phase. Transformation of Dictyostelium with vectors carrying the G418 resistance cassette typically results in the vector integrating into the genome in one or a few tandem arrays of approximately a hundred copies. In contrast, plasmids containing a Blasticidin resistance cassette integrate as single or a few copies. The behaviour of transgenes in the nucleus was examined by FISH, and it was found that low copy transgenes show apparently random distribution within the nucleus, while transgenes with more than approximately 10 copies cluster at or immediately adjacent to the centromeres in interphase cells regardless of the actual integration site along the chromosome. During mitosis the transgenes show centromere-like behaviour, and ChIP experiments show that transgenes contain the heterochromatin marker H3K9me2 and the centromeric histone variant H3v1. This clustering, and centromere-like behaviour was not observed on extrachromosomal transgenes, nor on a line where the transgene had integrated into the extrachromosomal rDNA palindrome. This suggests that it is the repetitive nature of the transgenes that causes the centromere-like behaviour. A Dictyostelium homolog of DET1, a protein largely restricted to multicellular eukaryotes where it has a role in developmental regulation was identified. As in other species Dictyostelium DET1 is nuclear localised. In ChIP experiments DET1 was found to bind the promoters of a number of developmentally regulated loci. In contrast to other species where it is an essential protein, loss of DET1 is not lethal in Dictyostelium, although viability is greatly reduced. Loss of DET1 results in delayed and abnormal development with enlarged aggregation territories. Mutant slugs displayed apparent cell type patterning with a bias towards pre-stalk cell types.

The Corticiaceae (Basidiomycetes) in Taiwan

Geographically, Taiwan is an Island and situated in the northeast of Asia, on the western side of the Pacific Basin, at the southeast of main China, south of Japan, and north of the Philippines. The main topographic character is the longitudinally oriented mountainous area. More than 200 peaks rise above 3000 m. They departed Taiwan into two lowland areas, an eastern and western plain. Taiwan is departed into subtropical (north area) and tropical zone (south area), which have a warm and humid climate, due to the Tropic of Cancer passing through. The average annual temperature in the lowland amounts to 28°C (7~38°C). The temperate climate also presents in the mountainous areas. The tropical typhoons usually come in summer and bring heavy rain, while the monsoon seasons have an important effect on the regional rainfall distribution. The mean annual rainfall of Taiwan is about 2600 mm (1000~6700 mm); the mountainous areas receive more rain than the lowlands. In Taiwan, according to different temperature and vegetation, the ecological environments were given rise to vertical biotic zonations, and form five major types: highland snowfield, highland meadow, coniferous forest, deciduous forest, and tropical forest. Six National Parks in Taiwan are located in the mountainous areas, in the north, the south, and on Jinmen Island. The National Parks represent about 8.4% of the country area. In this study, the collection sites are situated in Yangmingshan, Shei-Pa, Yushan, and Kenting National Park. Due to the island isolation, the proportions of endemic species are great in Taiwan, which also presents a high biodiversity. There are 4255 species of vascular plants including 1133 endemic. 5936 species in 1276 genera of fungi are hitherto reported in Taiwan. Among them, 233 Corticiaceae species were recorded, over one third (79 species) of them are known only from Taiwan. The first fungal report in Taiwan is about Phytophthora cyperi, published by the Japanese researcher T. Kawakami in 1904. Therefore, the history of research about fungi in Taiwan is more than one hundred years old. An eminent Japanese mycologist K. Sawada made an intensive survey from 1919 to 1959, and reported 2464 fungi species in his eleven volumes of “Descriptive Catalogue of Formosan Fungi”. However, only a few species (21 species in 9 genera) of Corticiaceae were recorded. From 1973, Chen and Lin resumed the study on Corticiaceae, and also some other foreign mycologists contributed for this field after 1980. The German research group lead by Franz Oberwinkler from Tübingen University collected in Taiwan several times. They published a number of new species and new records. Since 1989, S. H. Wu, a Taiwanese mycologist, has published a great amount of reports on corticioid fungi from Taiwan. Corticioid fungi were made up by the large and heterogeneous unnatural family Corticiaceae and other resupinate fungi belonging to other natural families in the Agaricomycetes. Molecular studies have shown that corticioid genera are distributed across all major clades of Agaricomycetes indicating that the corticioid fungi represent a polyphyletic group. They have resupinate fruitbodies and similar habitats. Species are characterized by simple fruitbody, more or less effused, and present smooth, porioid, grandinioid to odontioid hymenial surface. The fruitbodies are differently colored and usually soft to tough. Most of the Corticiaceae species are wood-saprobic organisms and gain the energy from the decomposing of wood-substrate such as cellulose or lignin. Materials for this study were collected by the author and other mycologists in Taiwan during surveys in April and May 1996, and March 2007, using the spring season with its high humidity and warm climate which are optimal conditions for the development of fungi. For assembling, the convenience sampling method was used in this study. This approach was chosen because it enables to detect a high biodiversity in a short time, and also to find species with rare or patchy distribution. The collecting sites from the North to the South include four National Parks and some preserved forests. They cover many different habitats such as low lands and high mountains. Fresh specimens were dried and analysed with a light microscope. 265 specimens belonging to Corticiaceae were studied in this research. Among them, 50 species in 21 genera including 11 new records and 10 new species were described with text and drawing. Four new species are belonging to Hyphodontia (H. sp. nov. 1, H. sp. nov. 2, H. sp. nov. 3, and H. sp. nov. 4), four to Schizopora (Sch. sp. nov. 1, Sch. sp. nov. 2, Sch. sp. nov. 3, and Sch. sp. nov. 4), one in Trechispora (T. sp. nov. 1), and one in Tubulicrinis (T. sp. nov. 1). Species recorded as new are Aleurodiscus amorphus, Botryohypochnus isabellinus, Hyphodontia cineracea, Hyphodontia palmae, Hypochnicium vellereum, Merulius tremellosus, Metulodontia nivea, Paullicorticium ansatum, Phlebia radiata, Phlebiella ardosiaca, and Xylobolus frustulatus. Besides, Botryohypochnus, Merulius, Metulodontia, Paullicorticium, and Xylobolus are also newly recorded genera in Taiwan. The genus Hyphodontia presents the highest diversity with 20 out of 50 species recorded. The second important genus is Hyphoderma, however with only 5 species. This indicates that Hyphodontia and Hyphoderma have a higher ability to develop in variable environments and approximately shows the predominance of these two genera in Taiwanese Corticiaceae. There are 11 new records out of the 50 species recorded, representing 22%. Some species, e.g. Hypochnicium vellereum and Paullicorticium ansatum were in the past recorded only in Europe and North America with cold and temperate climate. The samples of them are for the first time found in the subtropical belt, and display some difference from those of temperate regions. These collections should be molecularly investigated to clarify if they represent the same species of temperate areas. Patchily distributed species, for example Phlebiella ardosiaca, previously known only in Europe, and Hyphodontia palmae collected only in Brazil, were first recorded in different continents. Two possibilities are indicated by these new records: they are worldwide species but very rare to be found, or the Taiwanese specimens are taxonomically different. More survey from other continents and molecular study for these collections should be done in the future to solve this question. The distribution of Corticiaceae in Taiwan presents the variations in the north, central, and south areas and shows the diversity in lowlands and high mountains. The results of this study provide the evidence that the temperate Corticiaceae species displays a wider distribution. Subtropical and tropical taxa probably have also high dispersal capacities, and could possibly be found in the future in neighboring areas such as China, Japan, Korea or South Asia, but this needs further researches. In the total of 50 species, 10 new taxa were described in this study, giving about 20%. Some new species (e.g. Hyphodontia sp. 1, Hyphodontia sp. 2, and Hyphodontia sp. 3) are very similar to known species (Hyphodontia sambuci and Hyphodontia formosana), and the distinctive characters of Schizopora sp. nov. 1 are intermediate between those of Schizopora paradoxa and Hyphodontia flavipora. Thus, these small differences between the new and known species, suggest that the speciation occurred when the fungi migrated into Taiwan, due to the high diversity of environment, and amounts of the endemic plants. Taiwan is an intermediate place for the south (tropical) fungal species to migrate and adapt to north (temperate) regions. The middle and high altitude environments in Taiwan offer good conditions for the fungal speciation and possibly the occurrence of physiological changes to adapt to the temperate climate. Thus Taiwan has an important position for the biogeography of Asia mycobiota. 5936 known species in Taiwan represent about only 20% of the estimated number (24000) of Taiwanese fungal taxa. In this study, the findings (22% new records and 20% new species) indicate that amounts of unknown fungi species are expected in Taiwan. The lack of knowledge indicates that many new species are awaiting description, and fungal survey in Taiwan remains in a Pioneer phase. The last three wide surveys of Corticiaceae researches took place 20 years before this study (Chen & Lin 1977, Lin & Chen 1989, Wu 1990). After previous important contributions, the present taxonomic study comprising 21 genera is the most extensive on Corticiaceae of Taiwan.

Posttranslationale Chromatin-Modifikationen in Dictyostelium discoideum

Die Erforschung posttranslationaler Veränderungen von Chromatin-Komponenten stellt einen wichtigen Pfeiler der Epigenetik dar. Epigenetische Mechanismen verändern die Aussagekraft der DNA-Sequenz und entscheiden somit beispielsweise über die Aktivierung oder Stilllegung von Genen. Ein häufiges Ziel der Stilllegung sind springende genetische Elemente, die ansonsten zur Destabilisierung des Genoms führen können. Im Rahmen dieser Arbeit wurden zwei unterschiedliche Stilllegungsmechanismen der Transpo-sons DIRS-1 und Skipper aus Dictyostelium discoideum untersucht. Dabei konnte gezeigt werden, auf welche Weise die RNA-Interferenz (RNAi) zur Zerstörung des DIRS-1 Transkripts führt und dass die Ursache dafür in der Promotor-Aktivität des Elements selbst liegt. Eine überraschende Erkenntnis konnte auch für das zweite Element gewonnen werden. Experimente legen nahe, dass die in der kodierenden Skipper-Sequenz gefundene Chromo-Domäne zu einer gezielten Integration des Elements in bereits stillgelegte heterochromatische Bereiche führt. Diese zeichnen sich vor allem durch eine spezielle posttranslationale Histon-Modifikation, der Methylierung von Lysin 9 des Histons H3 (H3K9), aus. Während zu der Methylierung von H3K9 bereits Arbeiten erschienen sind, war ein Großteil der anderen in Dictyostelium discoideum kodierten Histon-Modifikationen bislang unbekannt. Mit Hilfe der Massenspektrometrie konnte erstmalig eine umfassende Karte der veränderten Aminosäuren erstellt werden. Dabei konnten neue, bislang für keinen Organismus beschriebene Modifikationsziele identifiziert werden. Weitere lassen durch einen Vergleich mit Modellorganismen wie Hefe und Fruchtfliege Schlüsse auf die Evolution des Histon-Codes zu. Die erstellte Karte kann in Zukunft Forschern als Grundlage dienen, um weitergehende Fragestellungen in Bezug auf die Funktionen der hier vorgestellten Modifikationen zu erforschen. Ein weiteres Ergebnis dieser Arbeit stellt die Charakterisierung posttranslationaler Veränderungen des an H3K9 bindenden Heterochromatin-Proteins 1 (HP1) dar. Neben einer ersten Analyse der in Dictyostelium discoideum vorhandenen Modifikationen der beiden Homologe HcpA und HcpB, wurde auch die Funktion der in der Chromoshadow-Domäne lokalisierten Acetylierung erforscht. Hierbei konnte gezeigt werden, dass ein Fehlen des veränderten Lysins zu einem deutlichen Phänotyp in der Sporenform und im Wachstum der Zellen führt. Als Ursache dafür konnte eine Veränderung in der Fähigkeit zur Gen-Stilllegung durch das mutierte HP1-Protein nachgewiesen werden. Dies gelang mit Hilfe eines dafür etablierten Reporters auf Basis des Gal4/UAS-Systems aus der Fruchtfliege und beweist erstmalig die Funktion einer Acetylierung der HP1-Proteine.

Charakterisierung der mikrobiellen Population und Untersuchungen zum Quorum Sensing in der Rhizosphäre vom Weidelgras (Lolium perenne) auf einer Rückstandshalde der Kaliindustrie

Im Rahmen dieser Dissertation wurden die Dynamik und die Kommunikation innerhalb der mikrobiellen Population der Rhizosphäre von Deutschem Weidelgras (Lolium perenne) untersucht, welches auf einer teilweise rekultivierten Rückstandshalde der Kaliindustrie wuchs. Um die niederschlagsbedingte Auswaschung von Salzen zu reduzieren, wird die Rückstandshalde des Kaliwerks Sigmundshall (in Bokeloh bei Hannover) schrittweise mit dem technogenen Abdecksubstrat REKAL/SAV ummantelt. Dieses weist eine hohe Standfestigkeit und Wasserspeicherkapazität auf und kann zudem begrünt werden, wofür als Pionierpflanze Lolium perenne dient. Durch diese Rekultivierung wird Niederschlag besser gespeichert und über Evapotranspiration wieder in die Luft abgegeben, was letztendlich die Bildung von Salzwasser vermindert. Da das Abdecksubstrat neben alkalischem pH-Wert auch teilweise hohe Schwermetallkonzentrationen aufweist, sollte in der vorliegenden Arbeit erstmals die mikrobielle Rhizosphären-Gemeinschaft in diesem extremen Habitat mittels einer kulturunabhängigen Methode erforscht werden. Zudem wurden erste Untersuchungen angestellt, ob im Substrat die zelldichte-abhängige bakterielle Kommunikation (Quorum Sensing) nachgewiesen werden kann. Mittels extrahierter Gesamt-DNA wurde anhand der 16S rDNA die Analyse des „Terminalen Restriktonsfragmentlängenpolymorphismus“ (TRFLP) verwendet, um die komplexe bakterielle Rhizosphären-Gemeinschaft unter zeitlichen und lokalen Aspekten zu vergleichen. Auftretende Veränderungen bei den bakteriellen Populationen der jeweiligen Proben wurden durch eine Zu- oder Abnahme der auch als Ribotypen bezeichneten terminalen Restriktionsfragmente (TRF) erfasst. Hierbei zeigten sich am Südhang der Halde während der Sommermonate der Jahre 2008 und 2009 zwar Schwankungen in den bakteriellen Gemeinschaftsprofilen, es lagen jedoch keine eindeutigen Dynamiken vor. Im Vergleich zum Südhang der Halde wies der Nordhang eine höhere Ribotyp-Diversität auf, was mit der fortgeschritteneren Rekultivierung dieses Haldenabschnitts zusammenhängen könnte. Zusätzlich wurden Bakterien aus der Rhizosphäre von Lolium perenne isoliert und mithilfe der Biosensoren Agrobacterium tumefaciens A136 pCF218 pCF372 und Chromobacterium violaceum CV026 auf die Produktion von N-Acylhomoserinlactonen (AHLs) überprüft. Diese AHLs werden von Gram-negativen Mikroorganismen als Signalmoleküle verwendet, um ihre Genexpression zelldichteabhängig zu kontrollieren. Von den 47 getesteten Gram-negativen Rhizosphärenisolaten konnten nur bei einem reproduzierbar AHL-Moleküle mithilfe des Reporterstamms A. tumefaciens nachgewiesen werden. Der AHL-Produzent wurde als Pseudomonas fluorescens identifiziert. Mittels dünnschichtchromatographischer Analysen konnten die extrahierten bakteriellen AHL-Moleküle den N-Octanoyl-L-homoserinlactonen zugeordnet werden.

Characterization of DnmA, the Dnmt2 homolog in Dictyostelium discoideum

Eukaryotic DNA m5C methyltransferases (MTases) play a major role in many epigenetic regulatory processes like genomic imprinting, X-chromosome inactivation, silencing of transposons and gene expression. Members of the two DNA m5C MTase families, Dnmt1 and Dnmt3, are relatively well studied and many details of their biological functions, biochemical properties as well as interaction partners are known. In contrast, the biological functions of the highly conserved Dnmt2 family, which appear to have non-canonical dual substrate specificity, remain enigmatic despite the efforts of many researchers. The genome of the social amoeba Dictyostelium encodes Dnmt2-homolog, the DnmA, as the only DNA m5C MTase which allowed us to study Dnmt2 function in this organism without interference by the other enzymes. The dnmA gene can be easily disrupted but the knock-out clones did not show obvious phenotypes under normal lab conditions, suggesting that the function of DnmA is not vital for the organism. It appears that the dnmA gene has a low expression profile during vegetative growth and is only 5-fold upregulated during development. Fluorescence microscopy indicated that DnmA-GFP fusions were distributed between both the nucleus and cytoplasm with some enrichment in nuclei. Interestingly, the experiments showed specific dynamics of DnmA-GFP distribution during the cell cycle. The proteins colocalized with DNA in the interphase and were mainly removed from nuclei during mitosis. DnmA functions as an active DNA m5C MTase in vivo and is responsible for weak but detectable DNA methylation of several regions in the Dictyostelium genome. Nevertheless, gel retardation assays showed only slightly higher affinity of the enzyme to dsDNA compared to ssDNA and no specificity towards various sequence contexts, although weak but detectable specificity towards AT-rich sequences was observed. This could be due to intrinsic curvature of such sequences. Furthermore, DnmA did not show denaturant-resistant covalent complexes with dsDNA in vitro, although it could form covalent adducts with ssDNA. Low binding and methyltransfer activity in vitro suggest the necessity of additional factor in DnmA function. Nevertheless, no candidates could be identified in affinity purification experiments with different tagged DnmA fusions. In this respect, it should be noted that tagged DnmA fusion preparations from Dictyostelium showed somewhat higher activity in both covalent adduct formation and methylation assays than DnmA expressed in E.coli. Thus, the presence of co-purified factors cannot be excluded. The low efficiency of complex formation by the recombinant enzyme and the failure to define interacting proteins that could be required for DNA methylation in vivo, brought up the assumption that post-translational modifications could influence target recognition and enzymatic activity. Indeed, sites of phosphorylation, methylation and acetylation were identified within the target recognition domain (TRD) of DnmA by mass spectrometry. For phosphorylation, the combination of MS data and bioinformatic analysis revealed that some of the sites could well be targets for specific kinases in vivo. Preliminary 3D modeling of DnmA protein based on homology with hDNMT2 allowed us to show that several identified phosphorylation sites located on the surface of the molecule, where they would be available for kinases. The presence of modifications almost solely within the TRD domain of DnmA could potentially modulate the mode of its interaction with the target nucleic acids. DnmA was able to form denaturant-resistant covalent intermediates with several Dictyostelium tRNAs, using as a target C38 in the anticodon loop. The formation of complexes not always correlated with the data from methylation assays, and seemed to be dependent on both sequence and structure of the tRNA substrate. The pattern, previously suggested by the Helm group for optimal methyltransferase activity of hDNMT2, appeared to contribute significantly in the formation of covalent adducts but was not the only feature of the substrate required for DnmA and hDNMT2 functions. Both enzymes required Mg2+ to form covalent complexes, which indicated that the specific structure of the target tRNA was indispensable. The dynamics of covalent adduct accumulation was different for DnmA and different tRNAs. Interestingly, the profiles of covalent adduct accumulation for different tRNAs were somewhat similar for DnmA and hDNMT2 enzymes. According to the proposed catalytic mechanism for DNA m5C MTases, the observed denaturant-resistant complexes corresponded to covalent enamine intermediates. The apparent discrepancies in the data from covalent complex formation and methylation assays may be interpreted by the possibility of alternative pathways of the catalytic mechanism, leading not to methylation but to exchange or demethylation reactions. The reversibility of enamine intermediate formation should also be considered. Curiously, native gel retardation assays showed no or little difference in binding affinities of DnmA to different RNA substrates and thus the absence of specificity in the initial enzyme binding. The meaning of the tRNA methylation as well as identification of novel RNA substrates in vivo should be the aim of further experiments.

Die Natur der Naturwissenschaften verstehen

Ein angemessenes Verständnis der Natur der Naturwissenschaften stellt eine zentrale Kompetenz naturwissenschaftlicher Grundbildung („Scientific Literacy“) dar und ist im Rahmen des Kompetenzbereichs Erkenntnisgewinnung in den nationalen Bildungsstandards in den naturwissenschaftlichen Fächern verankert. Schülerinnen und Schüler sollen demnach in der Schule Lernerfahrungen über die Grundzüge und Grenzen naturwissenschaftlicher Erkenntnisgewinnung und naturwissenschaftlichen Wissens erlangen. In dieser Arbeit liegen vier Studien vor, die sich mit Aspekten des Verstehens der Natur der Naturwissenschaften von Schülerinnen und Schülern in der Sekundarstufe I beschäftigen. In der ersten Studie, die die Entwicklung eines quantitativen Messinstruments im Blick hat, wird die Kompetenzstruktur theoretisch modelliert und empirisch überprüft. Faktorenanalytisch nachweisbare Dimensionen sind die Herkunft, Sicherheit, Entwicklung, Rechtfertigung und Einfachheit naturwissenschaftlichen Wissens, der Zweck der Naturwissenschaften und die Kreativität von Naturwissenschaftlern. Die zweite Studie nimmt den Entwicklungsaspekt des Naturwissenschaftsverständnisses in den Fokus. Lernende zeigen sowohl im längsschnittlichen Vergleich eines Schuljahres als auch im querschnittlichen Vergleich verschiedener Jahrgangsstufen einen Zuwachs hin zu höheren Klassenstufen auf. Jüngere Lernende zeigen bereits angemessene Ansichten, allerdings sind die Konzepte älterer Schülerinnen und Schüler als stabiler anzusehen als die Ansichten der Lernenden in jüngeren Jahrgangsstufen. In der dritten Studie wird die Kontextabhängigkeit des Naturwissenschaftsverständnisses untersucht. Es kann ein Zusammenhang berichtet werden zwischen den selbst berichteten Kenntnissen der Jugendlichen und ihrem Naturwissenschaftsverständnis sowie zwischen den berichteten Vorstellungen zu spezifischen Kontexten und allgemeinen Vorstellungen über die Natur der Naturwissenschaften. Abschließend wird die Bedeutung des Naturwissenschaftsverständnisses für den Erwerb wissenschaftsmethodischer Kompetenzen in den Blick genommen. Zusammenhänge zwischen den Konstrukten deuten auf inhaltliche Schnittstellen sowie Unterschiede im Kompetenzerwerb hin. Aus den Befunden lassen sich Folgerungen für eine adäquate Vermittlung von Kompetenzen des Naturwissenschaftsverständnisses ableiten. Dimensionen der Natur der Naturwissenschaften sollten sich kumulativ aufbauend in das Curriculum integrieren sowie in Bezug zum forschenden Lernen und der Vermittlung von Fachkonzepten explizit reflektiert werden.

Lipid Droplets in Dictyostelium discoideum

Lipid Droplets dienen zur Speicherung von Neutrallipiden wie z. B. Triglyceriden und Sterolestern. Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit wurde die Bildung dieser zellulären Fettspeicher in D. discoideum untersucht. Es konnte herausgefunden werden, dass Lipid Droplets entstehen, wenn die Zellen entweder in einer Suspension von Bakterien oder in Gegenwart von Palmitinsäure kultiviert werden. Die Bildung der Lipidtröpfchen wird dabei von einem schnelleren Zellwachstum, einem Anstieg des Triglyceridgehalts, einer Reduktion der Phagozytoserate und einer Abnahme des Zellvolumens begleitet. Wurde die Lipid Droplet-Bildung durch Kultivierung der Zellen mit Palmitinsäure angeregt, entsteht neben Triglyceriden noch eine weitere Verbindung, bei der es sich entweder um Fettsäureethylester oder Wachsester handelt. Eine weitere Eigenschaft von Zellen, die in Gegenwart der Palmitinsäure inkubiert wurden, ist die Fähigkeit exogene Fettsäuren schneller aufzunehmen, als normal kultivierte Zellen. Aus der vorliegenden Arbeit wurde gefolgert, dass dies durch eine zusätzliche Aufnahme der Fettsäuren über die Plasmamembran hervorgerufen wird. In Zellen, die ohne Fettsäuren inkubiert wurden, findet hingegen der Fettsäureimport über die Endosomen statt. Ein Protein, das nicht direkt am Prozess der Fettsäureaufnahme beteiligt ist, aber importierte Fettsäuren mit CoA aktiviert, ist die LC-FACS1. Aus Versuchen mit der Knockout-Mutante ging hervor, dass die aktivierten Fettsäuren, in Zellen, die zuvor mit Palmitinsäure oder Bakterien inkubiert wurden, in Triglyceride eingebaut werden. Der reduzierte Triglyceridgehalt im Knockout rief eine Erhöhung der Phagozytoserate hervor. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurden die Lipidtröpfchen mit einem Saccharosegradienten aufgereinigt. Mit Hilfe der Massenspektrometrie konnten 281 Proteine in der Lipid Droplet-Fraktion identifiziert werden. Ein Teil dieser Proteine könnte durch die Interaktion der Lipidtröpfchen mit anderen Organellen in die Lipid Droplet-Fraktion gelangt sein und ist ebenso wenig Teil des Lipid Droplet-Proteoms wie die zytoplasmatischen Proteine, die eine Verunreinigung darstellen. Vier der zehn Proteine aus der Lipid Droplet-Fraktion, die in der vorliegenden Arbeit untersucht wurden, konnten nach Kultivierung in palmitinsäurehaltigem Medium tatsächlich auf der Oberfläche der Lipidtröpfchen beobachtet werden. Eines dieser Proteine ist LSD1. Es stellt das einzige PAT-Protein in D. discoideum dar und gehört der Kategorie der CPATs an. Analog zu Perilipin/PLIN1 und Adipophilin/PLIN2 könnte LSD1 eine Schutzfunktion der Lipid Droplets vor zytoplasmatischen Lipasen haben. Neben DdLSD1 konnten auch die Proteine ADH und ALI auf den Lipidtröpfchen lokalisiert werden. Bei beiden handelt es sich um 17beta-Hydroxysteroid-Dehydrogenasen - Proteine, die eine Funktion im Lipid- oder Fettsäuremetabolismus besitzen können. Das Protein SMT katalysiert die C24-Methylierung des Sterolgerüsts in D. discoideum und war nach Inkubation der Zellen mit exogenen Fettsäuren ebenfalls auf den Lipid Droplets zu beobachten.

Artificial micro RNA system in Dictyostelium discoideum

Dictyostelium discoideum is a social amoeba that serves as a model system for RNA interference and related mechanisms. Its position between plants and animals enables evolutionary snapshot of mechanisms and protein machinery involved in investigated subjects. MiRNAs are small regulatory RNAs that are evolutionary conserved and present in animals, plants, viruses and some prokaryotes. They have roles in development, cell growth and differentiation, apoptosis and their miss-regulation is associated with many diseases such as cancer, neurodegenerative disorders and diabetes. Recently, through sequencing of DNA libraries miRNAs have been discovered in D. discoideum. In this work, it has been shown that heterologues miRNA let-7 can be expressed and processed in D. discoideum. Expression of let-7 miRNA in social amoeba resulted in a strong developmental phenotype suggesting an overload of the processing/silencing system or/and endogenous targets. The various effects on prel-7 strain have been observed and characterized, serving as a background for postulation of miRNA roles. An artificial miRNA system has been established and imposed to D. discoideum, showing that miRNAs in Dictyostelium could mediate gene expression on the level of mRNA stability and on the posttranscriptional level. Furthermore, presence of translational inhibition as a type of gene control was shown for the first time in this organism. Due to it new structures representing co-localities of miRNA and target mRNA have been detected. Taken together, this work shows functional artificial miRNA system and postulates roles of endogenous small RNA in social amoeba.

Regulation und Koordination der Proteinkinase A im cAMP-vermittelten Signalweg

Die cAMP-abhängige Proteinkinase ist an der Regulation grundlegender zellulärer Prozesse, wie Entwicklung und Differenzierung, sowie Stoffwechselprozessen, beteiligt. Das Holoenzym bestehend aus einem Dimer regulatorischer (R) und zwei katalytischer C (C) Untereinheiten wird durch den sekundären Botenstoff cAMP reguliert. Die molekulare Grundlage der Holoenzymdynamik, sowie die räumliche und zeitliche Koordination der Holoenzyme in der cAMP-vermittelten Signaltransduktion sind zentrale Themen der aktuellen Forschung. Die Dynamik wird in erster Linie durch die cAMP-Konzentration, die Isoenzymzusammensetzung und die Verfügbarkeit von Kinasesubstraten bestimmt. Klassischerweise wurde die Holoenzymdynamik auf Grundlage der Phosphotransferaseaktivität der C Untereinheit untersucht. Der Effekt von Substrat auf die apparenten Aktivierungskonstanten (cAMP) konnte aber so nicht bestimmt werden, sodass in dieser Arbeit eine alternative Methode entwickelt werden musste, die unabhängig von der Messung der Substratphosphorylierung ist. Eine Validierung dieser SPR-basierten Methode erfolgte mit Typ-I Holoenzym, wobei eine leichtere Aktivierung in Gegenwart von Substrat bestätigt werden konnte. Überraschenderweise wurde mit dieser Methode der umgekehrte Effekt von Substratpeptid auf die Aktivierung des Typ-II Holoenzyms gemessen, wobei mit steigender Substratkonzentration größere apparente Aktivierungskonstanten bestimmt wurden. Durch gerichtete Mutationen der P0-Stelle in der Autoinhibitionsdomäne konnte diese Position als eine Hauptdeterminante für die Dynamik der Holoenzyme identifiziert werden. Im Allgemeinen führen Pseudosubstratinhibitoren (RI, RIIS99A) in Abhängigkeit von der Substratkonzentration zu einer Verkleinerung, und Substratinhibitoren (RII, RIA99S) zu einer Vergrößerung der apparenten Aktivierungskonstanten der entsprechenden Holoenzyme. Bei Untersuchungen zum Phosphostatus der hRII im Holoenzymkomplex sowie während der Dissoziation in Gegenwart oder Abwesenheit von Substrat, konnte mit Serin 58 eine zweite Autophosphorylierungsstelle in der Linkerregion identifiziert werden, die ein deutlich langsameres Laufverhalten in der SDS PAGE hervorruft. Allerdings konnte dieser Stelle keine Funktion im Bezug auf die Interaktion mit der katalytischen Untereinheit sowie ausgewählten AKAPs zugesprochen werden. In dieser Arbeit konnte ein gegensätzlicher Mechanismus zur Feinregulation der Dynamik des Typ-I und –II Holoenzyms durch Substrat gezeigt und die molekulare Grundlage aufgeklärt werden. Diese bisher nicht beschriebene Autophosphorylierungsstelle könnte eine wichtige Rolle in der Konformationskontrolle des N-Terminus spielen, oder als Plattform zur Wechselwirkung mit bisher unbekannten Interaktionspartnern der hRII dienen.

Dynamic characterization of olfactory receptors in the fruit fly Drosophila melanogaster

Temporal changes in odor concentration are vitally important to many animals orienting and navigating in their environment. How are such temporal changes detected? Within the scope of the present work an accurate stimulation and analysis system was developed to examine the dynamics of physiological properties of Drosophila melanogaster olfactory receptor organs. Subsequently a new method for delivering odor stimuli was tested and used to present the first dynamic characterization of olfactory receptors at the level of single neurons. Initially, recordings of the whole antenna were conducted while stimulating with different odors. The odor delivery system allowed the dynamic characterization of the whole fly antenna, including its sensilla and receptor neurons. Based on the obtained electroantennogram data a new odor delivery method called digital sequence method was developed. In addition the degree of accuracy was enhanced, initially using electroantennograms, and later recordings of odorant receptor cells at the single sensilla level. This work shows for the first time that different odors evoked different responses within one neuron depending on the chemical structure of the odor. The present work offers new insights into the dynamic properties of olfactory transduction in Drosophila melanogaster and describes time dependent parameters underlying these properties.