Untersuchungen zum Vorkommen und molekularen Mechanismus der Biofilm-Bildung bei Enterokokken aus verschiedenen klinischen Bereichen

Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde eine größere Anzahl an E. faecalis Isolaten aus Vaginalabstrichen, erstmals insbesondere von Patientinnen, die an Bakterieller Vaginose litten, untersucht und mit E. faecalis Stämme aus verschiedenen anderen klinischen Bereichen auf das Vorkommen von Virulenzfaktoren verglichen. Weiterhin wurden Korrelationen zwischen bestimmten Faktoren und der Menge an produziertem Biofilm erstellt, um mögliche Zusammenhänge zum Mechanismus der Biofilm-Bildung zu erfassen. Mittels statistischer Analysen konnte hinsichtlich der 150 untersuchten E. faecalis Isolate nachgewiesen werden, dass keine signifikanten Unterschiede der Inzidenzen von Virulenzfaktoren (esp, asa1, gelE, GelE, cylA, β-Hämolyse) zwischen den Stämmen der verschiedenen Herkunftsbereiche bestanden. In Bezug auf das Auftreten von Biofilm-Bildung zeigte sich ein erhöhtes Vorkommen bei Stämmen aus Urin sowie invasiver Herkunft (insgesamt jeweils ca. 70 % mäßige und starke Biofilm-Bildner) im Vergleich zu E. faecalis Isolaten aus Wunden oder Faeces (je ca. 40 %). Statistische Auswertungen bzgl. des Zusammenhangs eines oder einer Kombination von Virulenzfaktoren mit der Menge an gebildetem Biofilm wiesen darauf hin, dass Isolate, die das esp Gen besaßen, in erhöhtem Maße zur Biofilm-Bildung befähigt waren. Dies zeigte einen gewissen Einfluss des Zellwandproteins auf die Fähigkeit zur Biofilm-Bildung bei E. faecalis. Allerdings wurden stets auch Stämme identifiziert, die die Fähigkeit zur Biofilm-Bildung trotz des Fehlens der jeweils untersuchten genetischen Determinante bzw. der Determinanten aufwiesen, so dass auf das Vorhandensein weiterer, unbekannter Einflussfaktoren auf den Mechanismus der Biofilm-Bildung bei E. faecalis geschlossen werden konnte. Unter 78 untersuchten E. faecium Isolaten aus verschiedenen klinischen Bereichen konnte lediglich ein Stamm (1,3 %) als mäßiger Biofilm-Bildner charakterisiert werden, so dass die Fähigkeit bei dieser Spezies in der hier untersuchten Region unter diesen Bedingungen kaum nachgewiesen werden konnte. Einen Schwerpunkt dieser Arbeit bildete die Untersuchung zum Vorkommen von Virulenzfaktoren und Biofilm-Bildung bei E. faecalis Isolaten aus Vaginalabstrichen. Bzgl. des Auftretens von Virulenzfaktoren und Biofilm-Produktion konnte kein Unterschied zwischen Stämmen assoziiert mit Bakterieller Vaginose und Isolaten einer Vergleichsgruppe festgestellt werden. Allerdings zeigte eine Gegenüberstellung mit den untersuchten E. faecalis Stämmen aus anderen klinischen Bereichen, dass die 80 Isolate aus Vaginalabstrichen eine ähnlich hohe Inzidenz bestimmter Virulenzfaktoren wie Stämme aus Faeces, Urin, Wunden oder invasiver Herkunft sowie eine mit den Isolaten aus Urin und invasiver Herkunft vergleichbar hohe Fähigkeit zur Biofilm-Bildung aufwiesen (ca. 75 % mäßige und starke Biofilm-Bildner). Dies deutete auf eine Verbreitung der Biofilm-Bildungsfähigkeit bei E. faecalis Stämmen der Vaginalflora und somit auf eine große Bedeutung der Eigenschaft für Isolate dieser Herkunft hin. Die statistische Auswertung der Korrelationen von Virulenzfaktoren mit der Menge an gebildetem Biofilm lieferte ähnliche Ergebnisse wie die Analysen bzgl. der 150 E. faecalis Isolate aus anderen klinischen Bereichen und untermauerte die Annahme, dass zusätzliche Faktoren zu den hier untersuchten Determinanten bei E. faecalis vorhanden sein müssen, die Einfluss auf den Mechanismus der Biofilm-Bildung nehmen. Deshalb konzentrierte sich ein weiterer Teil der vorliegenden Arbeit auf die Herstellung und Charakterisierung von E. faecalis Biofilm-Spontanmutanten, um bisher noch ungeklärte Mechanismen oder neue Faktoren zu erkennen, die Einfluss auf die Biofilm-Bildung bei E. faecalis nehmen. Die Untersuchung einer Mutante (1.10.16) und ihres Wildtypstamms lieferte erstmals den phänotypischen Nachweis des HMW-Komplexes der drei Bee-Proteine sowie die Identifizierung konservierter Pili-Motive dieser Proteine. Des Weiteren schien die in diesem Cluster ebenfalls codierte Sortase-1 dasjenige Enzym zu sein, das höchstwahrscheinlich die Bindung des Proteins Bee-2 innerhalb dieses HMW-Komplexes katalysiert. Insofern lieferten diese Untersuchungen neue, konkrete Hinweise zur Rolle des bee Genclusters bei der Pili-Biogenese und Biofilm-Bildung von E. faecalis. Darüber hinaus stellen Erkenntnisse aus der Charakterisierung von zwei weiteren hergestellten Biofilm-Spontanmutanten viel versprechende Ausgangspunkte für zukünftige Untersuchungen dar, die ein weitergehendes Verständnis der molekularen Mechanismen der Biofilm-Bildung bei E. faecalis erzielen könnten.

Biochemische und Zellbiologische Charakterisierung der humanen Proteinkinase X

Diese Dissertation befasst sich mit der Charakterisierung der humanen Proteinkinase (PRKX) mittels zellbiologischer (rekombinante Expression in Baculovirus, endogenes Protein, BRET) wie auch biochemischer Elemente (Aktivitaetsassays, Biacore). Dabei wurde die humane PRKX mit den Drosophila- und Maus-Isoformen DC2 und PKARE verglichen, wie auch putative Phosphorylierungsstellen durch andere Kinasen identifiziert, welche einen Einfluss auf Interaktion und Lokalisation des Enzyms haben koennten.

Die Rolle von Fibronektin in der Leber und im Knochen

In der vorliegenden Arbeit sollten der Einfluss des Fibronektins auf eine Leberfibrose und die Wirkung veränderter Fibronektin-Isoformen auf den Knochen experimentell untersucht werden. Dazu wurden konditionelle Fibronektin Knockout-Mäuse verwendet. Die spezifische Ausschaltung in hepatischen Sternzellen konnte sowohl auf der Ebene der DNA und RNA als auch anhand der gebildeten Proteinmenge bewiesen werden. Fehlendes Fibronektin hatte bereits bei gesunden Mäusen einen leichten Anstieg der Kollagenmenge zur Folge. Durch die Induktion einer Fibrose mit der Chemikalie DMN kam es zu einer auffällig starken Akkumulation von Kollagen in den konditionellen Knockout-Mäusen. Zusätzlich ließ sich eine Häufung des Fibronektins in fibrotischen Bereichen erkennen. Nachfolgend konnte die erhöhte Kollagenmenge auf eine vermehrte Aktivierung der hepatischen Sternzellen zurückgeführt werden, außerdem kam es zu einer erhöhten Proliferation dieser Zellen. In vitro Untersuchungen bestätigten eine Grundaktivierung der konditionellen Knockout-Sternzellen, welche sich durch eine Stimulation mit TGF-β noch erheblich verstärkte. Diese verstärkte Aktivierung ließ sich auf eine erhöhte Menge von TGF-β Rezeptor Typ II auf der Zellmembran zurückführen, was eine zunehmende Aktivierung der Signalmoleküle im Inneren der Sternzellen zur Folge hatte. Dabei konnte anhand von Untersuchungen des Smad4 und der p38 Kinase bewiesen werden, dass beide Wege zu einer verstärkten Kollagen Typ I Expression in den konditionellen Knockout-Sternzellen beitrugen. Letztlich zeigte sich, dass es durch fehlendes Fibronektin zu einer verstärkten Freisetzung von aktivem TGF-β kam, wodurch sich die oben beschriebenen profibrotischen Effekte erklären lassen. Durch eine Leberfibrose kommt es zur Bildung veränderter Fibronektin-Isoformen, welche über den Blutstrom andere Organe erreichen und ihre Funktion beeinflussen könnten. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Differenzierungsfähigkeit kultivierter muriner Osteoblasten durch die Gegenwart des Fibronektins oFN, einer Isoform, die in Patienten mit der Lebererkrankung primäre biliäre Zirrhose erhöht ist, nahezu vollständig inhibiert wurde. Dies wurde anhand der Knotenbildung sowie durch die Prüfung der Differenzierungsmarker Osteokalzin und alkalische Phosphatase belegt. Außerdem konnte eine Rolle der EDA-Domäne des Fibronektins zusätzlich ausgeschlossen werden. Desweiteren führte die Injektion von amniotischem Fibronektin, das oFN enthielt in gesunde Mäuse zu einer erheblichen Beeinträchtigung des Knochens, was an einer Verminderung der Knochendichte erkennbar war. Die histomorphometrische Auswertung der Knochen ergab, dass die Gegenwart von aFN eine starke Reduktion der Knochenneubildung verursachte, die durch eine drastisch verminderte Zahl von Osteoblasten hervorgerufen wurde. Zusammenfassend zeigte sich, dass fehlendes Fibronektin die Entwicklung einer Leberfibrose verstärkt und dass eine Isoform die von der erkrankten Leber vermehrt produziert wird eine schädigende Wirkung auf den Knochen ausübt.

Charakterisierung der mikrobiellen Population und Untersuchungen zum Quorum Sensing in der Rhizosphäre vom Weidelgras (Lolium perenne) auf einer Rückstandshalde der Kaliindustrie

Im Rahmen dieser Dissertation wurden die Dynamik und die Kommunikation innerhalb der mikrobiellen Population der Rhizosphäre von Deutschem Weidelgras (Lolium perenne) untersucht, welches auf einer teilweise rekultivierten Rückstandshalde der Kaliindustrie wuchs. Um die niederschlagsbedingte Auswaschung von Salzen zu reduzieren, wird die Rückstandshalde des Kaliwerks Sigmundshall (in Bokeloh bei Hannover) schrittweise mit dem technogenen Abdecksubstrat REKAL/SAV ummantelt. Dieses weist eine hohe Standfestigkeit und Wasserspeicherkapazität auf und kann zudem begrünt werden, wofür als Pionierpflanze Lolium perenne dient. Durch diese Rekultivierung wird Niederschlag besser gespeichert und über Evapotranspiration wieder in die Luft abgegeben, was letztendlich die Bildung von Salzwasser vermindert. Da das Abdecksubstrat neben alkalischem pH-Wert auch teilweise hohe Schwermetallkonzentrationen aufweist, sollte in der vorliegenden Arbeit erstmals die mikrobielle Rhizosphären-Gemeinschaft in diesem extremen Habitat mittels einer kulturunabhängigen Methode erforscht werden. Zudem wurden erste Untersuchungen angestellt, ob im Substrat die zelldichte-abhängige bakterielle Kommunikation (Quorum Sensing) nachgewiesen werden kann. Mittels extrahierter Gesamt-DNA wurde anhand der 16S rDNA die Analyse des „Terminalen Restriktonsfragmentlängenpolymorphismus“ (TRFLP) verwendet, um die komplexe bakterielle Rhizosphären-Gemeinschaft unter zeitlichen und lokalen Aspekten zu vergleichen. Auftretende Veränderungen bei den bakteriellen Populationen der jeweiligen Proben wurden durch eine Zu- oder Abnahme der auch als Ribotypen bezeichneten terminalen Restriktionsfragmente (TRF) erfasst. Hierbei zeigten sich am Südhang der Halde während der Sommermonate der Jahre 2008 und 2009 zwar Schwankungen in den bakteriellen Gemeinschaftsprofilen, es lagen jedoch keine eindeutigen Dynamiken vor. Im Vergleich zum Südhang der Halde wies der Nordhang eine höhere Ribotyp-Diversität auf, was mit der fortgeschritteneren Rekultivierung dieses Haldenabschnitts zusammenhängen könnte. Zusätzlich wurden Bakterien aus der Rhizosphäre von Lolium perenne isoliert und mithilfe der Biosensoren Agrobacterium tumefaciens A136 pCF218 pCF372 und Chromobacterium violaceum CV026 auf die Produktion von N-Acylhomoserinlactonen (AHLs) überprüft. Diese AHLs werden von Gram-negativen Mikroorganismen als Signalmoleküle verwendet, um ihre Genexpression zelldichteabhängig zu kontrollieren. Von den 47 getesteten Gram-negativen Rhizosphärenisolaten konnten nur bei einem reproduzierbar AHL-Moleküle mithilfe des Reporterstamms A. tumefaciens nachgewiesen werden. Der AHL-Produzent wurde als Pseudomonas fluorescens identifiziert. Mittels dünnschichtchromatographischer Analysen konnten die extrahierten bakteriellen AHL-Moleküle den N-Octanoyl-L-homoserinlactonen zugeordnet werden.

Numerische Untersuchungen zur Bewertung von Rührbehältern und Flotationsapparaten

Diese Arbeit behandelt die numerische Simulation von Rührbehältern und Flotationszellen mit Hilfe kommerzieller Software basierend auf einer Finite-Volumen-Methode. Ziel der Untersuchungen ist es, ein Verfahren zu entwickeln, das eine Beurteilung der Anlagen in Abhängigkeit verschiedener geometrischer und strömungsmechanischer Parameter ermöglicht und so unterstützend zur Prozessauslegung beiträgt. An zwei einfachen Geometrien (Strömungsrohr, Scheibenrührer) werden grundsätzliche Parameter und Fragestellungen erläutert, welche für die Simulation von Bedeutung sind und der Verifzierung des eingesetzten Programmpakets dienen. Die Betrachtung industriell eingesetzter Flotationsmaschinen erfolgt beispielhaft an zwei Anlagen mit unterschiedlichen Rotor-Stator-Systemen. Eine Modellzelle im Labormaßstab dient zur Berechnung der Verweilzeitverteilung und zur Charakterisierung wichtiger Einflussgrößen (Drehzahl, Volumenstrom, Durchströmungskonfiguration, Partikelmasse, Randbedingung). Die numerisch gewonnenen Ergebnisse werden dabei erfolgreich mit Experimenten validiert. Ein Flotationssegment in Originalgröße liefert weitere Ergebnisse zur Hydrodynamik. Die Berechnung wird stationär und transient vorgenommen, um die Bedeutung der Zeitabhängigkeit bewerten zu können. Damit ist ferner eine Aussage zum Einlaufverhalten der Strömung möglich, indem das Drehmoment am Rührer als Funktion der Zeit ausgewertet wird. Eine Bewertung erfolgt über die Bestimmung der Verweilzeitverteilung in Abhängigkeit verschiedener Strömungskonfigurationen.

Regulation und Koordination der Proteinkinase A im cAMP-vermittelten Signalweg

Die cAMP-abhängige Proteinkinase ist an der Regulation grundlegender zellulärer Prozesse, wie Entwicklung und Differenzierung, sowie Stoffwechselprozessen, beteiligt. Das Holoenzym bestehend aus einem Dimer regulatorischer (R) und zwei katalytischer C (C) Untereinheiten wird durch den sekundären Botenstoff cAMP reguliert. Die molekulare Grundlage der Holoenzymdynamik, sowie die räumliche und zeitliche Koordination der Holoenzyme in der cAMP-vermittelten Signaltransduktion sind zentrale Themen der aktuellen Forschung. Die Dynamik wird in erster Linie durch die cAMP-Konzentration, die Isoenzymzusammensetzung und die Verfügbarkeit von Kinasesubstraten bestimmt. Klassischerweise wurde die Holoenzymdynamik auf Grundlage der Phosphotransferaseaktivität der C Untereinheit untersucht. Der Effekt von Substrat auf die apparenten Aktivierungskonstanten (cAMP) konnte aber so nicht bestimmt werden, sodass in dieser Arbeit eine alternative Methode entwickelt werden musste, die unabhängig von der Messung der Substratphosphorylierung ist. Eine Validierung dieser SPR-basierten Methode erfolgte mit Typ-I Holoenzym, wobei eine leichtere Aktivierung in Gegenwart von Substrat bestätigt werden konnte. Überraschenderweise wurde mit dieser Methode der umgekehrte Effekt von Substratpeptid auf die Aktivierung des Typ-II Holoenzyms gemessen, wobei mit steigender Substratkonzentration größere apparente Aktivierungskonstanten bestimmt wurden. Durch gerichtete Mutationen der P0-Stelle in der Autoinhibitionsdomäne konnte diese Position als eine Hauptdeterminante für die Dynamik der Holoenzyme identifiziert werden. Im Allgemeinen führen Pseudosubstratinhibitoren (RI, RIIS99A) in Abhängigkeit von der Substratkonzentration zu einer Verkleinerung, und Substratinhibitoren (RII, RIA99S) zu einer Vergrößerung der apparenten Aktivierungskonstanten der entsprechenden Holoenzyme. Bei Untersuchungen zum Phosphostatus der hRII im Holoenzymkomplex sowie während der Dissoziation in Gegenwart oder Abwesenheit von Substrat, konnte mit Serin 58 eine zweite Autophosphorylierungsstelle in der Linkerregion identifiziert werden, die ein deutlich langsameres Laufverhalten in der SDS PAGE hervorruft. Allerdings konnte dieser Stelle keine Funktion im Bezug auf die Interaktion mit der katalytischen Untereinheit sowie ausgewählten AKAPs zugesprochen werden. In dieser Arbeit konnte ein gegensätzlicher Mechanismus zur Feinregulation der Dynamik des Typ-I und –II Holoenzyms durch Substrat gezeigt und die molekulare Grundlage aufgeklärt werden. Diese bisher nicht beschriebene Autophosphorylierungsstelle könnte eine wichtige Rolle in der Konformationskontrolle des N-Terminus spielen, oder als Plattform zur Wechselwirkung mit bisher unbekannten Interaktionspartnern der hRII dienen.

Evolutionsbiologie und Schöpfungsglaube – Dilemma?

Die Debatte zwischen Kreationismus und Evolutionsbiologie wirft die Frage bezüglich einer möglichen Verhältnisbestimmung zwischen Naturwissenschaft und Religion im Allgemeinen und dem Umgang mit dieser Problematik in der Schule auf. Die vorliegende Arbeit hat daher neben naturwissenschaftlichen und kreationistischen Vorstellungen auch die theologische Sichtweise berücksichtigt, um die Frage zu klären, ob Naturwissenschaft und Religion eine eindeutige Entscheidung für eine der beiden Perspektiven verlangt oder unter welchen Bedingungen naturwissenschaftliche und religiöse Vorstellungen miteinander in Einklang gebracht werden könnten. In diesem Zusammenhang werden im zweiten Kapitel mögliche Verhältnisbestimmungen zwischen Naturwissenschaft und Theologie aus der Perspektive der Naturwissenschaft, der Perspektive des Kreationismus sowie der Perspektive der Theologie vorgestellt und voneinander unterschieden. Um den zweiten Teil der Fragestellung bezüglich der Umsetzung des Themas in der Schule zu bearbeiten erfolgt im dritten Kapitel zunächst eine Erläuterung der nationalen Bildungsstandards für das Fach Biologie, da sie bei der Entwicklung der in Kapitel fünf vorgestellten Unterrichtssequenz berücksichtigt werden. Kapitel vier beschäftigt sich mit den Zielen, der Vorgehensweise bei der Auswahl der Quellen, sowie der Besonderheit dieser Arbeit bezüglich der Sprache. Im fünften Kapitel schließt sich die bereits erwähnte Unterrichtssequenz an. Sie ermöglicht den Schülerinnen und Schülern einen rationalen, kriteriengeleiteten Vergleich der oben genannten Sichtweisen, um sie darüber hinaus zu einer sachlichen und fachlich fundierten Beurteilung der Diskussion um Evolutionsbiologie und Schöpfungsglaube zu befähigen. Eine Diskussion, in der Möglichkeiten und Grenzen der Arbeit besprochen werden, schließt sich an, bevor im letzten Kapitel die zentralen Aussagen zusammengefasst werden.

Vorstellungen zu Zeiträumen der Evolution von Schülern der Oberstufe in Deutschland und Frankreich

Ziel der vorliegenden Arbeit ist die Erhebung der Vorstellungen von Oberstufenschülern bezüglich der Zeitdimension in der Evolution. Daneben geht es um Vorstellungen zu Mechanismen und zu zentralen Ereignissen der Evolution. Einen wichtigen Schwerpunkt stellt der Vergleich der Vorstellungen zwischen deutschen und französischen Oberstufenschülern dar, mit dem Ziel, herauszufinden, ob und in welcher Form sich curriculare Unterschiede bemerkbar machen. In einem Seminar im Wintersemester 2008/2009 zum Thema „Evolutionsbiologie im Unterricht“ waren viele Studierende erstaunt darüber, wie schwer es ihnen fiel, die Zeiträume der Evolution erfahrbar zu machen. Aufgrund des durch diese Diskussion geweckten Interesses, die Vorstellungswelten der Schüler bezüglich der Zeiträume der Evolution zu erfassen, wurde die vorliegende quantitative Studie, die an eine qualitative zum Thema „Altersabhängige Schülervorstellungen zu Massensterbeereignissen in der Evolution. Eine Interviewstudie.“ anknüpft, aufgenommen. Zur Fragebogenentwicklung diente Literatur zur Forschungsmethode, aber auch Gespräche mit der Zielgruppe sowie die Daten der qualitativen Studie. Nach einem Probelauf und der Durchführung der Umfrage mit 158 deutschen und 129 französischen Schülern, wurden die Daten mit dem Computerprogramm SPSS ausgewertet. Selbst Schüler, in deren Unterricht Zeiträume der Evolution Thema war, verfügen nicht über realistische Vorstellungen, wie sich herausstellte, als sie diese benennen oder selbständig auf einem Zeitstrahl einzeichnen sollten. Allerdings hilft eine Veranschaulichung wie Kreisdiagramme bei realitätsnahen Einschätzungen. Gemäß des Lehrplans sind französische Schüler oft mit den Zeiträumen der Evolution im Unterricht konfrontiert. Trotzdem lassen sich bei ihnen keine realistischen Vorstellungen bezüglich der Zeitdimensionen vorfinden. Französische Schüler unterscheiden sich im Antwortverhalten von deutschen Schülern. Fragebögen der französischen Schüler vermitteln den Eindruck einer oberflächlichen Beantwortung. Die Lernenden scheinen sich nicht genau mit den Inhalten auseinandergesetzt zu haben, sie legen oft unreflektiert ihr Wissen oder ihre (teils unrealistischen) Vorstellungen dar. Zudem gehen französische Schüler eher als ihre deutschen Mitschüler den Arbeitsanweisungen nach. Bezüglich der Umstände, wie die Dinosaurier und andere Tiere ausgestorben sind, verfügen deutsche und französische Schüler über realistische Vorstellungen, was unter anderem auf die häufige Repräsentation in den Medien zurückgeführt wird. Überraschend viele Schüler stellen sich in Bezug auf die Menschwerdung verzweigte Stammeslinien vor, wobei finale Vorstellungen nur selten anzutreffen sind. Sie verfügen auch hier meist über realistische Vorstellungen. Es traten in der Untersuchung geschlechtsspezifische Unterschiede auf. Vorstellungen männlicher Schüler sind überwiegend realistischer als die der weiblichen Altersgenossen. Es ist abschließend anzumerken, dass Schüler aufgrund eines großen Interesses am Thema eine intensivere Behandlung des Themas Evolution im Biologieunterricht wünschen. Durch diese Untersuchung kommt es zu einem besseren Verständnis der Vorstellungswelten der Schüler bezüglich den Zeitdimensionen, den Mechanismen und zentralen Ereignissen der Evolution. Die Erkenntnisse können in der Unterrichtsvorbereitung und im Unterricht von Nutzen sein.

Charakterisierung potentiell positiver Regulatoren der Phagozytose in Dictyostelium discoideum und deren Funktion in einem Signalweg zwischen endosomaler Verdauung und Partikelaufnahme

Dictyostelium discoideum ernährt sich in seinem natürlichen Habitat, dem Waldboden, vorwiegend von Bakterien. Diese werden aus der Umgebung über Phagozytose aufgenommen und unter anderem mit Hilfe von Lysozymen verdaut. Eines dieser Lysozyme, AlyA, wurde bereits in vorhergehenden Arbeiten detailliert untersucht. Sein Fehlen resultierte in einer zeitabhängigen Vergrößerung der Fresshöfe in Bakterienrasen. Zusätzlich waren in diesen Knockout-Mutanten auch die Phagozytoserate und die Expression eines zweiten lysosomalen Enzyms (Gp70) erhöht. Die Überexpression dieser Esterase in wildtypischen Zellen bewirkte ebenfalls, dass Partikel aus der Umgebung effektiver aufgenommen werden konnten. Da die AlyA-Mutanten und die Gp70-Überexprimierer ähnliche Phänotypen zeigten, die Proteine aber in unterschiedlichen lysosomalen Vesikeln lokalisieren, müssen weitere Proteine an der Ausbildung der Phänotypen beteiligt sein. Aus diesem Grund wurden die Genexpressionen beider Mutanten verglichen. Über Microarray-Analysen sollten auf diese Weise weitere Proteine identifiziert werden, die eine Weiterleitung des Signals von AlyA über Gp70 bis hin zur Plasmamembran vermitteln. Einigen der potentiellen Kandidaten konnte anhand der Untersuchung von Mutanten bereits eine Weiterleitung des Signals zwischen Gp70 und der erhöhten Phagozytose an der Plasmamembran zugeordnet werden. Um jedoch mehr über die Signalkette oberhalb von Gp70 zu erfahren, wurden im Rahmen dieser Arbeit drei Proteine untersucht. Die Expression von DD3-3, SSD673 und SSD485 war in den AlyA-Mutanten erhöht, in den Gp70-Überexprimierern jedoch unverändert. Durch Herstellung und Untersuchung von überexprimierenden Mutanten wurde die Wirkung jedes Proteins auf die Gp70-Expression, das Phagozytoseverhalten und den Durchmesser der Fresshöfe analysiert. Die Markierung der Kandidaten mit dem Myc-Epitop sollte deren subzelluläre Lokalisation klären. Für DD3-3-überexpimierende Klone konnte in dieser Arbeit allerdings keine Veränderung gegenüber wildtypischen Zellen festgestellt werden. Sie zeigt allerdings, dass Medium von SSD673-überexprimierenden Zellen die Phagozytoserate wildtypischer Zellen leicht erhöht. Eine starke SSD673myc-Expression führte auch zu einer verstärkten Aufnahme von Hefezellen. Die Gp70-Expression in Gesamtzelllysaten der SSD673-Mutanten blieb jedoch unverändert. Wurde in Wildtypzellen hingegen SSD485 im Übermaß exprimiert, so führte dies zu einer verstärkten Partikelaufnahme. Diese entwickelte sich ähnlich den AlyA-Knockout-Mutanten in Abhängigkeit der Zeit und ging mit einer erhöhten Gp70-Expression einher. In dieser Arbeit konnte folglich zwei von drei Proteinen eine positive Wirkung auf die Phagozytose nachgewiesen werden. SSD485-Mutanten erfüllten darüber hinaus die Bedingungen für eine Weiterleitung des AlyA-Signals von SSD485 auf Gp70 bis hin zu einer erhöhten Phagozytose.

Biologische Funktionsanalyse und Identifizierung neuer Substrate der Methyltransferase Dnmt2

Obwohl die DNA Methyltransferase 2 (Dnmt2) hoch konserviert ist und zu der am weitesten verbreiteten eukaryotischen MTase-Familie gehört, ist ihre biologische Funktion nach wie vor unklar. Nachdem lange Zeit keine DNA Methylierungsaktivität nachgewiesen werden konnte, wurde vor einigen Jahren über geringe Mengen an 5-Methylcytosin (5mC) in Retroelementen der “Dnmt2-only”-Organismen D. melanogaster, D. discoideum und E. histolytica berichtet (Kunert et al. 2003; Fisher et al. 2004; Kuhlmann et al. 2005; Phalke et al. 2009). Als kurze Zeit später robuste Methylierung der tRNAAsp durch humane Dnmt2 gezeigt wurde (Goll et al. 2006), wurde zunächst eine Dualspezifität des Enzyms vorgeschlagen (Jeltsch et al. 2006). Neuere Daten zum 5mC-Status verschiedener „Dnmt2-only“-Organismen bilden Anlass für kontroverse Diskussionen über Ausmaß und Bedeutung der DNA Methyltransferaseaktivität von Dnmt2 (Schaefer et al. 2010a; Krauss et al. 2011). Die vorliegende Arbeit konzentriert sich auf die Identifizierung neuer RNA Substrate des Dnmt2-Homologs DnmA aus D. discoideum sowie die biologische Bedeutung der tRNA-Methylierung durch Dnmt2. Wie in anderen Organismen beschrieben, fungiert auch DnmA als tRNAAsp(GUC) MTase in vitro und in vivo. Zusätzlich konnte in vitro tRNAGlu(UUC) als neues Substrat der Dnmt2-Homologe aus D. discoideum und dem Menschen identifiziert werden. In einem Kooperationsprojekt wurde außerdem auch tRNAAsp-Methylierungsaktivität für das Dnmt2-Homolog aus S. pombe (Pmt1) nachgewiesen. Crosslink-RNA-Immunopräzipitationen (RNA-CLIP) mit anschließender Next-Generation-Sequenzierung der mit DnmA assoziierten RNAs zeigen, dass DnmA mit tRNA Fragmenten interagiert, die sich vom Anticodonloop bis in den T-loop erstrecken. Neben der tRNAAsp(GUC) und tRNAGlu(UUC/CUC) sind Fragmente der tRNAGly(GCC) verstärkt angereichert. Inwiefern diese Fragmente eine biologische Funktion haben oder spezifische Degradationsprodukte darstellen, ist noch ungeklärt. Interessanterweise sind von einigen tRNAs wenige Sequenzen von antisense-Fragmenten in den RNA-CLIP Daten zu finden, die etwas kürzer, jedoch exakt komplementär zu den genannten sense-Fragmenten sind. Besonders stark sind diese Fragmente der tRNAGlu(UUC) vertreten. In einem weiteren RNA-CLIP Experiment wurden U-snRNAs, snoRNA und intergenische Sequenzen mit DnmA angereichert. Bei nachfolgenden in vitro Methylierungsstudien konnte ausschließlich die U2-snRNA als potentielles Nicht-tRNA-Substrat der hDnmt2 und DnmA identifiziert werden. Da tRNA Modifikationen im Anticodonloop die Codonerkennung beeinflussen können, wurde ein System etabliert um die Translationseffizienz eines GFP-Reportergens in Wildtyp- und dnmAKO-Zellen zu messen. In D. discoideum wird das Aspartat-Codon GAU ca. zehnmal häufiger genutzt als das GAC Codon, allerdings ist nur eine tRNAAsp(GUC) im Genom der Amöbe kodiert. Aus diesem Grund wurde zusätzlich die Frage adressiert, inwiefern die DnmA-abhängige Methylierung dieser tRNA das „Wobbling“ beeinflusst. Dazu wurde dem Reportergen jeweils eine (GAU)5- und (GAC)5-Leadersequenz vorgeschaltet. Entgegen der Annahme wurde der (GAC)5-Leader in beiden Stämmen etwas effizienter translatiert. Insgesamt zeigte der dnmAKO-Stamm eine leicht erhöhte Translationseffizienz der Reportergene. Vergleichende Analysen zur Aufnahme von Fremd-DNA zeigten signifikant reduzierte Transformationseffizienzen mit einem integrierenden Plasmid in dnmAKO-Zellen. Ein weiterer dnmAKO-Stamm zeigte diesen Effekt jedoch nicht, wobei bei derselben Mutante eine deutlich reduzierte Aufnahme eines extrachromosomalen Plasmids zu verzeichnen war. Untersuchungen zum Einfluss von DnmA auf die Regulation des Retroelements skipper ergaben keinen Zusammenhang zwischen der Generierung kleiner RNAs und der erhöhten Transkription des Retrotransposons in dnmAKO-Zellen (Kuhlmann et al. 2005). Durch Kompensationsversuche sowie Experimente mit einer weiteren dnmAKO-Mutante konnte die Mobilisierung des Retrotransposons nicht eindeutig als DnmA-Funktion eingeordnet werden. In einem weiteren Projekt wurden die Bindung des m5C-bindenden Proteins EhMLBP aus E. histolytica an DNA mittels Rasterkraftmikroskopie abgebildet (Lavi et al. 2006). Neben vermutlich unspezifischen Endbindungsereignissen konnte eine bevorzugte Bindungsstelle des Proteins an LINE DNA (long intersperesed nuclear element) identifiziert werden. Möglicherweise fällt diese mit einem von zwei A/T-reichen Bereichen der LINE DNA zusammen, von denen vermutet wird, dass diese für die Bindung von EhMLBP an DNA von Bedeutung sind. Insgesamt bestätigen die Ergebnisse dieser Arbeit die tRNAAsp Methylierungsaktivität als konservierte Dnmt2-Funktion. Darüber hinaus erweitern sie das Substratspektrum der Dnmt2-Methyltransferasen im Bereich der tRNA. Außerdem wird erstmals ein potentielles Nicht-tRNA Substrat vorgeschlagen. Zusätzlich geben neu entdeckte Phänotypen Hinweise auf vielfältige zelluläre Dnmt2-Funktionen.

Fütterungsbedingte mikrobielle Zusammensetzung von Rinderkot und deren Einfluss auf Gasemissionen und N-Mineralisierung im Boden

Um die Nährstoffeffizienz im Boden zu erhöhen und klimarelevante Gasemissionen zu minimieren, sind quantitative Informationen zu den C- und N-Fraktionen im Kot sowie deren Mineralisierungspotential nötig. Da über die Hälfte des fäkalen N mikrobiell gebunden ist, sind Methoden zur Bestimmung der mikrobiellen Kotqualität hilfreich. Ziele der ersten Publikation waren die Anwendung der CFE-Methode zur Bestimmung der mikrobiellen Biomasse in Rinderkot, Ergosterolbestimmung als Marker für die pilzliche Biomasse und Aminozuckernachweis zur Analyse der mikrobiellen Gemeinschaftsstruktur (pilzliches Glucosamin und bakterielle Muramin-säure). Mit Hilfe der CFE-Methode sollten lebende Mikroorganismen im Kot, inklusive Bakterien, Pilze und Archaeen, erfasst werden. Verschiedene Extraktionsmittel wurden für diese Methode getestet, um stabile Extrakte und reproduzierbare mikrobielle Biomasse-C- und -N-Gehalte zu erhalten. Der Einsatz von 0.05 M CuSO4 als Extraktionsmittel löste vorherige Probleme mit der Extraktion CHCl3-labiler N-Komponenten und sorgte für stabile Kotextrakte. Die Methoden wurden in einem Kotinkubationsexperiment bei 25 °C verglichen. Mikrobielle Parameter zeigten dynamische Charakteristika und mögliche Verschiebungen innerhalb der mikrobiellen Gemeinschaft. Im Kot von Färsen betrug das mittlere C/N-Verhältnis 5,6 und der mittlere Cmik/Corg-Quotient 2,2%, das Verhältnis von Ergosterol zum mikrobiellen Biomasse-C war 1,1‰. Ergosterol und Aminozuckeranalyse ergaben einen signifikanten Pilzanteil von über 40% des mikrobiellen Gesamt-C. Für die Analyse mikrobieller Parameter in Rinderkot erwiesen sich alle getesteten Methoden als geeignet. Diese wurden für die folgenden Fütterungsversuche weiter unabhängig voneinander angewendet und verglichen. Die zweite Publikation verglich eine N-defizitäre (ND) und eine ausgeglichene N-Bilanz (NB) bei der Fütterung von Milchkühen unter Berücksichtigung der Kot-inhaltsstoffe, der mikrobiellen Parameter und der Verdaulichkeit. Unterschiede zwischen Individuen und Probennahmetagen wurden ebenfalls miteinbezogen. Mittlerer mikrobieller Biomasse-C- und -N-Gehalt war 37 bzw. 4,9 mg g-1 TM. Der Pilzanteil lag diesmal bei 25% des mikrobiellen Gesamt-C. Die Fütterung zeigte signifikante Effekte auf die Kotzusammensetzung. Das fäkale C/N-Verhältnis der NB-Fütterung war signifikant niedriger als bei ND. Gleiches gilt für das C/N-Verhältnis der mikrobiellen Biomasse mit jeweils 9.1 und 7.0 für ND und NB. Auch die Verdaulichkeit wurde durch die Fütterung beeinflusst. Unverdauter Futterstickstoff, Faserstoffe (NDF) und Hemi-cellulose waren in der ND-Behandlung signifikant erhöht. Einige Parameter zeigten nur einen Einfluss der Probennahmetage, mit den angewendeten Methoden gelang jedoch der eindeutige Nachweis der Fütterungseffekte auf mikrobielle Parameter im Rinderkot, wobei sich die Fütterung in nur einer Variable unterschied. Weitere Fütterungseinflüsse auf die Kotqualität wurden schließlich auch für Rinder unterschiedlicher Leistungsstufen erforscht. Hier waren die Unterschiede in der Fütterung wesentlich größer als in den vorhergehenden Experimenten. Der Kot von Färsen, Niederleistungs- und Hochleistungskühen sowie dessen Einfluss auf N2O-Emissionen, N-Mineralisierung und pflanzliche N-Aufnahme wurden untersucht. Die Färsenfütterung mit geringem N- und hohem ADF-Anteil führte zu pilzdominiertem Kot. Besonders im Vergleich zum Kot der Hochleistungskühe war der Gehalt an mikrobiellem Biomasse-C niedrig, in Verbindung mit einem breiten mikrobiellen C/N-Verhältnis und hohem Ergosterolgehalt. Eingemischt in Boden zeigte Färsenkot die niedrigste CO2-Produktion und höchste N-Immobilisierung sowie niedrigste N2O-Emissionen während einer 14-tägigen Inkubation bei 22 °C. In einem 62-Tage-Gefäßversuch mit Welschem Weidelgras waren der Trocken-masseertrag und die pflanzliche Stickstoffaufnahme in den Färsenbehandlungen am niedrigsten. Die Stickstoffaufnahme durch die Pflanzen korrelierte positiv mit der Stickstoffkonzentration im Kot und negativ mit dem Rohfasergehalt, aber auch negativ mit dem C/N-Verhältnis der mikrobiellen Biomasse und dem Verhältnis von pilzlichem zu bakteriellem C. Mikrobielle Parameter im Kot zeigten einen größeren Zusammen-hang mit der pflanzlichen Stickstoffaufnahme als die mikrobiellen Bodenparameter.

Identifizierung und funktionelle Charakterisierung neuer A-Kinase-Ankerproteine (AKAPs) im Modellorganismus C. elegans

In dieser Arbeit sollten neue Interaktionspartner der regulatorischen Untereinheit (R-UE) der Proteinkinase A (PKA) und des Modellorganismus C. elegans identifiziert und funktionell charakterisiert werden. Im Gegensatz zu Säugern (vier Isoformen), exprimiert der Nematode nur eine PKA-R-Isoform. Mittels in silico Analysen und so genannten „Pulldown“ Experimenten, wurde insbesondere nach A Kinase Ankerproteinen (AKAP) in C. elegans gesucht. Aus in silico Recherchen resultiert das rgs5 Protein als mögliches Funktionshomolog des humanen AKAP10. Rgs5 enthält eine potenzielle, amphipathische Helix (AS 421-446, SwissProt ID A9Z1K0), die in Peptide-SPOT-Arrays (durchgeführt im Biotechnologie Zentrum in Oslo, AG Prof. K. Taskén) eine Bindung an RI und RII-UE zeigt. Eine ähnliche Lokalisation von rgs5 und hAKAP10 in der Zelle, sowie vergleichende BRET² Studien, weisen auf eine mögliche Funktionshomologie zwischen AKAP10 und rgs5 hin. Die hier durchgeführten Analysen deuten darauf hin, dass es sich bei rgs5 um ein neues, klassisches AKAP mit „RII bindender Domäne“ Motiv im Modellorganismus C. elegans handelt. Basierend auf so genannten „pulldown“ Versuchen können, neben „klassischen“ AKAPs (Interaktion über amphipathische Helices), auch Interaktionspartner ohne typische Helixmotive gefunden werden. Dazu gehört auch RACK1, ein multifunktionales Protein mit 7 WD40 Domänen, das ubiquitär exprimiert wird und bereits mehr als 70 Interaktionspartner in unterschiedlichsten Signalwegen komplexiert (Adams et al., 2011). Durch BRET² Interaktionsstudien und Oberflächenplasmonresonanz (SPR) Analysen konnten hRI und kin2 als spezifische Interaktionspartner von RACK1 verifiziert werden. Untersuchungen zur Identifikation der Interaktionsflächen der beiden Proteine RACK1 und hRI zeigten im BRET² System, dass RACK1 über die WD40 Domänen 1-2 und 6-7 interagiert. Die Analyse unterschiedlicher hRI-Deletionsmutanten deutet auf die DD-Domäne im N-Terminus und zusätzlich auf eine potenzielle BH3 Domäne im C-Terminus des Proteins als Interaktionsfläche mit RACK1 hin. Die Koexpression von hRI BH3 und RACK1 zeigt einen auffälligen ein Phänotyp in Cos7 Zellen. Dieser zeichnet sich unter anderem durch eine Degradation des Zellkerns, DNA Kondensation und eine starke Vakuolisierung aus, was beides als Anzeichen für einen programmierten Zelltod interpretiert werden könnte. Erste Untersuchungen zum Mechanismus des ausgelösten Zelltods deuten auf eine Caspase unabhängige Apoptose (Paraptose) hin und einen bislang unbekannten Funktionsmechanismus der PKA hin.

Neue Wege zur Proteinsynthese IRES-vermittelte Translation und die Bedeutung von dicistronischen mRNAs bei Drosophila

In dieser Arbeit ist die zentrale Frage, warum dicistronische mRNAs, eine für Eukaryoten untypische Organisation, existieren und wie die Translation des zweiten offenen Leserasters initiiert wird. In sieben von neun anfänglich ausgewählten Genkassetten werden tatsächlich nur dicistronische und keine monocistronischen Transkripte gebildet. Im Laufe der Evolution scheint diese Organisation nicht immer erhalten zu bleiben - es finden sich Hinweise für einen operonartigen Aufbau. Nach Transformation mit einem dicistronischen Reporterkonstrukt und in in vitro Translations-Assays weisen die beiden Genkassetten CG31311 und CG33009 eine interne ribosomale Eintrittstelle (IRES) auf, welche die Translation des zweiten Cistrons einleiten kann. Diese beiden IRESs lassen sich in einen Bereich von unter 100 nt eingrenzen. Die Funktionalität der beiden nachgewiesenen IRESs konnte in vivo in der männlichen Keimbahn von Drosophila bestätigt werden, nachdem das Vorhandensein von kryptischen Promotoren in diesen Bereichen ausgeschlossen wurde. Die anderen fünf Genkassetten hingegen zeigen keine IRES-Aktivität und nutzen wahrscheinlich alternative Methoden wie das leaky scanning oder ribosomal shunting zur Translation des zweiten Cistrons. In weiterführenden Analysen wurden sehr komplexe Expressionsmuster beobachtet, die nicht offensichtlich mit der beschriebenen mRNA Organisation in Einklang zu bringen sind. Bei der Genkassette CG33009 zum Beispiel wird das erste Protein während der gesamten Spermatogenese in den Keimzellen synthetisiert, wohingegen das zweite IRES-abhängig translatierte Protein in den die Keimzellen umschließenden Cystenzellen und zusätzlich in den elongierten Spermatiden auftritt. Diese zusätzliche Expression könnte auf Transportprozessen oder Neusynthese beruhen. Die Cystenzell-spezische Expression eines Fusionskonstruktes führte jedoch nicht zum Nachweis des Fusionsproteins in den Keimzellen. Somit ist eine durch die IRES-vermittelte Neusynthese in den elongierten Spermatiden wahrscheinlicher. Ein Verlust dieses IRES-abhängig translatierten Proteins in den Cystenzellen bringt die Spermatogenese zum Erliegen und belegt somit dessen essentielle Funktion. Bei der Genkassette CG31311 kommt es auch zu einer bemerkenswerten Auffälligkeit in der Expression. Während im Hodengewebe große Mengen an Transkript vorhanden sind, die aber nicht zu nachweisbaren Mengen an Protein führen, lässt sich in den Ommatidien ein differenziertes Expressionsmuster für beide Proteine dokumentieren, obwohl die Transkriptmenge hier unterhalb der Nachweisgrenze liegt. Diese Beobachtung suggeriert eine drastische Kontrolle auf Translationsebene, die für das Hodengewebe zum Beispiel in einer Verzögerung der Translation bis nach der Befruchtung bestehen könnte (paternale mRNA). Erste Ansätze zeigen die Interaktion der IRES von CG33009 mit RNA-bindenden Proteinen, potentiellen ITAFs (IRES trans-acting factors), deren Bindung sequenzspezisch erfolgt. In weiteren Experimenten wäre zu testen, ob die hier identifizierten IRESs mit den gleichen oder mit unterschiedlichen Proteinen interagieren.