Untersuchungen zur Biofilmbildung bei dem klinischen Isolat Enterococcus faecalis 1.10

In der vorliegenden Arbeit wurde die Biofilmbildung bei einem klinischen Isolat von Enterococcus faecalis untersucht. Der Prozess der Biofilmbildung ist in mehrere Abschnitte unterteilt und beinhaltet zu Beginn eine Anhaftung von Zellen an Oberflächen. Dieser adhäsive Schritt wird unter anderem durch Pili vermittelt. Pili bei Grampositiven Mikroorganismen sind kovalent mit der Zellwand verknüpfte Proteinstrukturen, die eine Anheftung an biotische und abiotische Oberflächen sowie den Zell-Zell-Kontakt vermitteln. Bei den Analysen dieser Doktorarbeit lag ein besonderes Interesse bei eben diesen Pili, die für Enterococcus faecalis die Namen Ebp (endocarditis and biofilm associated pili) und Bee (biofilm enhancer in enterococci) tragen. Codiert werden sie durch die entsprechenden ebp-/bee-Loci, deren Aufbau unter den Grampositiven Mikroorganismen hochkonserviert ist. Die Loci bestehen aus Pilusuntereinheiten-codierenden Genen und colokalisierten Pilus-spezifischen Sortase Genen. Während in der Regel drei verschiedene Pilusuntereinheiten vorliegen, kann die Anzahl der Sortasen zwischen einer und zwei variieren. Bei den Experimenten wurde neben einer Komplementationsstudie zu einer Bee-Pilus Defekt-Mutante (1.10.16) das Hauptaugenmerk auf die Analyse des zweiten Pilus (Ebp) gelegt, um die Pilisituation bei Isolat 1.10 im Detail darzustellen Zusätzlich sollten weitere Oberflächenassoziierte Proteinstrukturen bei Isolat 1.10 detektiert werden, die gegebenenfalls an der Biofilmbildung beteiligt sind. Weitere Versuche zur Charakterisierung des Bee-Pilus wurden im Laufe dieser Arbeit durchgeführt, blieben jedoch bisher erfolglos. Die Biofilm-/Pilus-Defekt-Mutante 1.10.16 zeigte aufgrund einer Punktmutation (Pm) in der Pilus-spezifischen Sortase 1 des bee-Locus eine geschwächte Fähigkeit zur Anheftung an abiotische Oberflächen, sowie das Fehlen der Bee2 Untereinheit im Pilus. Nach Komplementation der Mutante (1.10.16K) mit dem Wildtyp-srt1 Gen, wurde die starke Biofilmbildungsfähigkeit zurück erlangt. Die Experimente zeigten, dass der Pilus-Defekt auf die Pm im srt1 Gen zurückzuführen war und der Bee-Pilus in Stamm 1.10.16K wieder korrekt gebildet wurde. Zu sehen war dies in Rasterelektronenmikroskopischen Aufnahmen und ebenfalls im massenspektrometrischen Nachweis aller 3 Pilusuntereinheiten im Bee-Pilus charakteristischen High-Molecular-Weight Komplex (~ 250 kDa). Durch Sequenzierungen konnte gezeigt werden, dass zwei Gene des ebp-Locus (ebpR und ebpC) bei Isolat 1.10 durch die Insertion von IS-Elementen IS1062 und IS6770 inaktiviert wurden. Der proteinbiochemische Nachweis über Pilusspezifische Antikörper gegen die Untereinheiten des Ebp-Pilus verlief negativ. Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass die mRNA der beiden inaktivierten Gene nicht gebildet wurde. Dies führte folglich zum vollständigen Verlust des Ebp-Pilus bei Isolat 1.10. Zusammen mit den Ergebnissen der Komplementation konnte somit der große Einfluss mindestens eines intakten Pilus auf die Biofilmbildung gezeigt werden. Sind beide Pili durch Insertionen bzw. Mutationen inaktiviert, kommt es zu einer deutlichen Abnahme der Biofilmbildungsstärke. Dass trotzdem noch ein Biofilm gebildet wurde, zeigt den multifaktoriellen Zusammenhang bzw. Einfluss im Biofilmbildungsprozess. Über das gezielte Markieren von Oberflächenproteinen intakter Zellen mittels der Oberflächenbiotinylierung, konnten in der SDS-PAGE Unterschiede im Bandenmuster im Vergleich zur unbehandelten Probe erkannt werden. Die massenspektrometrische Identifikation dieser Proteine erfolgte bisher nicht, jedoch sind diese vorläufigen Ergebnisse vielversprechender Natur für die Identifikation und Aufklärung der Oberflächenproteinsituation bei Isolat 1.10.

Untersuchungen zur Dynamik des Lipid-Metabolismus von Dictyostelium discoideum

Die soziale Waldamöbe Dictystelium discoideum ist ein etablierter Modellorganismus zur Erforschung grundlegender zellbiologischer Prozesse. Innerhalb der letzten Jahre konnte dabei insbesondere das Wissen zum Lipidmetabolismus umfassend erweitert werden. In diesem Zusammenhang spielt besonders eine Enzymgruppe eine wichtige Rolle: die LC/VLC-Acyl-CoA-Synthetasen. Diese übernehmen dabei die Aufgabe Fettsäuren zu aktivieren, um sie so dem Zellmetabolismus überhaupt erst zugänglich zu machen. D. discoideum verfügt über insgesamt vier dieser Enzyme: FcsA, FcsB, FcsC und das Bubblegum-Enzym Acsbg1. Während die FcsA und FcsB bereits in vorangegangenen Arbeiten untersucht wurden, werden die FcsC und die Acsbg1 in dieser Arbeit erstmals biologisch charakterisiert. Untersuchungen zur subzellulären Lokalisation der Proteine zeigen, dass die meisten LC/VLC-Acyl-CoA-Synthetase auf Endosomen und im Cytoplasma gefunden werden können (FcsA, FcsC und Acsbg1), während die FcsB als Transmembranprotein über das ER zu den Peroxisomen transportiert wird. Die Acsbg1 akkumuliert dabei zusätzlich an der Plasmamembran. Funktionell konnte gezeigt werden, dass neben der FcsA auch die Acsbg1 an der Bereitstellung von Acyl-CoA für Triacylglyceridsynthese beteiligt ist. Dabei besitzt die FcsA die Hauptenzymaktivität und kompensiert den Verlust der Acsbg1 in acsbg1- Zellen. In fcsA-/acsbg1- Zellen dagegen kommt der Verlust der Acsbg1 durch eine zusätzliche Verringerung des TAG-Gehaltes der Doppel-KOs im Vergleich zu fcsA- Zellen zum tragen. Alle vier Enzyme beeinflussen die Phagozytose. Dabei zeigen fcsA- und fcsC- Zellen eine gesteigerte Phagozytose in Gegenwart von der gesättigten Fettsäure Palmitinsäure im Kulturmedium. Auch der knockout der Acsbg1 wirkt sich positiv auf die Phagozytoserate aus, jedoch kommt auch nur dieser zum tragen, wenn neben der Acsbg1 auch die FcsA ausgeschaltet wird. Die FcsB dagegen zeigt eine dramatische Reduktion der Partikelaufnahme in nicht Fettsäure gefütterten Zellen. Durch die Zugabe einer exogenen Fettsäure kann dieser Effekt nicht kompensiert werden. Auch der zusätzliche Verlust der FcsA-Enzymaktivität verändert dieses Verhalten in Palmitinsäure inkubierten Zellen nicht. In fcsA-/fcsB- konnte zudem ein Defekt beim Abbau von Triacylglyceriden gefunden werden. Dieser Defekt liefert erste Hinweise für ein Modell, das den Abbau von LD gespeicherten Lipiden durch Autophagozytose in D. discoideum beschreibt. Peroxisomen sind wichtige Organellen für die Detoxifikation und die Oxidation von Fettsäuren. Durch das Ausschalten der Acaa1, der Thiolase, die den letzten Schritt der β-Oxidation in Peroxisomen katalysiert, zeigte sich ein verlangsamter Triacylglycerol-Abbau sowie eine verringerte Degradation des Etherlipids UKL und von Sterolestern, was auf eine Beteiligung der Peroxisomen beim Abbau von langkettigen Fettsäuren schließen lässt. Bei dem Versuch durch das Ausschalten des pex19-Gens eine Zelllinie zu generieren, die keine Peroxisomen besitzt, wurde die Organelle überraschender Weise, wenn auch mit einer vom Wildtyp abweichenden Morphologie, weiterhin vorgefunden. Dieser Befund korrelierte mit dem Resultat, dass trotzdem das pex19-Gen erfolgreich unterbrochen wurde, dennoch eine intakte Kopie des Gens nachgewiesen werden konnte. Dementsprechend sollte die erschaffene pex19- Zelllinie als knockdown und nicht als knockout gewertet werden. Der pex19 knockdown zeigte beim Abbau von Triacylglyceriden eine ähnliche Verlangsamung wie acaa1- Zellen. Zusätzlich wurde eine Verringerung der Synthese des Etherlipids UKL beobachtet, was darauf hindeutet, dass dieses Lipid im Peroxisom gebildet wird. Auch die Phagozytose und das Wachstum auf Bakterienrasen waren im pex19 knockdown dramatisch reduziert. Durch die Überexpression von Pex19-GFP im knockdown Hintergrund konnten die physiologischen Defekte in den meisten so generierten Zelllinien ausgeglichen werden. Lipid Droplets sind Organellen, die in Eukaryoten und Prokaryoten als Speicher für Neutralfette dienen und ebenfalls als Ort der Lipidsynthese fungieren. Um diese Aufgaben erfüllen zu können, besitzen sie auf ihrer Oberfläche Proteine, die für die Regulierung dieser Prozesse notwendig sind. Durch die weiterführende Analyse von Kandidatenproteinen, die durch eine proteomische Analyse von aufgereinigten LDs identifiziert wurden, konnte für vier weitere Proteine (Plsc1, Net4, Lip5 und Nsdhl) die LD-Assoziation durch GFP-Fusionsproteine bestätigt werden. Bei der Charakterisierung von plsc1 knockouts zeigte sich eine verminderte Fähigkeit beim Wachstum auf Bakterienrasen sowie eine erhöhte Phagozytoserate in Gegenwart einer exogenen Fettsäure, was auf eine Involvierung des Proteins in die Phospholipidsynthese hindeutet. Die bisher einzige identifizierte LD-assoziierte Lipase Lip5 nimmt nur eine untergeordnete Rolle bei der Hydrolyse von Triacylglycerolen und Sterolestern ein, da in KO-Mutanten nur ein milder Defekt beim Abbau beider Substanzen beobachtet werden konnte. Die LD-Lokalisation von Net4 ist evolutionär konserviert und kann nicht nur in D. discoideum beobachtet werden, sondern auch in humanen Zellen. Welche Funktion das Protein auf der LD-Oberfläche ausübt, konnte nicht geklärt werden. Allerdings kann ein direkter Einfluss auf den TAG- und Sterolaufbau ausgeschlossen werden. LDs stehen in engem Kontakt mit anderen Organellen, die in den Lipidmetabolismus involviert sind, wie mit den Mitochondrien oder dem ER. Durch Perilipin-Hybridproteine können künstliche, stabile Verbindungen zwischen LDs und diesen Organellen hergestellt werden. Dabei zeigte Perilipin ein sehr starkes Targeting-Potenzial, durch welches es notwendig war, als zweite Hybridhälfte ein Transmembranprotein zu wählen. Die Analyse eines Hybrids, das eine dauerhafte Verbindung von LDs und dem ER herstellt, wies dabeieine Reduktion der LD-Größe auf, wobei der Gesamt-TAG-Gehalt der Zellen unbeeinflusst blieb. Durch die starke Affinität von Perilipin für die Assoziation an LDs konnten durch die Generierung von Hybriden andere Proteine an die LD-Oberfläche dirigiert werden. Auf diese Weise konnte erfolgreich die LC-Acyl-CoA-Synthetase FcsA auf das LD transplantiert werden.

Einfluss von Erhitzung und Gefriertrocknung auf die Lutein- und Zeaxanthin-Konzentrationen in Eigelb

Veränderungen der Matrixbindung und der molekularen Struktur der antioxidativ wirkenden Carotinoide können die Bioakzessibilität dieser Substanzen beeinflussen. Die vorliegende Studie untersuchte die Einflüsse von Erhitzung und Gefriertrocknung auf die Massenkonzentrationen der all-E- und 13-Z-Isomere von Lutein und Zeaxanthin in Eigelb und dessen Fraktionen Plasma und Granula. Dabei wurden die Strukturveränderungen der Lipoproteine, mit deren Lipiden die Eigelb-Xanthophylle assoziiert sind, betrachtet. Die Strukturentfaltungen der Low-Density und High-Density Lipoproteine (LDL und HDL) erhöhten die Extrahierbarkeit sowie Z-Isomerisierungen und oxidative Degradationen der Xanthophylle, die der Temperatureinfluss und Reaktanten katalysierten. Die Extrahierbarkeit, Z-Isomerisierungen und oxidative Degradationen der Xanthophylle waren durch den Aufschluss, die Gelbildung, die Oberflächenvergrößerung und die Erhöhung des Trockenmassegehalts der Matrix beeinflusst. Die Strukturentfaltung der in hohen Mengen in Plasma enthaltenen LDL findet bei geringeren Temperaturen (ca. 65 - 76 °C) als die der in Granula dominanten HDL (ca. 75 - 84 °C) statt. Zudem schien die gefriertrocknungsinduzierte Strukturentfaltung der LDL im Gegensatz zu HDL und Granula durch Rehydratation nicht vollständig reversibel zu sein. Daher wies Plasma eine geringere Stabilität bei der Erhitzung und Gefriertrocknung als Eigelb und Granula auf. Die Entfaltung von Lipoproteinstrukturen und die thermisch katalysierte Z-Isomerisierung sind wahrscheinlich für die signifikante 13-Z-Lutein-Zunahme nach Erhitzung von Plasma und Granula bei 82 und 87 °C sowie von Granula bei 77 °C verantwortlich. Der signifikante Verlust der all-E-Isomere der bei 87 °C erhitzten Proben von Eigelb und Granula war vermutlich durch 13-Z-Isomerisierungen und oxidative Degradationen der Xanthophylle bedingt. Marginale Veränderungen der Xanthophylle basierten vermutlich darauf, dass die multifaktoriellen Einflüsse bei der Erhitzung einander kompensierten. Die Erhitzung bei 67 °C bedingte zudem aufgrund der weitgehenden Erhaltung der Lipoproteine ähnliche Xanthophyll-Gehalte wie bei den unerhitzten Proben. Bei der Gefriertrocknung führten die Strukturentfaltung der Lipoproteine unter Abspaltung der Lipide und die abtrocknungsbedingte Oberflächenvergrößerung zu signifikanten Zunahmen der Xanthophylle bei Plasma und Granula. Dies bestätigte sich für gefriergetrocknetes Eigelb vermutlich aufgrund von oxidativen Degradationen und Aggregationen der Xanthophylle nicht. Unterschiedliche Massenkonzentrationsänderungen der Xanthophylle im Vergleich der beiden Chargen wurden mit unterschiedlichen Anteilen an ungesättigten Fettsäuren erklärt. Die charakteristischen Anteile an Proteinen und Lipoproteinen, deren Gelbildungseigenschaften und die Lipidkomposition der Lipoproteine sowie die methodisch bedingte Verdünnung von Plasma waren vermutlich für die bei Granula, Plasma und Eigelb differierenden Massenkonzentrationsänderungen der Xanthophylle verantwortlich. Die Ergebnisse ließen eine höhere 13-Z-Isomerisierungsneigung von all-E-Lutein im Vergleich zu all-E-Zeaxanthin vermuten.

Zur Interdependenz der Entwicklung der motorischen und sozialen Kompetenz in der frühen Kindheit

Das Ziel der Dissertation ist die Analyse des Verlaufs und der Differenzierung der frühkindlichen motorischen und sozialen Entwicklung. Dazu wurden über einen Zeitraum von 16 Monaten zu drei Messzeitpunkten die Entwicklungsdaten von insgesamt 138 Kindern erhoben. Bei dieser als Feldstudie konzipierten Untersuchung liegt der Fokus auf einer Analyse der kausalen Beziehung beider Entwicklungsbereiche. Häufig formulierte Annahmen hierzu konnten bisher durch den aktuellen Forschungsstand nicht bestätigt werden. Im Rahmen des längsschnittlichen, varianzanalytischen Vorgehens erfahren ausgewählte Leitsätze der Entwicklungspsychologie der Lebensspanne eine empirische Prüfung (Gewinn-Verlust-Dynamik & Direktionalität, vgl. Baltes, 1990; Willimczik, Voelcker-Rehage & Wiertz, 2006). Die Bestimmung der querschnittlichen Zusammenhänge zwischen den beiden Entwicklungsbereichen erfolgt mittels Partialkorrelationen. Die kausalen Bezüge werden mit Strukturgleichungsmodellen im Cross-Lagged Panel Design analysiert. Über die hier in einem kompetenzorientierten Ansatz verorteten Entwicklungsbereiche (motorische und soziale Kompetenz) hinaus, werden auch mögliche Zusammenhänge zwischen der Ausprägung der körperlich-sportlichen Aktivität und der sozialen Kompetenz im Querschnitt untersucht. Zur Erfassung der kindlichen Motorik dient die Testbatterie M-ABC-2 (Petermann, Henderson, Sugden & Barnett, 2009). Diese bildet primär die koordinativen Aspekte der kindlichen Motorik ab. Das kindliche Sozialverhalten wird mit dem Beobachtungsbogen SOCOMP (Perren, 2007) erfasst. Beide Instrumentarien erlauben eine in Dimensionen differenzierende Darstellung des jeweiligen Entwicklungsbereichs. Die Erhebung der körperlich-sportlichen Aktivität erfolgt anhand eines Elternfragebogens. Als Resultat der Arbeit können angenommene positive Zusammenhänge der sozialen und motorischen Kompetenz für die Phase der frühen Kindheit bestätigt werden. Auch ist ein positiver Zusammenhang zwischen einer aktiven Sportvereinsmitgliedschaft und dem sozialen Verhalten in der Peergroup zu konstatieren. Die Entwicklung der Gewinn-Verlust-Dynamik sowie der Direktionalität der Dimensionen der motorischen und sozialen Kompetenz sind für den untersuchten Zeitraum detailliert aufgearbeitet. Ein zentrales Ergebnis stellt die aufgezeigte zunehmende Differenzierung der Dimensionen beider Entwicklungsbereiche dar. Häufig angenommene und formulierte kausale Beziehungen zwischen dem Verlauf der sozialen und motorischen Kompetenz bestätigen sich dagegen nicht. Dieses Ergebnis ist jedoch differenziert zu interpretieren, was u.a. in dem methodischen Vorgehen zu den Kausalanalysen und den Anforderungen des CLP-Modells begründet liegt.

Lost in Research - Wissensmanagement in komplexen (psychoanalytischen) Forschungsprojekten

Die Wissenschaft weist im Zuge der Entwicklung von der Industrie- zu einer Wissensgesellschaft einschneidende Veränderungen in der Wissensordnung auf, welche sich bis hin zu einem zunehmenden Verlust der wissenschaftlichen Selbststeuerungsmechanismen bemerkbar machen und einen veränderten Umgang mit dem generierten Wissensschatz erfordern. Nicht nur Änderungen in der Wissensordnung und -produktion stellen die Psychoanalyse vor neue Herausforderungen: In den letzten Jahrzehnten geriet sie als Wissenschaft und Behandlungsverfahren zunehmend in die Kritik und reagierte mit einer konstruktiven Diskussion um ein dem Forschungsgegenstand – die Untersuchung unbewusster Prozesse und Fantasien – adäquates psychoanalytisches Forschungsverständnis. Die Auseinandersetzung mit Forderungen gesellschaftlicher Geldgeber, politischer Vertreter und Interessensgruppen wie auch der wissenschaftlichen Community stellt die Psychoanalyse vor besondere Herausforderungen. Um wissenschaftsexternen wie -internen Gütekriterien zu genügen, ist häufig ein hoher personeller, materieller, finanzieller, methodischer wie organisatorischer Aufwand unabdingbar, wie das Beispiel des psychoanalytischen Forschungsinstitutes Sigmund-Freud-Institut zeigt. Der steigende Aufwand schlägt sich in einer zunehmenden Komplexität des Forschungsprozesses nieder, die unter anderem in den vielschichtigen Fragestellungen und Zielsetzungen, dem vermehrt interdisziplinären, vernetzten Charakter, dem Umgang mit dem umfangreichen, hochspezialisierten Wissen, der Methodenvielfalt, etc. begründet liegt. Um jener Komplexität des Forschungsprozesses gerecht zu werden, ist es zunehmend erforderlich, Wege des Wissensmanagement zu beschreiten. Tools wie z. B. Mapping-Verfahren stellen unterstützende Werkzeuge des Wissensmanagements dar, um den Herausforderungen des Forschungsprozesses zu begegnen. In der vorliegenden Arbeit werden zunächst die veränderten Forschungsbedingungen und ihre Auswirkungen auf die Komplexität des Forschungsprozesses - insbesondere auch des psychoanalytischen Forschungsprozesses - reflektiert. Die mit der wachsenden Komplexität einhergehenden Schwierigkeiten und Herausforderungen werden am Beispiel eines interdisziplinär ausgerichteten EU-Forschungsprojektes näher illustriert. Um dieser wachsenden Komplexität psychoanalytischer Forschung erfolgreich zu begegnen, wurden in verschiedenen Forschungsprojekten am Sigmund-Freud-Institut Wissensmanagement-Maßnahmen ergriffen. In der vorliegenden Arbeit wird daher in einem zweiten Teil zunächst auf theoretische Aspekte des Wissensmanagements eingegangen, die die Grundlage der eingesetzten Wissensmanagement-Instrumente bildeten. Dabei spielen insbesondere psychologische Aspekte des Wissensmanagements eine zentrale Rolle. Zudem werden die konkreten Wissensmanagement-Tools vorgestellt, die in den verschiedenen Forschungsprojekten zum Einsatz kamen, um der wachsenden Komplexität psychoanalytischer Forschung zu begegnen. Abschließend werden die Hauptthesen der vorliegenden Arbeit noch einmal reflektiert und die geschilderten Techniken des Wissensmanagements im Hinblick auf ihre Vor- und Nachteile kritisch diskutiert.

Optimizing Robust Quantum Gates in Open Quantum Systems

We are currently at the cusp of a revolution in quantum technology that relies not just on the passive use of quantum effects, but on their active control. At the forefront of this revolution is the implementation of a quantum computer. Encoding information in quantum states as “qubits” allows to use entanglement and quantum superposition to perform calculations that are infeasible on classical computers. The fundamental challenge in the realization of quantum computers is to avoid decoherence – the loss of quantum properties – due to unwanted interaction with the environment. This thesis addresses the problem of implementing entangling two-qubit quantum gates that are robust with respect to both decoherence and classical noise. It covers three aspects: the use of efficient numerical tools for the simulation and optimal control of open and closed quantum systems, the role of advanced optimization functionals in facilitating robustness, and the application of these techniques to two of the leading implementations of quantum computation, trapped atoms and superconducting circuits. After a review of the theoretical and numerical foundations, the central part of the thesis starts with the idea of using ensemble optimization to achieve robustness with respect to both classical fluctuations in the system parameters, and decoherence. For the example of a controlled phasegate implemented with trapped Rydberg atoms, this approach is demonstrated to yield a gate that is at least one order of magnitude more robust than the best known analytic scheme. Moreover this robustness is maintained even for gate durations significantly shorter than those obtained in the analytic scheme. Superconducting circuits are a particularly promising architecture for the implementation of a quantum computer. Their flexibility is demonstrated by performing optimizations for both diagonal and non-diagonal quantum gates. In order to achieve robustness with respect to decoherence, it is essential to implement quantum gates in the shortest possible amount of time. This may be facilitated by using an optimization functional that targets an arbitrary perfect entangler, based on a geometric theory of two-qubit gates. For the example of superconducting qubits, it is shown that this approach leads to significantly shorter gate durations, higher fidelities, and faster convergence than the optimization towards specific two-qubit gates. Performing optimization in Liouville space in order to properly take into account decoherence poses significant numerical challenges, as the dimension scales quadratically compared to Hilbert space. However, it can be shown that for a unitary target, the optimization only requires propagation of at most three states, instead of a full basis of Liouville space. Both for the example of trapped Rydberg atoms, and for superconducting qubits, the successful optimization of quantum gates is demonstrated, at a significantly reduced numerical cost than was previously thought possible. Together, the results of this thesis point towards a comprehensive framework for the optimization of robust quantum gates, paving the way for the future realization of quantum computers.

Charakterisierung des Ubiquitin-ähnlichen Proteins Urm1 in Saccharomyces cerevisiae

Das ursprünglich in S. cerevisiae identifizierte Urm1 stellt aufgrund seiner dualen Funktionsweise ein besonderes UBL dar. In einem Prozess, der als Urmylierung bezeichnet wird, kann es ähnlich dem Ubiquitin kovalent mit anderen Proteinen verknüpft werden. Zusätzlich fungiert es aber auch als Schwefelträger, der an der Thiolierung des wobble-Uridins bestimmter cytoplasmatischer tRNAs beteiligt ist. Während neuere Untersuchungen zeigen, dass die Urm1-abhängige tRNA-Thiolierung zu einer effizienten Translation in Eukaryoten beiträgt, ist die Bedeutung der Urmylierung immer noch unklar. Um die Funktion der Urm1-vermittelten Proteinmodifikation weiter aufzuklären, wurde die Urmylierung des Peroxiredoxins Ahp1 im Rahmen dieser Arbeit näher untersucht. Es konnte demonstriert werden, dass Ahp1 nicht nur als Monomer, sondern auch als Dimer urmyliert vorliegt. Dies deutet darauf hin, dass die Urmylierung mit dem peroxidatischen Zyklus von Ahp1 verknüpft ist. Diese Annahme konnte durch die Untersuchung der Modifikation verschiedener ahp1-Punktmutanten bestätigt werden. Hierbei ließ sich ebenfalls zeigen, dass das Peroxiredoxin wahrscheinlich auch an alternativen Lysinresten urmyliert werden kann. Trotzdem bleibt unklar, inwiefern die Funktionalität von Ahp1 durch die Urm1-Konjugation beeinträchtigt wird. So konnte ein Einfluss der Urmylierung auf die Ahp1-vermittelte Entgiftung des Alkylhydroperoxids t-BOOH nicht festgestellt werden. Ein weiterer Schwerpunkt dieser Arbeit war die Untersuchung einer möglichen mechanistischen Verknüpfung beider Urm1-Funktionen. Es ließ sich zeigen, dass nicht nur Schwefelmangel, sondern auch ein Verlust der Schwefeltransferase Tum1 zu einer drastischen Reduktion der Urm1-Konjugation führt. Demnach wird die Urmylierung wahrscheinlich über denselben Schwefeltransferweg vermittelt, der ebenfalls zur tRNA-Thiolierung beiträgt. Trotzdem ist der Schwefeltransfer, der zur Urm1-Aktivierung führt, womöglich komplexer als bisher angenommen. Wurden die vermuteten katalytischen Cysteine des Urm1-Aktivatorproteins Uba4 mutiert oder dessen C-terminale RHD entfernt, waren eine gehemmte Urmylierung und tRNA-Thiolierung weiterhin nachweisbar. Somit scheint ein Schwefeltransfer auf Urm1 auch ohne direkte Beteiligung von Uba4 möglich zu sein. In dieser Arbeit ließ sich außerdem zeigen, dass Urm1 in Hefe durch sein humanes Homolog funktional ersetzt werden kann. Dies ist ein Hinweis dafür, dass der Urm1-Weg in allen Eukaryoten gleich funktioniert und konserviert ist. Darüber hinaus scheint für die Urmylierung auch eine Konservierung der Substratspezifität gegeben zu sein. Der Nachweis einer Uba4-Urmylierung in Hefe könnte durchaus darauf hindeuten.

Genregulation in der Drosophila Spermatogenese am Beispiel der Mst(3)CGP-Genfamilie

In dieser Dissertation wird die Rolle des zentralen Kontrollelementes TCE auf unterschiedlichen Ebenen der Genexpression untersucht. Das TCE verhindert die Translation prämeiotisch gebildeter mRNAs in der Spermatogenese von Drosophila bis zu einem späten postmeiotischen Stadium. Gleichzeitig provoziert es Transkriptionsaktivität. Das TCE wurde zunächst in einer kleinen Genfamilie identifiziert und am Beispiel des Gens Mst87F detaillierter untersucht. In EMSA-Experimenten wurde die Komplexbildung mit regulatorischen Proteinen aus Proteinextrakten des Hodengewebes am TCE der Mst87F mRNA nachgewiesen. Massenspektrometrische Analysen ergaben u.a. die Kandidatenproteine Exuperantia (Exu), dFmr1 und CG3213. Die Komplexbildung an einem zweiten Mitglied der Genfamilie - Mst98Ca -, welches sich in der Genstruktur und dem Proteinaufbau von Mst87F unterscheidet, belegt die Allgemeingültigkeit dieser Interaktion. Beim Einsatz von veränderten TCE-Sequenzen ergibt sich ein abweichendes Erscheinungsbild der Komplexe, was mit dem Verlust der Funktion korreliert. Auch die Komplexbildung mit den rekombinanten Proteinen von exuperantia und dfmr1 erfolgt an beiden RNAs in gleicher Weise. In Kombination wird ein stärkerer Shift erzeugt. In einer Exu-defizienten Mutante beobachtet man drastische Veränderungen in der Lokalisation von einem Mst87F-GFP- bzw. CG3213-GFP-Fusionsprotein. Analysen mittels der qPCR zeigen eine drastische Verringerung der Mst87F mRNA Menge. Beides lässt vermuten, dass das Fehlen von Exu bereits in frühen Stadien zu molekularen Defekten führt. Um die Translationskontrolle zu umgehen, wurden Transgene mit einer IRES (aus dem Gen reaper) an verschiedenen Positionen des 5'UTRs erzeugt. Die erwartete Translationsinitiation durch die IRES blieb aus. Northern- und qPCR-Analysen zeigen eine starke Reduktion des mRNA-Niveaus. Somit kann aufgrund der drastischen Deregulation auf Transkriptionsebene der Effekt auf die Translationskontrolle nicht mehr analysiert werden. Überraschenderweise wurden durch die Verwendung einer anderen IRES (aus der Genkassette CG31311) die Expressionscharakteristika des Ursprungsgens auf Mst87F übertragen. Das Fusionsprotein lässt sich plötzlich in den Ommatidien der Komplexaugen nachweisen. Da aus früheren Arbeiten bereits eine Rolle des TCE auf Transkriptionsebene nachgewiesen ist, wurde die Komplexbildung auf Mst87F-DNA-Fragmente mit TCE ausgedehnt. Analysen unter Verwendung der rekombinanten Proteine Exu und dFmr1 verliefen negativ. Daraufhin sollten massenspektrometrische Experimente neue Kandidaten für regulatorische Proteine auf DNA-Ebene identifizieren. Von vier weiteren Kandidaten zeigen zwei unter RNAi-Einfluß komplette Sterilität und starke Defekte in der Spermienentwicklung.

Water loss management strategies for developing countries

Diese Arbeit beschäftigt sich mit nicht in Rechnung stellbaren Wasserverlusten in städtischen Versorgungsnetzen in Entwicklungsländern. Es soll das Wissen über diese Verluste erweitert und aufgezeigt werden, ob diese auf ein ökonomisch vertretbares Maß reduziert werden können. Die vorliegende Doktorarbeit untersucht solche unberechneten Wasserverluste und versucht, neben der Quantifizierung von Leckagen auch Entscheidungswerkzeuge für ein verbessertes Management der Versorgungsnetze in Entwicklungsländern zu erarbeiten. Als Fallstudie dient Harare, die Hauptstadt von Simbabwe. Wasserverluste in Verteilungsnetzen sind unvermeidbar, sollten aber auf ein ökonomisch tragbares Niveau reduziert werden, wenn ein nachhaltiger Betrieb erreicht werden soll. Wasserverluste können sowohl durch illegale und ungenehmigte Anschlüsse oder durch Undichtigkeiten im Verteilnetz, als auch durch mangelhafte Mess- und Berechnungssysteme entstehen. Es sind bereits viele Ansätze zur Verringerung von Verlusten in Wasserverteilsystemen bekannt geworden, entsprechend existieren dazu auch zahlreiche Methoden und Werkzeuge. Diese reichen von computergestützten Verfahren über gesetzliche und politische Vorgaben sowie ökonomische Berechnungen bis hin zu Maßnahmen der Modernisierung der Infrastruktur. Der Erfolg dieser Anstrengungen ist abhängig von der Umsetzbarkeit und dem Umfeld, in dem diese Maßnahmen durchgeführt werden. Die Bewertung der Arbeitsgüte einer jeden Wasserversorgungseinheit basiert auf der Effektivität des jeweiligen Verteilungssystems. Leistungs- und Bewertungszahlen sind die meist genutzten Ansätze, um Wasserverteilsysteme und ihre Effizienz einzustufen. Weltweit haben sich zur Bewertung als Indikatoren die finanzielle und die technische Leistungsfähigkeit durchgesetzt. Die eigene Untersuchung zeigt, dass diese Indikatoren in vielen Wasserversorgungssystemen der Entwicklungsländer nicht zur Einführung von Verlust reduzierenden Managementstrategien geführt haben. Viele durchgeführte Studien über die Einführung von Maßnahmen zur Verlustreduzierung beachten nur das gesamte nicht in Rechnung stellbare Wasser, ohne aber den Anteil der Leckagen an der Gesamthöhe zu bestimmen. Damit ist keine Aussage über die tatsächliche Zuordnung der Verluste möglich. Aus diesem Grund ist ein Bewertungsinstrument notwendig, mit dem die Verluste den verschiedenen Ursachen zugeordnet werden können. Ein solches Rechenwerkzeug ist das South African Night Flow Analysis Model (SANFLOW) der südafrikanischen Wasser-Forschungskommission, das Untersuchungen von Wasserdurchfluss und Anlagendruck in einzelnen Verteilbezirken ermöglicht. In der vorliegenden Arbeit konnte nachgewiesen werden, dass das SANFLOW-Modell gut zur Bestimmung des Leckageanteiles verwendet werden kann. Daraus kann gefolgert werden, dass dieses Modell ein geeignetes und gut anpassbares Analysewerkzeug für Entwicklungsländer ist. Solche computergestützte Berechnungsansätze können zur Bestimmung von Leckagen in Wasserverteilungsnetzen eingesetzt werden. Eine weitere Möglichkeit ist der Einsatz von Künstlichen Neuronalen Netzen (Artificial Neural Network – ANN), die trainiert und dann zur Vorhersage der dynamischen Verhältnisse in Wasserversorgungssystemen genutzt werden können. Diese Werte können mit der Wassernachfrage eines definierten Bezirks verglichen werden. Zur Untersuchung wurde ein Mehrschichtiges Künstliches Neuronales Netz mit Fehlerrückführung zur Modellierung des Wasserflusses in einem überwachten Abschnitt eingesetzt. Zur Bestimmung des Wasserbedarfes wurde ein MATLAB Algorithmus entwickelt. Aus der Differenz der aktuellen und des simulierten Wassernachfrage konnte die Leckagerate des Wasserversorgungssystems ermittelt werden. Es konnte gezeigt werden, dass mit dem angelernten Neuronalen Netzwerk eine Vorhersage des Wasserflusses mit einer Genauigkeit von 99% möglich ist. Daraus lässt sich die Eignung von ANNs als flexibler und wirkungsvoller Ansatz zur Leckagedetektion in der Wasserversorgung ableiten. Die Untersuchung zeigte weiterhin, dass im Versorgungsnetz von Harare 36 % des eingespeisten Wassers verloren geht. Davon wiederum sind 33 % auf Leckagen zurückzuführen. Umgerechnet bedeutet dies einen finanziellen Verlust von monatlich 1 Millionen Dollar, was 20 % der Gesamteinnahmen der Stadt entspricht. Der Stadtverwaltung von Harare wird daher empfohlen, aktiv an der Beseitigung der Leckagen zu arbeiten, da diese hohen Verluste den Versorgungsbetrieb negativ beeinflussen. Abschließend wird in der Arbeit ein integriertes Leckage-Managementsystem vorgeschlagen, das den Wasserversorgern eine Entscheidungshilfe bei zu ergreifenden Maßnahmen zur Instandhaltung des Verteilnetzes geben soll.