Regulation und Koordination der Proteinkinase A im cAMP-vermittelten Signalweg

Die cAMP-abhängige Proteinkinase ist an der Regulation grundlegender zellulärer Prozesse, wie Entwicklung und Differenzierung, sowie Stoffwechselprozessen, beteiligt. Das Holoenzym bestehend aus einem Dimer regulatorischer (R) und zwei katalytischer C (C) Untereinheiten wird durch den sekundären Botenstoff cAMP reguliert. Die molekulare Grundlage der Holoenzymdynamik, sowie die räumliche und zeitliche Koordination der Holoenzyme in der cAMP-vermittelten Signaltransduktion sind zentrale Themen der aktuellen Forschung. Die Dynamik wird in erster Linie durch die cAMP-Konzentration, die Isoenzymzusammensetzung und die Verfügbarkeit von Kinasesubstraten bestimmt. Klassischerweise wurde die Holoenzymdynamik auf Grundlage der Phosphotransferaseaktivität der C Untereinheit untersucht. Der Effekt von Substrat auf die apparenten Aktivierungskonstanten (cAMP) konnte aber so nicht bestimmt werden, sodass in dieser Arbeit eine alternative Methode entwickelt werden musste, die unabhängig von der Messung der Substratphosphorylierung ist. Eine Validierung dieser SPR-basierten Methode erfolgte mit Typ-I Holoenzym, wobei eine leichtere Aktivierung in Gegenwart von Substrat bestätigt werden konnte. Überraschenderweise wurde mit dieser Methode der umgekehrte Effekt von Substratpeptid auf die Aktivierung des Typ-II Holoenzyms gemessen, wobei mit steigender Substratkonzentration größere apparente Aktivierungskonstanten bestimmt wurden. Durch gerichtete Mutationen der P0-Stelle in der Autoinhibitionsdomäne konnte diese Position als eine Hauptdeterminante für die Dynamik der Holoenzyme identifiziert werden. Im Allgemeinen führen Pseudosubstratinhibitoren (RI, RIIS99A) in Abhängigkeit von der Substratkonzentration zu einer Verkleinerung, und Substratinhibitoren (RII, RIA99S) zu einer Vergrößerung der apparenten Aktivierungskonstanten der entsprechenden Holoenzyme. Bei Untersuchungen zum Phosphostatus der hRII im Holoenzymkomplex sowie während der Dissoziation in Gegenwart oder Abwesenheit von Substrat, konnte mit Serin 58 eine zweite Autophosphorylierungsstelle in der Linkerregion identifiziert werden, die ein deutlich langsameres Laufverhalten in der SDS PAGE hervorruft. Allerdings konnte dieser Stelle keine Funktion im Bezug auf die Interaktion mit der katalytischen Untereinheit sowie ausgewählten AKAPs zugesprochen werden. In dieser Arbeit konnte ein gegensätzlicher Mechanismus zur Feinregulation der Dynamik des Typ-I und –II Holoenzyms durch Substrat gezeigt und die molekulare Grundlage aufgeklärt werden. Diese bisher nicht beschriebene Autophosphorylierungsstelle könnte eine wichtige Rolle in der Konformationskontrolle des N-Terminus spielen, oder als Plattform zur Wechselwirkung mit bisher unbekannten Interaktionspartnern der hRII dienen.

Teamentwicklung im Sportunterricht

Die Dissertation „Teamentwicklung im Sportunterricht. Eine experimentelle Studie zur Wirksamkeit eines erlebnispädagogischen Sportprogramms.“ ist im pädagogischen Kontext eines Erziehenden Sportunterrichts verortet - ein Kontext, der bislang im Bereich sportunterrichtlicher Forschung wenig Beachtung gefunden hat. Um diesem Mangel an fachpraktischen Konzepten als auch an empirischen Wirkungsstudien entgegenzuwirken, war es Ziel der vorliegenden Forschungsarbeit anhand eines experimentellen Kontrollgruppenplans die Auswirkungen von zwei verschieden gerichteten Sportprogrammen auf die soziale Entwicklung von Schulsportgruppen zu untersuchen. Die Ausgangsbasis der Dissertation bildeten dabei folgende Leitfragen: (1) Welche spezifischen sozialen Prozesse finden in verschieden gerichteten Sportprogrammen statt? (2) Durch welche sportunterrichtlichen Maßnahmen kann soziale Interaktion verbessert werden? Die Arbeit ist in einen Theorie-Teil (Kapitel 2 und 3) und einen Empirie-Teil (Kapitel 4 bis 6) gegliedert. Im Kapitel 2 werden auf Basis von psychologischer und sportwissenschaftlicher Literatur die Grundlagen der Gruppentheorie und der Gruppenentwicklung expliziert. Insbesondere wird die Anpassung des für die Untersuchung leitenden theoretischen Modells - des Modells der Gruppenentwicklung von Tuckman (1965) - an den schulischen Kontext vorgenommen. Daran anknüpfend werden in Kapitel 3 wesentliche Aspekte für das teamentwicklungsbasierte Lernarrangement, welches das Treatment der Experimentalgruppe darstellt, herausgearbeitet. In dem 17 Doppelstunden umfassenden Unterrichtsvorhaben der Hauptuntersuchung lag der Schwerpunkt vor allem auf erlebnispädagogisch orientierten Bewegungsaktivitäten. Der Gruppenprozess und die Kooperative Gruppenleistung wurden als abhängige Variablen erfasst. Die spezifische qualitative Struktur des teamentwicklungsbasierten Lernarrangements wurde für die empirische Untersuchung in drei Unterrichtsblöcken umgesetzt. Im Kapitel 4 wird die Methode der empirischen Untersuchung erläutert. Es erfolgt eine Eingrenzung der drei zentralen Gegenstandsbereiche (I=Gruppenprozess; II=Kooperative Gruppenleistung; III=Geschlechtsspezifik), die Vorstellung des Untersuchungsdesigns sowie eine ausführliche Darlegung der benutzten Untersuchungsinstrumente der empirischen Untersuchung. Das Untersuchungsdesign folgt einem experimentellen Prä-Post-Kontrollgruppendesign, dessen Basis ein randomisierter Untersuchungsplan bildet. Mit diesem wird die Auswirkung des erlebnispädagogisch orientierten Lernarrangements auf der einen Seite versus dem traditionell gerichteten Sportprogramm auf der anderen Seite auf die Entwicklung des Gruppenprozesses und der Kooperativen Gruppenleistung untersucht. Für den Gegenstandsbereich Gruppenprozess (Untersuchungsinstrument: Fragebogen) und für den Gegenstandsbereich Kooperative Gruppenleistung (Untersuchungsinstrument: Beobachtung anhand eines Beurteilungsinventars) werden sieben theoriegeleitete Hypothesen formuliert. Der Hypothesen generierende Gegenstandsbereich III (Geschlechtsspezifik) enthält zwei Hypothesen erkundende Annahmen. Die Ergebnisse der empirischen Untersuchung werden in Kapitel 5 vorgestellt. Anhand der umfassenden Hypothesenprüfungen ergeben sich Effekte, die auf eine spezifische soziale Entwicklung durch das experimentelle Treatment hinweisen: Die Experimentalgruppe wies zu Beginn nur wenig gefestigte Gruppenbeziehungen und eine große soziale Dynamik auf. Im letzten Drittel der Intervention verbesserten und stabilisierten sich jedoch die Gruppenbeziehungen. Ebenso verbesserte sich bei der Experimentalgruppe vom Prätest zum Posttest 1 bzw. Posttest 2 die Kooperative Gruppenleistung. Bei der Kontrollgruppe zeigten sich hingegen über den gesamten Interventionszeitraum nur geringe soziale Veränderungen. Insgesamt belegen die inferenzstatistischen Testergebnisse zwischen der Experimental- und der Kontrollgruppe deutliche Unterschiede in der Entwicklung der beiden abhängigen Variablen. Die Befunde zeigen, dass das experimentelle Treatment, d. h. das erlebnispädagogisch orientierte und teamentwicklungsbasierte Lernarrangement eine quantifizierbare positive Wirkung auf den Gruppenprozess und die Kooperative Gruppenleistung hatte. Den Abschluss der Dissertation bilden eine Diskussion und ein Resümee (Kapitel 6). Neben der Interpretation der Ergebnisse werden die Untersuchungsmethode beurteilt sowie weiterführende Perspektiven aufgezeigt.

Application of biogas slurries from energy crops to arable soils and their impact on carbon and nitrogen dynamics

The use of renewable primary products as co-substrate or single substrate for biogas production has increased consistently over the last few years. Maize silage is the preferential energy crop used for fermentation due to its high methane (CH4) yield per hectare. Equally, the by-product, namely biogas slurry (BS), is used with increasing frequency as organic fertilizer to return nutrients to the soil and to maintain or increase the organic matter stocks and soil fertility. Studies concerning the application of energy crop-derived BS on the carbon (C) and nitrogen (N) mineralization dynamics are scarce. Thus, this thesis focused on the following objectives: I) The determination of the effects caused by rainfall patterns on the C and N dynamics from two contrasting organic fertilizers, namely BS from maize silage and composted cattle manure (CM), by monitoring emissions of nitrous oxide (N2O), carbon dioxide (CO2) and CH4 as well as leaching losses of C and N. II) The investigation of the impact of differences in soil moisture content after the application of BS and temperature on gaseous emissions (CO2, N2O and CH4) and leaching of C and N compounds. III) A comparison of BS properties obtained from biogas plants with different substrate inputs and operating parameters and their effect on C and N dynamics after application to differently textured soils with varying application rates and water contents. For the objectives I) and II) two experiments (experiment I and II) using undisturbed soil cores of a Haplic Luvisol were carried out. Objective III) was studied on a third experiment (experiment III) with disturbed soil samples. During experiment I three rainfall patterns were implemented including constant irrigation, continuous irrigation with periodic heavy rainfall events, and partial drying with rewetting periods. Biogas slurry and CM were applied at a rate of 100 kg N ha-1. During experiment II constant irrigation and an irrigation pattern with partial drying with rewetting periods were carried out at 13.5°C and 23.5°C. The application of BS took place either directly before a rewetting period or one week after the rewetting period stopped. Experiment III included two soils of different texture which were mixed with ten BS’s originating from ten different biogas plants. Treatments included low, medium and high BS-N application rates and water contents ranging from 50% to 100% of water holding capacity (WHC). Experiment I and II showed that after the application of BS cumulative N2O emissions were 4 times (162 mg N2O-N m-2) higher compared to the application of CM caused by a higher content of mineral N (Nmin) in the form of ammonium (NH4+) in the BS. The cumulative emissions of CO2, however, were on the same level for both fertilizers indicating similar amounts of readily available C after composting and fermentation of organic material. Leaching losses occurred predominantly in the mineral form of nitrate (NO3-) and were higher in BS amended soils (9 mg NO3--N m-2) compared to CM amended soils (5 mg NO3--N m-2). The rainfall pattern in experiment I and II merely affected the temporal production of C and N emissions resulting in reduced CO2 and enhanced N2O emissions during stronger irrigation events, but showed no effect on the cumulative emissions. Overall, a significant increase of CH4 consumption under inconstant irrigation was found. The time of fertilization had no effect on the overall C and N dynamics. Increasing temperature from 13.5°C to 23.5°C enhanced the CO2 and N2O emissions by a factor of 1.7 and 3.7, respectively. Due to the increased microbial activity with increasing temperature soil respiration was enhanced. This led to decreasing oxygen (O2) contents which in turn promoted denitrification in soil due to the extension of anaerobic microsites. Leaching losses of NO3- were also significantly affected by increasing temperature whereas the consumption of CH4 was not affected. The third experiment showed that the input materials of biogas plants affected the properties of the resulting BS. In particular the contents of DM and NH4+ were determined by the amount of added plant biomass and excrement-based biomass, respectively. Correlations between BS properties and CO2 or N2O emissions were not detected. Solely the ammonia (NH3) emissions showed a positive correlation with NH4+ content in BS as well as a negative correlation with the total C (Ct) content. The BS-N application rates affected the relative CO2 emissions (% of C supplied with BS) when applied to silty soil as well as the relative N2O emissions (% of N supplied with BS) when applied to sandy soil. The impacts on the C and N dynamics induced by BS application were exceeded by the differences induced by soil texture. Presumably, due to the higher clay content in silty soils, organic matter was stabilized by organo-mineral interactions and NH4+ was adsorbed at the cation exchange sites. Different water contents induced highest CO2 emissions and therefore optimal conditions for microbial activity at 75% of WHC in both soils. Cumulative nitrification was also highest at 75% and 50% of WHC whereas the relative N2O emissions increased with water content and showed higher N2O losses in sandy soils. In summary it can be stated that the findings of the present thesis confirmed the high fertilizer value of BS’s, caused by high concentrations of NH4+ and labile organic compounds such as readily available carbon. These attributes of BS’s are to a great extent independent of the input materials of biogas plants. However, considerably gaseous and leaching losses of N may occur especially at high moisture contents. The emissions of N2O after field application corresponded with those of animal slurries.

Analyse von Protein-Ligand Interaktionen zur Charakterisierung zyklonukleotidbindender Proteine

Hyperpolarisations-aktivierte zyklonukleotid-gesteuerte (HCN) Kanäle übernehmen wichtige Funktionen in der Regulation der Herz- und Neuronalaktivität und können über einen dualen Mechanismus aus Membranhyperpolarisation und der Bindung von zyklischen Nukleotiden aktiviert werden. Ein großes Ziel der aktuellen Forschung ist die Entwicklung neuartiger Inhibitoren, die einer Fehlregulation der Kanäle entgegenwirken. In der vorliegenden Arbeit wurde die Regulation von HCN Kanälen durch zyklische Nukleotide im Detail analysiert, indem erstmals ein umfassender Screen mit 48 unterschiedlichen Zyklonukleotid-Analoga am C-terminalen Bereich (bestehend aus C-Linker und Zyklonukleotid-Bindedomäne) der drei Isoformen HCN1, HCN2 und HCN4 durchgeführt wurde. Mit Hilfe eines Fluoreszenzpolarisations-Assays wurde der Einfluss von Modifikationen in der Base, der Ribose und dem zyklischen Phosphat auf die Bindungsaffinitäten innerhalb der Zyklonukleotid-Bindedomäne untersucht. Zyklonukleotid-Analoga mit Modifikationen an der Position 7 und 8 der Base verschoben die apparenten Affinitäten im Vergleich zu den beiden natürlich vorkommenden Zyklonukleotiden cAMP und cGMP vom mikromolaren in den nanomolaren Bereich. Selektiv für die HCN4 Isoform erwiesen sich Zyklonukleotid-Analoga mit Modifikationen an der Position 6 der Base, während Modifikationen an der Position 8 der Base zu einer höheren Affinität für die HCN2 Isoform führten. Im Gegensatz zu HCN2 und HCN4 zeigte die HCN1 Isoform besonders hohe Affinitäten für Zyklonukleotid-Analoga mit Modifikationen an der Position 8 von cGMP. Eine Substitution der 2’-Hydroxylgruppe erlaubte keine Bindung an die HCN Kanäle. Mit 7-CH-cAMP konnte ein hochaffines Bindemolekül für HCN Kanäle identifiziert werden, denn der Austausch eines Stickstoffs gegen eine CH-Einheit an Position 7 der Base führte zu einer 100-fachen Steigerung der Affinität im Vergleich zu cAMP. In Übereinstimmung mit der hochaffinen Bindung konnte in kinetischen Analysen eine langsamere Dissoziationsrate für 7-CH-cAMP gemessen werden. Anhand thermodynamischer Messungen konnte ein entropisch favorisierter Bindungsmodus für 7-CH-cAMP im Vergleich zu cAMP identifiziert werden. Basierend auf einer Kristallstruktur des HCN4 CNBD:7-CH-cAMP Komplexes (2,5 Å) lässt sich erklären, dass 7-CH-cAMP durch seine höhere Lipohilie im Vergleich zu cAMP eine stärkere Präferenz für das hydrophobe Netzwerk zwischen Protein und Base besitzt. In detaillierten, vergleichenden Analysen mit den zyklonukleotidbindenden Proteinen PKA Typ I und II, hPKGIβ und Epac 1 und 2 konnte gezeigt werden, dass 7-CH-cAMP die höchsten Affinitäten für die drei Isoformen der HCN Kanäle aufwies. Somit könnte sich 7-CH-cAMP als vielversprechender Kandidat für die selektive Regulation von HCN Kanälen in vitro und in lebenden Zellen eignen und möglicherweise einen wichtigen Beitrag als krankheitsrelevanter Effektor leisten.